Высокопроизводительная ДНК плазменный мультиплексирование и трансфекция с использованием акустической технологии нанодозирования

Этот протокол описывает высокопроизводительную плазмидную трансфекцию клеток млекопитающих в 384-хорошую пластину с использованием акустической технологии выброса капель. Трудоемкий, подверженный ошибкам раздавливание ДНК и мультиплексирование, а также дозирование реагентов трансфекционного реагента, являются программным обеспечением и выполняются нанодайзером. Клетки затем посеяны в этих предварительно заполненных скважин.

Трансфекция клеток, незаменимая для многих биологических исследований, требует контроля многих параметров для точного и успешного достижения. Чаще всего выполняется при низкой пропускной их, это к тому же трудоемкие и подверженные ошибкам, тем более при мультиплексации нескольких плазмидов. Мы разработали простой, быстрый и точный метод для выполнения трансфекции клеток в 384-хорошо макет пластины с использованием акустических капель катапульты (ADE) технологии. Устройство nanodispenser используемое в этом изучении основано на этой технологии и позволяет точно поставку nanovolume на высокой скорости от плиты скважины источника к назначению одному. Он может обойтись и мультиплекс ДНК и трансфекционного реагента в соответствии с заранее разработанной таблицы. Здесь мы представляем оптимальный протокол для выполнения ADE основе высокой пропускной способностью плазмидтранса, что позволяет достичь эффективности до 90% и почти 100% котрансфекции в котрансфекционных экспериментов. Мы расширяем первоначальную работу, предлагая удобный для пользователя макрос на основе электронных таблиц, способный управлять до четырех плазмидов/колодцев из библиотеки, содержащей до 1536 различных плазмидов, и приложения для планшетного нахлыстое направляющее приложение. Макрос разрабатывает необходимый шаблон (ы) исходной пластины (ы) и генерирует готовые к использованию файлы для нанодайзера и планшетного приложения. Четырехэтапный протокол трансфекции включает в себя i) разбавитель обойтись с классическим жидким обработчиком, ii) плазмидное распределение и мультиплексирование, iii) трансфекционный реагент распределяется нанодсером, и iv) клеточное покрытие на предварительно заполненных скважинах. Описанный программно-основанный контроль мультиплексирования и трансфекции Плазмидных плазмидных aDE позволяет даже неспециалистам в полевых условиях быстро и безопасно выполнять надежную трансфекцию клеток. Этот метод позволяет быстро определить оптимальные настройки для данного типа ячейки и может быть перенесен на более высокие и ручные подходы. Протокол облегчает применение, такие как человеческий белок ORFeome (набор открытых кадров чтения в геноме) или CRISPR-Cas9 на основе генной функции проверки, в непулированных стратегий скрининга.

Представленный здесь метод подробно описывает, как выполнять мультиплексирование и трансфекцию ДНК в клетках млекопитающих при высокой пропускной состоянии с помощью жидкого нанодайзера на основе акустической системы в 384-хорошей пластине, даже для неспециалистов в этой области. Этот недавно опубликованный метод¹ позволяет выполнять столько, сколько 384 независимых плазмидных мультиплексирования ДНК и трансфекции условиях в одном эксперименте, менее чем за 1 ч. Одиночные или котрансфекционные эксперименты были успешными, достигнув почти 100% котрансфекция в популяции трансинфицированных клеток. Этот протокол упрощает трансфекцию, поскольку большинство утомительных, трудоемких и подверженных ошибкам шагов теперь ориентированы на программное обеспечение (см. рисунок 1 для общего обзора). Были предприняты дальнейшие усилия по разработке специализированных инструментов для повышения простоты использования при одновременном предотвращении человеческих ошибок в ходе общего процесса и содействия успешному трансфекции даже для неспециалистов в этой области. Описанный протокол включает в себя "удобную" макротаблицу, которую мы разработали для управления 384 независимыми трансфекционными условиями с мультиплексированием возможностей до четырех плазмидов в каждой скважине. Макрос автоматически генерирует шаблоны исходной пластины (ы) для загрузки ожидаемого объема плазмидной плазмы ДНК от стартовых фондовых решений и файлов, необходимых для привода программного обеспечения нанодайзера на экспериментальной конструкции, которая была введена. Поскольку ручная раздача ДНК в 384-хорошо источник пластины утомительно и подвержены ошибкам, мы также разработали специальное приложение на основе таблетки для руководства пользователя при распределении решения ДНК в соответствии с шаблоном.

Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. Схематическое представление оптимального автоматизированного протокола обратного трансфекции высокой пропускной связи (от экспериментального проектирования до пользовательского биологического асссе). Ручные шаги указаны символом руки, а приблизительное время для каждого шага написано в красной коробке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Многие клеточные эксперименты начинаются с плазмидной трансфекции ДНК, и даже если многие выделенные реагенты были и все еще разрабатываются для повышения эффективности трансфекции и / или облегчить процедуру, многое еще предстоит сделать^{2,3 , 4}. Трансфекция плазмидных клеток ДНК включает в себя несколько шагов для достижения высокой эффективности, таких как начальное комплексное поглощение, эндосомальный побег и цитоплазмический перенос к ядру^5,6. В дополнение к выпасам кальция или физическим методам, таким как электропорация или микроинъекция с использованием специальных устройств⁷, современные химические методы были сосредоточены на повышении доставки клеток ДНК при снижении цитоксичности клеток^{8, 9}. Использование липидов или катионных полимеров, образующих липосомы-подобные комплексы, а в последнее время нелипсоомальные полимерные химические системы сделали трансфекцию проще и эффективнее^10. Несмотря на эти изменения, трансфекция клеток по-прежнему требует конкретных навыков, которые должны быть точно выполнены, поскольку большинство из этих физических или химических протоколов трансфекции требуют, чтобы ученые вручную подготовить каждое состояние реакции трансфекции ДНК, таким образом ухудшает пропускную выливку. Чтобы обойти эту проблему, обратные протоколы трансфекции были разработаны с использованием химических реагентов трансфекции^11,12,13, что позволяет пользователю проверить или объединить несколько плазмидов в более быстрый способ. В этих протоколах перед посевом клеток на комплексах образуются нуклеиновые кислотные комплексы с трансфекционными реагентами. Однако эти обратные протоколы по-прежнему ограничены ручным управлением решениями ДНК и сочетанием каждого из независимых условий. Хотя это возможно, чтобы выполнить их в 96-ну хорошо пластины формате, подготовка ДНК и дозы будет утомительным, и там, вероятно, будут ошибки. Когда требуется различное количество нескольких плазмидов ДНК и мультиплексируется друг с другом, трансфекция клеток становится еще более трудной и более трудоемкой, и человеческие ошибки становятся совершенно неизбежными. Масштабирование до 384-колодцевого формата пластин в обратном подходе трансфекции, несмотря на несколько мультиплексированных условий трансфекции ДНК, становится невозможной задачей из-за следующих причин. i) Объемы ДНК, трансфективный реагент или объемы реакционной смеси для управления ниже, чем 1 КЛ для каждой скважины. ii) Мультиплексирование плазмидов для 384 независимых условий становится чрезвычайно сложным. Поставка в каждой из 384 скважин также iii) очень трудоемкие и iv) ошибка подвержена. Действительно, выдать правильное решение в ожидаемых скважинах трудно управлять, потому что низкие объемы уже обойтись не позволяют визуального мониторинга между пустыми и уже заполненными скважинами. v) Наконец, существует высокий риск высыхания смеси путем испарения до добавления клеток в связи со временем, необходимым для выполнения необходимых мер по дозированию. Таким образом, ограничивающим фактором для создания высокой пропускной днк плазмидных трансфекционных анализов, как представляется, миниатюризация анализа, который подразумевает малообъемный мультиплексирование и управление, которые не могут быть обработаны вручную больше, но также вряд ли достижимы в надежным способом классическими перистатическими жидкими обработчиками.

В качестве доказательства сложности автоматизировать такие assays и получить высокую пропускную стоимость, только несколько попыток автоматизировать трансфекции были опубликованы до сих пор: 96-ну хорошо пластины формат с использованием коммерческого устройства обработки жидкости и фосфата кальция осадков¹⁴ и, совсем недавно, липоплексрей, и микрофлюидный чип, позволяющий 280 независимых трансфекций^15, но требующих специальных навыков в этой области. Другой метод, акоутофорез, позволяющий жидкой левитации и ведущих к жидкости манипуляции и смешивания, был использован для выполнения трансфекции ДНК в 24-96-ну хорошо пластины форматов¹⁶. Хотя этот подход является осуществимым, он страдает от крайне низкой пропускной всей перевалки, поскольку смешивание клеток с трансфекционной смесью ДНК требует инкубации 60 с для каждой точки перед посевом. Это означает продолжительность не менее 96 мин для полной 96-колодца пластины. Кроме того, этот протокол далек от того, чтобы поддаваться общей аудитории биологов, как эта работа была сделана с в доме разработан и изготовлены устройства, которые в настоящее время не доступны на рынке. Напротив, в последние несколько лет с помощью нанообъемных диспенсеров появилась простая в использовании технология акустического дозирования на основе программного обеспечения. Используя сфокусированную акустическую энергию, эти устройства позволяют жестко контролируемый выброс небольших объемов жидкости от 2,5 нл до 500 нл от исходной пластины до пункта назначения^17. Эта технология, называемая акустической выкатывания капель (ADE), имеет множество преимуществ: она полностью автоматизирована, бесконтактная, без кончиков, точная, точная и высоко воспроизводимая, и имеет высокую пропускную связь¹⁸. Первый посвященный доставке диметилсульксида (DMSO) решения, настройки были расширены, чтобы обойтись aqueous буферов¹⁹. Таким образом, акустические нанодятелы, кажется, подходят для протоколов трансфекции обратных клеток и могут обойти большинство вышеупомянутых ручных ограничений. Поскольку с помощью этой технологии не было описано никаких попыток трансфекции плазмидных трансфекций, мы недавно оценили пригодность акустической системы дозирования для выполнения обратного трансфекции клеток.

Воспользовавшись пропускной стоимостью нанодчебирования и простотой использования, мы оптимизировали обратный протокол трансфекции для клеток HeLa путем перекрестного тестирования нескольких параметров, которые могут влиять на трансфекцию ДНК на 384-ну, одной пластине, а именно, общее количество ДНК и источник концентрации ДНК, разбавитель, трансфекционный реагент, и количество спреда клеток. Разработанный протокол обходит вышеописанные ручные ограничения трансфекции клеток и предоставляет ряд преимуществ по сравнению с другими автоматизированными попытками трансфекции. Во-первых, он миниатюризирован, что позволяет экономически эффективным трансфекционным реагентом, экономя препараты плазмида ДНК и трансфекционный реагент. Во-вторых, он гораздо более высокопроизводительен и воспроизводим, чем ручной протокол (даже для начинающих), так как трансфекция всей 384-й пластины может быть достигнута менее чем за 1 ч. Наконец, это программное обеспечение, что позволяет контролировать дозированных количество ДНК и мультиплексирования нескольких плазмидов. Действительно, благодаря программному обеспечению nanodispenser(Таблица материалов), пользователь может разработать план исследования для управления объемами, которые будут освобождены от определенного источника хорошо пластины назначения один.

Представленный здесь протокол предназначен в основном для тех, кто имеет доступ к нанодционизму и хотел бы создать трансфекционные эксперименты с высокой пропускной их пропускной вот и доступной, но также и для тех, кто хочет быстро оптимизировать свои параметры трансфекции для данного типа клеток применение этого протокола для перекрестного тестирования нескольких параметров при высокой пропускной состоянии. Действительно, мы показали, что оптимизированные параметры, идентифицированные с этим наномасштабным протоколом, могут быть перенесены в более масштабные и ручные трансфекционные эксперименты. Наконец, поскольку трансфекционный реагент, используемый в настоящем протоколе, позволяет трансфекцию ДНК или siRNA в соответствии с производителем, протокол также представляет интерес для тех, кто стремится к выполнению комплексных подходов к переэкспрессии генов или нокдауну. Назначения пластины предварительно заполнены ДНК могут быть сохранены до 7 дней до использования в трансфекционном анализе без потери эффективности, которая является еще одним преимуществом следующего протокола для такого рода применения.

1. Предварительная подготовка

1. Подготовка программ перистальтических жидкостных обработок
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавитель ныхивательных и клеточных этапов протокола должна быть подготовлена специальная программа с учетом высоты дозирующей головки к используемой пластине и намерения шага.
   1. Для шага разбавителя с 1 злицы установите кассету номиналу 1 л и подготовьте программу с настройками, описанными в шагах 1.1.1.1 и 1.1.1.2.
      1. Отрегулируйте параметр скорости потока до максимума для лучшей пропускной связи, так как на этом этапе не ожидается никакого биологического материального ущерба. Отрегулируйте высоту дозировки до 9,6 мм (в соответствии с используемой пластиной культуры клеток, Дополнительная рисунок 1), чтобы 1 л капли коснуться нижней части скважин во время диспенсации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать удержания капель на дозирующей головке до достижения достаточного объема, чтобы упасть.
      2. Отрегулируйте прозрачую высоту пластины до 14,4 мм, чтобы после раздавливания каждого ряда можно было свободно перемусливаться головой над плитой. Визуально контролировать надлежащие настройки перистальтической жидкости обработчик головы высоты: убедитесь, что не капли сохраняются на дозирования советы при распределении и убедитесь, что голова достаточно высока, чтобы сделать смещение головы после дозирования каждого ряда.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегая удержания капли является важным параметром, поскольку это ухудшит точность объема диспенсации.
   2. Для раздавливания 40-л суспензии ячейки, смонтировать кассету 10 л и подготовить программу с настройками, как описано в шагах 1.1.1.1.1.2.2.
      1. Отрегулируйте параметр скорости потока до Low, чтобы обойтись без клеток с низкой скоростью, чтобы избежать потенциального повреждения клеток сдвига стрессом и высоким воздействием на дно скважин. Отрегулируйте высоту диспенсации до 11.43 мм (в соответствии с используемой пластиной культуры клеток, Дополнительная рисунок1), достаточно высокая, чтобы снизить воздействие клеток на дно скважин во время процесса дозирования, но достаточно низко, чтобы избежать удержания капель на дозирования головы. Отрегулируйте плиту ясной высоты до 16 мм, чтобы позволить свободное смещение дозирующей головы над пластиной после дозирования каждого ряда.
      2. Визуально контролировать надлежащие настройки перистальтической жидкости обработчик головы высоты: убедитесь, что не капли сохраняются на дозирования советы при распределении и убедитесь, что голова достаточно высока, чтобы сделать смещение головы после дозирования каждого ряда.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегая удержания капли является важным параметром, поскольку это приведет к распределению ненадежного номера ячейки.
2. Препарат плазмида ДНК (классический протокол экстракции мини-подготовки)
   1. Выращивайте преобразуемый штамм бактерий DH5 в среде LB, дополненный 125 мкг/мл антибиотиком выбора ампициллин (ТаблицаМатериалов) на ночь при 37 градусах Цельсия и под нежным возбуждением (200 об/мин) на орбитальном шейкере (Таблицаматериалов).
   2. Урожай 2 мл культуры, гранулы клетки центрифуги в течение 5 мин на 6000 х г, и отбросить супернатанта.
   3. Приостановите действие клеточной гранулы с 250 злиц буфера, содержащего RNase A(Таблица материалов). Добавьте 250 л люсис-буфера и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, в соответствии с инструкциями производителя.
   4. Остановите реакцию лизиса, добавив 300 йЛ буфера нейтрализации(Таблицаматериалов) и vortexting в ближайшее время. Центрифуга трубки в течение 5 мин на 11000 х г.
   5. Поместите новую плазмидную мини-колонну(Таблицаматериалов) в трубку коллекции 2 мл и декантирует супернатант в колонке центрифугией в течение 1 мин при 11 000 х г.
   6. Отбросьте поток через и поместите мини-колонку обратно в трубку сбора.
   7. Вымойте плазмидную миниколонку с 500 злителка юаня буфера(таблицаматериалов) и центрифугу в течение 1 мин при 11000 х г, в соответствии с инструкциями производителя.
   8. Отбросьте поток через и поместите плазмидную миниколонку обратно в трубку коллекции.
   9. Добавьте 700 л стирального буфера(Таблицаматериалов), дополненного этанолом и центрифугой в течение 1 мин при 11 000 х г, в соответствии с инструкциями производителя.
   10. Отбросьте поток через и центрифуги плазмид мини-колонны и его сбора трубки 1x больше в течение 2 мин на 11000 х г, чтобы высушить мембрану кремнезема.
   11. Поместите высушенную плазмидную миниколонку в новую трубку 1,5 мл и добавьте 30 л дистиллированной воды, предварительно разогретой при температуре 60 градусов по Цельсию, нависните на 2 мин при комнатной температуре, а затем центрифугите его в течение 1 мин при 11 000 х г.
   12. Откажитесь от плазмидной миниколонки и держите элюат, содержащий очищенную плазмиду ДНК.
   13. Измерьте концентрацию ДНК элутированной ДНК с помощью микротомного спектрофотометра(Таблицаматериалов).
       1. Включите спектрофотометр и выберите параметры измерения ДНК.
       2. Поднимите руку выборки спектрофотометра и пипетки 1 л воды на пьедестал измерения для выполнения пустой калибровки.
       3. Опустите руку выборки, начните пустое измерение и дождитесь завершения.
       4. Поднимите руку выборки и протрите образец с верхних и нижних пьедесталах.
       5. Пипетка 1 злициста раствора ДНК на нижний пьедестал для его измерения.
       6. Опустите руку выборки, начните измерение концентрации ДНК и дождитесь завершения.
       7. Поднимите руку выборки и протрите образец с верхних и нижних пьедесталах.
       8. Для дальнейших измерений концентрации ДНК повторите шаги 1.2.13.5-1.2.13.7.
   14. После завершения измерений храните решения ДНК при температуре 4 градусов по Цельсию до использования.

2. Экспериментальный дизайн и генерация пиклистов для управления диспенсами на основе ADE

ПРИМЕЧАНИЕ: Для управления объемами ДНК и смешивания до четырех плазмидов в формате 384 колодца был разработан специальный макрос электронной таблицы. Основываясь на введенном экспериментальном дизайне, этот макрос генерирует необходимые файлы для управления протоколом трансфекции ДНК на основе ADE с помощью нанодайзера. Для того, чтобы создать эти файлы, несколько полей должны быть заполнены в листе шаблонов, как показано на рисунке 2.

Рисунок 2 : Поколение списков для управления диспенсацией ADE с помощью макроса электронной таблицы. Несколько параметров должны быть заполнены, а именно :1 ) трансфекционный реагент (TR) и минимальные/максимальные объемы, которые будут использоваться в исходной пластине, (2) первоначальные концентрации плазмида, которые должны быть распределены в исходной пластине, и(3 ) конструкция цельной пластины, включая ожидаемые количества плазмидных и мультиплексирования в каждом из 384 скважин. (4) Активация Picklists позволяет проверить различные поля и, после правильного заполнения, пиклисты для диспенсации ДНК и TR и необходимый шаблон исходной пластины автоматически генерируются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1. Введите параметры протокола нанодчении в розовых полях. Установите значение смеси трансфективного реагента (TR) до 500 нл. Установите минимальное значение объема в исходной пластине до 4 qL. Установите максимальный объем в исходной пластине скважин до 11,25 л.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь нанододознар может передавать не более 500 нл за один запуск ADE. Эти розовые поля заполнены рекомендуемыми значениями, но могут быть изменены в соответствии с потребностями пользователя.
2. Введите 100 нг / Л концентрации ДНК, начиная концентрации в синих полях, соответствующих основной ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение является оптимальной концентрацией, ранее определяемой, но может, однако, быть изменено для различных потребностей пользователя.
3. Введите желаемое количество ДНК в серых/зеленых полях. Введите количества и плазмидные названия для 384 скважин, обеспечивая то же правописания, если тот же плазмид используется в нескольких скважинах.
4. Создайте дизайн исходной пластины, файлы picklists и файл руководства по пипетке. Нажмите на Generate Picklists, чтобы позволить макросу генерировать файлы DNA-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv и 384-Wells-Pipetting-Guide.csv из данных, собранных на соответствующем листе. При запросе исправьте значения ячеек, заполненных оранжевым цветом, поскольку они указывают на ошибки или объемы, которые не могут быть обработаны нанодайзером.
5. Печать шаблона (ы) из листа Исходной плиты. Указаны плазмидные названия и минимальный объем для заполнения скважин. Аналогичным образом, объемы смеси трансфекционного реагента, которые затем должны быть заполнены в следующих скважинах, указаны как TR и выделены зеленым цветом.

3. Подготовка пластины источника ДНА используя применение направляющего выступа 384-ну наилучшим образом

1. Разбавить хранящуюся плазмид ДНК со ступени 1.2.14 до 100 нг/Л с помощью дистиллированной воды.
2. Калибровать 384-колодец сетки на пластины размеров: открыть 384-колодец пипеттинг направляющий приложение на планшете (Рисунок 3). Поместите исходную пластину на сетку на нижнем экране, а в верхнем левом меню калибровки, нажмите кнопку или - (или использовать красный курсор) для повышения или уменьшения размера сетки и колодцев для того, чтобы настроить зеленые колодцы на четыре угловых колодца пластины .

Рисунок 3 : Использование приложения направляющих направляющих 384 колодца. (1) Калибровка 384-колодца сетки до размера пластины; (2) ) Гора универсального 3D-печатного адаптера пластины к планшету с помощью двусторонней ленты; (3) Размещение пластины на адаптере; (4) Перемещение сетки, чтобы центр его на установленную пластину. (5) Блокировка шага калибровки. (6) Открытие 384 скважин pipetting guide.csv файл. (7) Учитывая список файлов, приложение будет указывать ожидаемое название исходной пластины, реагент (ДНК или трансфекционный реагент), концентрацию и объем для раздачи в целевые скважины, которые будут освещены один за 1. (8) Левая и правая кнопки стрелки позволяют пользователю следовать пипетки руководство легко распределять реагенты в соответствии с электронной таблицей макро шаблон амплитуды (ы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Используя двусторонню ленту, установите 3D-печатный адаптер пластины на экране, чтобы избежать движения исходной пластины при распределении. При необходимости переместите калиброванную сетку, используя стрелки вращения и кнопки Вверх/Вниз/Левая, чтобы настроить сетку на экране в положение пластины. После того, как сетка и размеры скважин правильно откалиброваны и расположены, отметьте калибровку lock.
4. Нажмите на FILE и откройте 384 скважины pipetting guide.csv файл. Следуйте инструкциям экрана вручную распределять указанный объем указанной плазмиды при указанной концентрации в белом выделенном хорошо соответствующем надлежащему целевому назначению ожидаемой пластины. Используйте - или стрелки, чтобы вернуться или дальше в процессе дозирования ДНК. Прекратите дозирование при достижении первого раствора реагента Трансфекции для загрузки.
5. Как только диспенсации ДНК закончены, удалите исходную пластину из адаптера. Если несколько исходных пластин должны быть заполнены, то поместите новую пластину источника на адаптер и следуйте инструкциям дозирования. После того, как диспенсация ДНК закончена, центрифуга ДНК заполненные источник пластины (ы) (на 1500 х г в течение 2 мин), чтобы обеспечить надлежащее выравнивание жидкости и удалить пузырьки, ведущие к неточности в ADE основе передач.

4. Перистальтический жидкий обработчик на основе 1 л разбавитель диспенсации в пункт назначения пластины

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 4.1-4.5 в шкафе биологической безопасности.

1. Дезинфицировать 1 л кассеты голову, распыляя его с распылителем дезинфицирующее средство(Таблица материалов), и позволяют этому решению, чтобы войти в наконечник держателя. Поглотить остатки дезинфицирующего средства на поглощающей бумаге. Установите кассету 1 зл на перистальтическое устройство обработчика жидкости. Включите устройство и убедитесь, что параметр типа кассеты является правильным (1 зл), а также формат пластины (384 скважины).
2. Дезинфекция всего просвета труб: вставьте трубку организатора (держа восемь труб вместе) в стерильный сосуд и заполнить его с 5 мл 70% алкоголя. Используя первоздавую функцию перистальтической жидкости обработчик, сначала промыть спирт в трубке, а затем промыть его, пройдя 5 мл дистиллированной воды и 5 мл сыворотки свободной среды (Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем "DMEM" дополняется 100 U /mL пенициллин-стрептомицин; ТаблицаМатериала), последовательно заполняя в одном и том же сосуде. Убедитесь, что ни один из кончик засоряется путем визуального осмотра потока жидкости из всех из них.
3. Прайм трубки с сыворотки свободной среде, заполнив новый стерильный сосуд с 10 мл прегретой сыворотки свободной среды и дайвинг трубки организатора в нем. Нажмите на кнопку перистальтики жидкости обработчик около 10 с. Еще раз, убедитесь, что не кончик засоряется путем визуального осмотра потока жидкости из всех из них.
4. Заполните тарелку 1 л разбавитель. Поместите стерильную 384-хорошую культурную пластину (направление) на перистальтический жидкий обработчик пластины перевозчика и удалить его крышку.
5. Запустите предварительно калиброванные программы, чтобы обойтись 1 Л л в каждой скважине из 384-хорошо пластины. Время дозирования составляет около 8 с. Затем замените крышку 384-хорошо пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, этот шаг может быть обработан вручную, в шкафу безопасности, используя многоканальный микропипетли.

5. Проведение обследования для управления объемами, выданными вручную

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации, см. Рисунок 4.

1. Запустите программу нанодайзера, перейдите к диагностической вкладке, отметьте исходную пластину Out Box, загрузите исходную пластину на держатель пластины и зайдите в тарелку, чтобы войти в тарелку. При запросе выберите 384LDV-A-B2, чтобы настроить нанододознат в режим раздавливания буфера, и нажмите Ok.
2. Выберите Опрос в меню «Разное» и нажмите на Launch. Выберите заполненные скважины для анализа и нажмите на кнопку Go. Убедитесь, что измеренные объемы соответствуют ожидаемым, и убедитесь, что скважины не были загружены с объемами более 12 Зл, так как это позволит избежать передачи.

Рисунок 4 : Определение параметров программного обеспечения для обследования. (1) Запуск программы наноддазатора. (2) Откройте вкладку Диагностика. (3) Вставьте исходную пластину, тикая для исходной пластины, а затем, В. (4) Определите тип исходной тарелки в меню, когда это вызвано. (5) В разное поле выберите Обзор в выпадающем меню. (6) Запуск программы обследования, нажав на запуск. (7) Выберите заполненные скважины для измерения. (8) Начните анализ, нажав на Go. (9) После проведения обследования измеренные объемы записываются в соответствующие выбранные скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6. Диспенсация ДНК на основе АДЕ в пункт назначения

1. Запустите программное обеспечение для выбора, установите 384-ну хорошо источник и назначения типа пластины 384-LDV и Greiner 384PS-781096, соответственно(Рисунок 5). Установите устройство в режим раздавливания буфера, выбрав 384LDV-A-B2и отключите "оптимизацию пропускной перевалки".

Рисунок 5 : Производительность диспенсации на основе выбора. (1) Запуск программного обеспечения нанодчении. Во вкладке Протокола выберите (2) формат пластины образца, (3)тип пластины назначения и (4)отсетики "оптимизировать пропускную стоимость передачи". (5) Выберите вкладку Список выбора. (6) Нажмите на импорт и выберите правильный файл q.csv (DNA-PickList или T.R.-Picklist). (7) После выбора, нажмите на импорт. (8) Нажмите на воспроизведение и сохранить протокол. (9) Выполните моделирование диспенсации, нажав на Имитацию, или ( 10 ) Начать запрограммированное диспенсацию, нажав на Run. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Выберите вкладку "Список пик", нажмите на импорт, выберите файл DNA-Picklist.csv. Нажмите на воспроизведение и сохраните протокол. Нажмите на Simulate, чтобы выполнить моделирование запрограммированных диспенсаций, чтобы убедиться, что список соответствует ожидаемому экспериментальному дизайну. После завершения, нажмите на Закрыть.
3. Нажмите на Play, а затем запустить, чтобы начать программу дозирования: когда его спросили, вставьте запрошенную пластину источника (ДНК решения вручную заполнены) и назначения пластины (разбавленной заполнены) в нанодспенсер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время дозирования составляет примерно 5-20 минут для полной 384-хорошо пластины, в зависимости от выбранных объемов и общее количество диспенсаций в экспериментальном дизайне.
4. Кроме того, приостановить протокол здесь, как разбавитель- и ДНК заполненные пластины могут обрабатывать сухой или замороженный хранения на срок до 7 дней. Для сухого хранения, пусть пластины высохнуть на скамейке при комнатной температуре, а затем хранить их таким же образом. Оттепель и центрифуга (при 1500 х г в течение 2 мин) замороженные хранимые пластины перед использованием в шаге трансфекции (раздел 7).
    

7. Диспенсация трансфективных реагентов, управляемых ADE

1. В шкафу биобезопасности, extemporaneously разбавляют реагент трансфекционного липополиплакса в сывороточной среде до 1x окончательной концентрации. Vortex и немедленно обойтись этой трансфекционной реагента смесь в соответствии с предопределенным источником пластины (ы), разработанный макро с использованием предварительно калиброванных 384-колодец пипеттинг руководство приложение, как описано в шаге 3.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифуги исходной пластины, как только он загружается с реагентом, как не трансфекция замечена после центрифугирования.
2. Запустите программу нанодчебирования для выполнения «обследования», как описано в разделе 5, для того, чтобы контролировать объемы всех заполненных вручную ТРУБ TR исходной пластины (ы), чтобы избежать ошибок дозирования из-за объемов, превышающих 12 Зл.
3. Нажмите на reset, чтобы очистить список образцов списка ДНК в программном обеспечении picklist, и убедитесь, что параметры устройства по-прежнему настроены на водные буферы и типы исходных и назначения, используемые, как в шаге 6.1.
4. Нажмите на импорт и выберите файл TR-Picklist.csv. Нажмите на Play и сохранить протокол, если предложено, и (это необязательно, но настоятельно рекомендуется) выполнить моделирование запрограммированных трансфекционных реагента распределения смеси для обеспечения надлежащего проектирования диспенсаций, нажав на Кнопка имитации. После завершения, нажмите на Закрыть.
5. Нажмите на кнопку Play , а затем запустите кнопку, чтобы начать программу дозирования: по запросу, поместите исходную пластину (s) (TR-смесь заполнены) и назначения пластины (разбавитель и ДНК-заполненные) в нанодчене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время дозирования составляет менее 20 минут для полной 384-хорошо пластины при распределении 500 нл смеси TR.
6. Инкубировать 15-30 мин при комнатной температуре после добавления TR в ДНК, как указано в протоколе производителя.

8. Перистальтический обработчик жидкости на основе клеточного диспенсации

1. Подготовьте перистальтический жидкий обработчик для раздавливания клеток. Дезинфицировать 10 л кассеты голову, распыляя его с Aniospray Surf 29 дезинфицирующее средство и поглощая остатки на бумаге. Установите кассету на перистальтический жидкий обработчик устройства, изменить настройки типа кассеты до 10 qL, и убедитесь, что формат пластины установлен на 384 скважин.
2. Дезинфекция 10 л кассетных труб, как это было описано ранее в шаге 4.2. Погружение трубки организатора в стерильный сосуд и промыть трубки с 5 мл 70% алкоголя, затем с 5 мл дистиллированной воды, и, наконец, с 5 мл сыворотки свободной среде, последовательно заполнены в том же сосуде и до тех пор, пока каждая трубка пуста.
3. Подготовьте суспензию клетки для того чтобы dispense. Из сопливого HeLa ячейки B10-культуры блюдо, мыть клетки 1x с 1x фосфат-буфера солей (PBS) раствор, а затем разъединить клетки с трипсином / EDTA в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию.
4. Проверьте диссоциацию клеток под микроскопом и остановите действие трипсина/ЭДТА, добавив 10 мл полной среды (DMEM, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода и 100 U/mL пенициллина-стрептомицина; см. Таблицу Материала) в блюде культуры. Урожай клетки в 50 мл трубки и рассчитывать клетки под микроскопом, используя клетку Malassez или автоматический счетчик клеток.
5. Подготовьте не менее 25 мл клеточной подвески HeLa при концентрации 37 500 клеток/мл в полной среде (т.е. 1500 ячеек/40 л) для полной 384-хорошей пластины, чтобы обеспечить грунтовку трубки и 40 л/ну диспансеризации.
6. Чтобы распределить клетки, заполните новый стерильный сосуд с подготовленной клеточной подвеской и перемешайте его, чтобы избежать осадки, ведущие к неточности в плотности клеток диспенсации. Вставьте организатора трубки в этом растворе и нажмите кнопку Prime до тех пор, пока подвеска ячейки не начнет промывать от дозирующей головы. Убедитесь, что ни один из кончик засоряется путем визуального осмотра потока жидкости из всех из них, и убедитесь, что каждая трубка загружается с клеточной подвеской.
7. Загрузите ДНК и TR-заполненные 384-ну хорошо назначения пластины на перистальтический жидкости обработчик пластины перевозчика и удалить его крышку. Запустите предварительно калиброванные программы, чтобы обойтись 40 л клеточной подвески на полной 384-хорошо пластины (т.е., 1500 клеток / хорошо). Время дозирования составляет около 8 с. Заменить крышку 384-колодца пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 40 л клеточной подвески можно вручную обойтись с помощью многоканального микропипетля.

9. Пользовательский биологический контроль (мониторинг эффективности трансфекции клеток)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя экспериментальным настройкам и намерениям эксперимента, используйте необходимые методы для люминесценции, флуоресценции, скрининга высокого содержания и обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). В этом разделе протокола эффективность трансфекции клеток оценивается с помощью автоматизированной флуоресценционной микроскопии и анализа изображений.

1. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия с 5% CO₂ в насыщенной водой атмосфере и до правильного выражения белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, 48 ч инкубации время используется для клеток HeLa для мониторинга эффективности трансфекции, используя tdTomato- и mVenus-выражения плазмиды.
2. Удалите среду культуры 48 ч после трансфекции путем инвертирования пластины, добавьте 30 л/также 10% формалина с помощью перистальтической жидкой обработчика (10 qL кассеты), и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Удалите формалин, инвертируя пластину; затем, инкубировать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре с 0,1 нг /мл Hoechst разбавленной в 1x PBS растворе.
4. Вымойте клетки 3x в течение 15 минут с 80 qL 1x PBS скорректированы до рН No 8 для того, чтобы восстановить сигнал высокой флуоресценции потеряли 6,9 рН формелин раствор инкубации шаг.
5. Используя автоматизированный флуоресцентный микроскоп, приобретайте изображения двух или трех флуоресцентных каналов (Hoechst, tdTomato, и mVenus) последовательно с 10x целями и надлежащим набором фильтров выбросов (4',6-diamidino-2-penylindole ,DAPI), dsRed и флуоресценсея изотиоцианат (FITC) соответственно).
6. Для оценки эффективности трансфекции используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения эффективности трансфекции с помощью анализа скриптов на основе окрашивания ядер.

f Для того, чтобы определить, может ли технология ADE быть использована для автоматизированного протокола обратного трансфекции, мы отслеживали эффективность трансфекции клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, используя красный флуоресцентный tdTomato, выражающий плазмид. Сначала были перепроверены лучшие параметры трансфекции, различные разбавительные объемы и общее количество ДНК. Объем разбавленного объема использовался для того, чтобы капли ДНК, когда-то отпускаемые по всем скважинам, распространялись по всем скважинам, чтобы обойти неоднородное трансфекцию, наблюдаемое в предварительных экспериментах (т.е. только в центре скважин). Как показано на рисунке 6A, трансфекция клеток HeLa с помощью липополипрекс реагента²⁰ был успешным. Интересно, что с помощью 1 л разбавитель объем, количество ДНК в диапазоне от 5 до 30 нг показал ту же эффективность и до 90% трансфекции клеток по сравнению с более высокими количествами, такими как 50 и 100 нг, для которых резкое снижение наблюдалось. Мы попробовали различные разбавители объемы, начиная от 15 nL до 4 QL и определены 1 Л, чтобы быть лучшим условием, как значительно иллюстрируется здесь с помощью 30 нг ДНК.

Рисунок 6 : Представитель результаты. (A) Влияние количества ДНК и разбавивого объема на эффективность трансфекции. Клетки HeLa были перевернуты с помощью нанодайзера и липополиплекса, используя концентрацию в 1 раз, как это рекомендовано производителем. Из рекомендуемого разбавителя (безсыворотки среды), 15-4000 нл был использован с 10-100 нг количество красно-флуоресцентно-выражения плазмиды (tdTomato). Эффективность трансфекции была определена 48 ч после трансфекции с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Результаты выражаются в процентах от транс-инфицированных клеток для увеличения количества ДНК, и разбавитель объем показывает оптимальные условия: 30 нг общего объема ДНК с увеличением объема разбавителей и 1 Зл разбавителей с увеличением количества ДНК. Бары ошибок представляют SEM с n No 4. Для статистического анализа использовались двусторонние ANOVA и Bonferroni после тестирования. р-р злт; 0,05 по сравнению с другими точками. (B) Стабильность подготовленных пластин ДНК. Разбавитель (1 кЛ) был освобожден с помощью перистальтической жидкости обработчик, и 30 нг ДНК был освобожден и сразу же трансфицируется с помощью липополипрекс реагента обойтись ADE (контроль) или либо хранится при комнатной температуре, как только сухой или замороженный при -20 градусов по Цельсию. В дни 0, 2 или 7 сухая ДНК была увлажнена с 1 зл разбавителя, отпускаемого с использованием перистальтической жидкости обработчика, а замороженные пластины размораживались при комнатной температуре и центрифугировали (при 1500 х г в течение 2 мин). Клетки затем были посеяны с помощью перистальтической жидкой обработчик в соответствии с описанным протоколом. Бары ошибок представляют SEM с n No 3. Для статистического анализа использовались двусторонние ANOVA и Bonferroni после тестирования. ns - незначительно разные. (C) Плазмид ДНК котрансфекции эффективности. Клетки HeLa были трансфицированы с 30 нг mVenus- и tdTomato-expressing плазмид загружены в двух отдельных скважин источника (с использованием 1,7 соотношение mVenus над tdTomato для того, чтобы выровнять их относительную флуоресценцию выход). Эффективность трансфекции сравнивалась с 48 ч после трансфекции с использованием программного обеспечения для анализа изображений и выражалась в процентах трансинфицированных клеток и в процентах котрансинфицированных клеток в трансинфицированной популяции. Процент котрансинфицированных клеток определялся путем расчета зеленого флуоресцентного количества клеток в красных флуоресцентных популяционных клетках. Бары ошибок представляют SEM с n No 3. Для статистического анализа использовались двусторонние ANOVA и Bonferroni после тестирования. ns - незначительно разные. (D) Представитель поля флуоресценции микроскопии от приобретения изображения показано в панели C с использованием трех флуоресцентных каналов (Hoechst, tdTomato, и mVenus) последовательно приобретенных изображений платформы (Таблица материалов ), используя 10x целей и надлежащий набор фильтров выбросов (DAPI, dsRed, и FITC, соответственно). Эта цифра была изменена от Колин и др.¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Для дальнейшего увеличения пропускной связи этого протокола, мы затем рассмотрели, если источник пластины хранения предварительно заполнены ДНК и разбавителей решений могут быть сохранены и использованы на более позднем этапе. Были протестированы два способа эффективного хранения ДНК, а именно сухое хранение пластины, дав ей высохнуть на скамейке или замороженному хранению (при -20 градусов). Оба метода хранения не привели к значительно отличавшимся результатам, чем свежевыданный раствор ДНК, хранящийся до 7 дней(рисунок 6B),и оба метода позволили выполнить трансфекцию из хранимых предварительно заполненных пластин ДНК, таких как банк Плазмиды.

Наконец, поскольку плазмидная трансфекция чаще всего происходит с использованием по крайней мере двух различных плазмидов, мы затем изучили способность мультиплексирования ДНК протокола, представленного здесь, используя наилучшие идентифицированные условия (1 Зл разбавитель и 30 нг ДНК). Ранее использованный tdTomato красно-флуоресцентно-белково-выражающий плазмид был модифицирован для выражения mVenus, ярко-желтого флуоресцентного белка, и оба были затем использованы в попытках котрансфекции. Красно- или зелено-флуоресцентно-положительный анализ клеток(рисунок 6C)показал эффективность трансфекции, которая составляет около 80%; однако, в красной популяции, почти 100% клеток были также cotransfected с mVenus-выражения плазмида, как можно увидеть в репрезентативном программном анализе изображения Рисунок 6D.

Дополнительная рисунок 1: Диаграмма, показывающая подходящую высоту дозирования для падения, чтобы коснуться нижней части колодца, чтобы избежать его удержания на кончике дозирования. Слева, надлежащие настройки позволяют падение распространяться на поверхности колодца, избегая его удержания на дозирования советы. Справа плохие настройки приводят к удержанию капель, которые можно наблюдать во время движения головы к следующему сырому. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Создание и оптимизация точного метода трансфекции высокой пропускной связи для данной клеточной линии требует от ученых следовать некоторым ключевым параметрам, описанным в этом разделе. Мы настоятельно рекомендуем начать с рекомендуемых значений во всем протоколе, так как эти параметры, оптимизированные для клеток HeLa, также оказались эффективными для клеток HEK. Однако, поскольку лучшие параметры могут зависеть от клеточных линий и трансфекционных реагентов, оптимальные условия могут быть определены путем изменения числа клеток, объема разбавителя, общего количества ДНК и используемого реагента трансфекции, концентрации или даже объема, используемого как случае во время оптимизации этого протокола для клеток HeLa¹.

Представленный здесь общий протокол был разработан и дополнительно оптимизирован, чтобы позволить трансфекцию клеток даже новичкам в этой области. Для достижения этой цели были разработаны ключевые инструменты для максимального выполнения протокола и избежания человеческих ошибок: удобный для пользователя макрос электронной таблицы для легкого проектирования эксперимента и планшетное приложение для руководства пользователем должным образом заполнить источник пластины (ы).

Таким образом, для обеспечения надежности протокола необходимо контролировать лишь несколько критических шагов: i) надлежащую экспериментальную конструкцию; ii) надлежащее перистальтическое разрешение от классического перистальтического жидких обработчика; iii) надлежащее распределение ДНК и трансфективного реагента на основе акустических систем; iv) избегая центрифугирования исходной пластины до диспенсации трансфекционного реагента, как это, казалось, ухудшает трансфекцию. Следуя этим нескольким рекомендациям, обеспечит эффективную трансфекцию клеток.

Правильный экспериментальный дизайн

Экспериментальная настройка была оказана удобной для пользователей в результате разработки макро таблицы, которая просто должна быть заполнена с ожидаемым названием плазмидов ДНК, желаемое количество, и некоторые ключевые значения параметра. После заполнения макрос сначала анализирует введенные параметры для обнаружения потенциальных ошибок, таких как подходящие минимальные и максимальные объемы, введенные для исходных скважин и объем диспенсации трансфекционного реагента. Кроме того, на основе концентраций ДНК, введенных в каждом из четырех возможных строк, и плазмидного количества, введенного в основные поля, макро проверяет, если ожидаемые объемы, чтобы обойтись, кратны 2,5 нл (объем капель, отпускаемых нанодченего). После проверки любых ошибок макрос вычисляет общее количество каждого образца ДНК, который должен быть распределен, а затем разрабатывает шаблон исходной пластины (путем сортировки имен ДНК в алфавитном порядке). Объемы, указанные в исходной пластине (ы) учитывают рабочие объемы, ожидаемые в источнике хорошо (рассчитанные из минимальных и максимальных значений объема, заполненных в листе шаблона). Все ожидаемые диспенсации ДНК в каждой из скважин затем написаны на листе ДНК-пиклиста. Список ДНК-транс-инфицированных скважин затем используется для записи листа TR-picklist с использованием объема трансфекционного реагента, указанного в листе шаблона. Объемы, рассчитанные на листе исходной пластины, затем передаются на 384-ну колодец направляющий лист. Данные из ДНК-пиклиста, TR-picklist и руководства по трубачке с 384 скважинами затем используются для создания соответствующих файлов в формате q.csv.

Правильная диспенсация ДНК и TR на исходной пластине

Как дозирование на 384-хорошо исходной пластины и, более конкретно, размещение целевой хорошо может способствовать ошибкам и, кроме того, трудоемкие, мы разработали специальное приложение на основе планшета похож на iPipet²¹. В отличие от iPipet, описанный здесь можно использовать с Android (поддерживается только Android-версия 4.4 и вверх). На основе файла 384-Wells-Pipetting-Guide.csv, генерируемого электронной таблицей макро, он помогает пользователю в общем процессе дозирования. В то время как его использование для нескольких диспенсаций не стоит, это может быть интересно сэкономить время и избежать ошибок, если большое количество ДНК и TR диспенсации, как ожидается. Файл .csv должен содержать хорошо, пластину, имя, концентрацию и объем информации. Это приложение может быть использовано для других приложений, таких как раздающиеся решения (реагенты, краситель, соединение и т.д.) в целевой хорошо, в соответствии с пользователем, посвященный csv файл. Кроме того, он позволяет пользователю осветить всю строку или строку, введя соответствующую информацию в столбец целевой скважины, используя этот ожидаемый формат: Row'1 (до 24) или Line'A (до P).

Устранение неприятной эффективности трансфекции клеток

Некоторые параметры, описанные ниже, могут ухудшить трансфекцию клеток в описанном протоколе на основе АДЕ и должны быть индивидуально проверены и обойдены в случае проблем эффективности.

Одним из первых важных параметров трансфекции является качество клеток и плотность, используемая при посеве. Хотя каждый тип ячейки потребует различных параметров, некоторые из них должны соблюдаться, чтобы обеспечить успешную трансфекцию. Прежде всего, клеточная подвеска должна быть подготовлена из подслефывающей пластины, чтобы избежать клеточного стресса перед трансфекцией, и их не следует оставлять лежать на скамейке слишком долго (максимум 2 ч). Во-вторых, плотность посева клеток должна быть достаточно низкой по двум причинам: чтобы избежать клеточных контактов и содействовать высокой поверхности клеток после распространения, но и потому, что активно деления клеток лучше взять иностранную нуклеиловую кислоту^22,23. К сожалению, оптимальная плотность клеток для трансфекции варьируется в зависимости от типов клеток и технологии трансфекции и должна быть определена для каждой линии клеток. Это важнейшие параметры для обеспечения эффективной трансфекции.

Другим важным параметром, который может модулировать трансфекционную эффективность, является прохождение клеток No^24. Действительно, клетки культуры постоянно подвергаются эволюции из-за конкуренции и естественного отбора. Хорошо известно, что дифференциальная экспрессия генов между низкими и высокими числами прохода клеток, как ожидается, в большинстве клеточных линий из-за обезличения, как проход число увеличивается. После этого явления может также затронуть эффективность трансфекции. Однако было доказано, что последствия, связанные с прохождением, в значительной степени зависят от клеточной линии и условий культуры. Кроме того, то, что считается "высоким" уровнем прохода, варьируется от одной линии клеток к другой. Это означает, что диапазон числа проходов, в соответствии с которым набор экспериментов может быть надежно выполнен, должен быть определен для каждой заданной клеточной линии.

Другой параметр, который усиливает трудности в определении наилучших условий для трансфекции является то, что культура среднего состава также играет решающую роль, поскольку наличие сыворотки и / или антибиотики модулировать эффективность трансфекции. Действительно, большинство коммерческих протоколов рекомендуют использовать среду без сыворотки во время трансфекционного шага для повышения эффективности или обхода проблем с низкой эффективностью^3,25,26,27. Тем не менее, этот параметр действительно более сложен для того чтобы задержать по мере того как было показано что, для данной линии клетки, предыдущие и последние проходы могут увеличить или более низко эффективность в зависимости от присутсвия или отсутствия в среде культуры²⁸. Другие исследователи preconize использование антибиотиков свободной среды для прохождения до трансфекции при культивирования клеток, для того, чтобы получить высококачественные клетки для трансфекции²⁹. В заключение, при оптимизации условий трансфекции для данного типа клеток, каждый из этих параметров должен быть проверен: ранние или поздние клетки прохода и использование среды с или без сыворотки во время последнего прохода перед сбором клеток и/или во время трансфекция шаг сам по себе.

В ходе оптимизации протокола, представленного здесь, были использованы два вида реагента: липосомальный реагент, образующий липосоподобные комплексы, и липополиппекс-реагент, нелипосомное полимерное соединение^1. В то время как мы имели успех в течение многих лет вручную трансфектирования клеток HeLa с первой, плохая эффективность трансфекции наблюдалась в текущем автоматизированном протоколе. Это, вероятно, было связано с требуемым вихрем шаг при смешивании ДНК с трансфекционным реагентом, которые не могут быть выполнены в 384-ну хорошо пластины формате. Липополификс не нуждается в таком шаге и, следовательно, привел к повышению эффективности трансфекции во всех тестируемых условиях. Хотя это не было подтверждено в текущем исследовании, избегая трансфекционного реагентов, которые требуют физического смешивания шаг такой имеет pipetting или вихря, вероятно, приведет к лучшим результатам.

Мы также рекомендуем использовать трансфекционный реагент, совместимый с рефакцией обратного, поскольку представленный протокол основан на обратном трансфекции. Некоторые клетки, как известно, трудно трансфектировать и некоторые выделенные химические соединения разработаны для содействия более высокой эффективности трансфекции^30,31. Если мы нацелены на трансфектирование труднопередаваемых клеток, мы рекомендуем тестировать данные клеточные или клеточные трансфекционные реагенты, предполагая, что с этими клетками возможно обратное трансфекционирование.

Несколько параметров, подробно описанных в основных пунктах, могут оказать воздействие и несколько ухудшить процесс раздачи АДЕ, что, возможно, нарушит окончательный эксперимент.

Нанододознер был разработан для распределения капель 2,5 нл из исходных скважин, заполненных 3-12 л aqueous буфера (т.е. 9 л оборотного объема). Устройство наноддазатора, используемое в этом исследовании, интегрирует технологию динамического анализа жидкости для определения состава жидкости и высоты жидкости в исходной пластине для управления мощностью, необходимой для выброса капель 2,5 нл^19. При заполнении исходной пластины вручную или с помощью классического перистальтического жидких обработчика, объемы чаще всего не столь точны, чем те, которые определяются динамическим анализом жидкости. Это критический момент, чтобы принять во внимание, как устройство не в состоянии обойтись от исходных скважин загружены с более чем 12 Л. Таким образом, их присутствие поставит под угрозу эксперимент. Конечно, список выполненных диспенсаций может быть сформирован в конце программы, но это требует от пользователя корректировать объемы и запускать программу для восстановления только пропущенных диспенсаций. Чтобы избежать этих разногласий, рекомендуется провести "обследование" после того, как плазмиды ДНК были загружены для проверки ожидаемого объема в каждом из заинтересованных скважин.

Ключевым параметром для выброса капель является изменение поверхностного натяжения жидкости^17,32. Растворы ДНК воды известны своей вязкостью; это может нарушить процесс раздачи АДЕ. В то время как физические параметры не были определены в нашем предыдущем исследовании¹, более высокие концентрации раствора ДНК в исходной пластине привели к снижению эффективности трансфекции, даже для того же общего количества ДНК обойтись, вероятно, из-за этого Явление. Таким образом, мы рекомендуем использовать плазмидное разбавление 100 нг/Зл для достижения наилучших результатов, хотя другие концентрации могут быть проверены на удобство для пользователя. Для обеспечения надлежащей ADE с пользователями необходимой концентрации ДНК, краситель может быть добавлен в раствор для мониторинга выброса капель в колодцах или, что еще лучше, на крышке пластины. В качестве первой цели представленного протокола было получить высокую пропускную плату, дешевые мини-колонки на основе плазмид ной ДНК мини-подготовки комплекты совместимы с пластиной на основе высокой пропускной плазмидных протоколов очистки были использованы. В то время как он работал должным образом во время выполнения эксперимента, в случае низкой эффективности и плохой жизнеспособности клеток после трансфекции, рекомендуется использовать более высокие методы очистки ДНК, такие как миди- или макси-препараты или даже эндотоксин амортизации коммерчески доступные комплекты, которые обеспечат лучшую чистоту ДНК и более низкую токсичность для клеток³³.

Устранение неоднородной трансфекции клеток над поверхностью скважины

Первые попытки при настройке протокола привели к переклеению клеток только в центре скважин, куда капли отправлялись ADE. Действительно, мы заметили, что ДНК и трансфекционная смесь не распространяется по всей поверхности скважины и высыхает до клеточного дополнения из-за низких объемов дозированных (почти 500 nL). Чтобы обойти эту проблему, разбавитель дозирования шаг был добавлен, чтобы ДНК / TR смесь распространяться по всем скважинам до добавления клеток. Это привело к однородной трансфекции клеток в колодце. Таким образом, при воспроизведении эксперимента и смеси ДНК/ТР не распространяется по всем скважинам, объем разбавивого может быть скорректирован в соответствии с потребностями пользователя.

Поскольку акустический жидкий обработчик может распределять объемы в диапазоне нанолитров, описанный метод потенциально не имеет каких-либо технических ограничений. Тем не менее, мы заметили, что водные растворы заполненные скважины подвержены испарению, что может представлять собой ограничение. Если точные объемы, которые должны быть распределены, будут снижены в результате этого испарения, нанодирование не будет выполнено до ожидаемого конца. В этом случае отчет об ошибке генерируется нанодайзером. Чтобы обойти эту проблему, используйте более высокие объемы, чем ожидалось, оставаясь в приемлемом верхнем диапазоне (действительно, ниже 12 л). Однако, если испарение приводит к нарушению некоторых диспенсаций, отчет об ошибке генерируется нанодайзером. Этот файл может быть использован для заполнения исходной пластины с новым реагентом, который будет распределяться на соответствующих скважин назначения. Это в короткий промежуток времени, как представляется, не ухудшить эффективность трансфекции.

Описанный здесь протокол является первым, получивший такую пропускную информацию для независимых трансфекций плазмидной плазмиды ДНК. Лучшие ставки, достигнутые раньше были для 288 различных условий, которые требуют узкоспециализированных навыков, которые будут выполняться одновременно¹⁵. Это, помимо его высокой пропускной связи, текущий протокол имеет и другие существенные преимущества, поскольку общий процесс был оптимизирован, чтобы позволить его использование неспециалистами и инструменты были разработаны, чтобы избежать ошибок, а именно i) специальный макротаблица позволяет простой дизайн экспериментального шаблона, ii) автоматическое поколение соответствующей ДНК и трансфекционного реагента источник пластины (ы) шаблон этого макроса, iii) поколение двух готовых к использованию файлов для управления программного обеспечения управляемых диспенсации ДНК и трансфекционный реагент нанодайзером устройства, и iv) экспорт "384-хорошо пипеттинг руководство" файл, соответствующий исходной пластины (ы) разработан, который будет использоваться в специальном приложении на основе таблетки также разработан ы для того, чтобы избежать человеческих ошибок в то время как дозирования в 384-хорошо источник пластины (ы).

Будущие улучшения протокола

Для повышения пропускной перевалки и воспроизводимости исходная пластина, наполненная плазмидов, может храниться при 4 градусах Цельсия или замораживаться, как обычно, для решений по запасам ДНК. Кроме того, мы показали, что предустановленная пластина назначения, заполненная ДНК, также может храниться сухой или замороженной в течение по крайней мере 7 дней, прежде чем добавить трансфекционный реагент и клетки, что приводит к повышению общей пропускной всей и простоты протокола. Сохранение ДНК в течение более 4 лет ранее сообщалось с использованием оптимизированных носителей³⁴ и, следовательно, должны быть проверены в контексте этого протокола, как это будет толкать его еще дальше, что позволяет долгосрочное хранение пластин предварительно заполнены с банками плазмиды и готовые к использованию в трансфекционных экспериментах.

Ранее мы показали, что выявленные оптимальные условия трансфекции могут быть перенесены на более высокие эксперименты, от 96-ну хорошо до 10 см культуры блюда¹, путем расчета количества ДНК, трансфекционного реагента объем, и плотность клеток, которые должны использоваться на основе оптимизированного протокола 384-колодца. Поскольку диспенсация пластин 1536-наилучшим образом также управляема нанодайзером, протокол также может быть выполнен в более низком масштабе, тем самым увеличивая его пропускную столдора. Однако основным ограничением для достижения этого формата является возможность раздавать ячейки и управлять окончательным считыванием в таком миниатюрном формате. Выделяние клеток ADE уже успешно выполнено в формате 1536-ну хорошо пластины³⁵ с помощью раствора нейтральной плотности, которые предотвращают посев клеток и обеспечиваетравную плотность клеток во времени. Исходя из используемого здесь ячеечного числа и соотношения поверхности 384 (0,056 см²⁾против 1536 скважин (0,025 см^2),500-650 ячеек будут выдаваться в последнем формате. Такое диапазон числа диспенсаций клеток показал, что он очень надежен, если используется 14-18% концентрированного раствора нейтральной плотности. В этих условиях 100 нл клеточной подвески будут распределены по 1536 скважинам. При рабочем растворе 5-8 л в таких скважинах добавление 5-8 л культуры среды с использованием классических перистальтических жидких обработчиков разбавит раствор антисемени менее чем до 0,3%, что позволит надлежащую посевную клеток. Трансфектирование ячеек в таком низком масштабе, таким образом, представляется технически возможным; однако влияние остаточной концентрации раствора нейтральной плотности на эффективность трансфекции еще предстоит определить в ходе дальнейшей работы.

Использование типов исходных пластин, несущих более высокие рабочие объемы для распределения клеток, таких как 384-нухорошо полипропиленовые исходные пластины, имеющие рабочий объем 45 Зл, позволит 100 nL клеточного раствора диспенсации только из четырех источников скважин для общей пластины 1536-ну. Кроме того, новые нанодячители способны распределять капли 25 нл вместо 2,5 нл, которые использовались в этом протоколе. Этот размер падения, таким образом, делит 10-кратное время дозирования, но подразумевает использование нескольких 25 nL томов, которые, однако, остаются совместимыми с различными объемами, распределенными в протоколе, представленном здесь.

Основываясь на этих последних работах и технологических усовершенствованиях, к текущему протоколу можно было бы легко добавить дополнительный шаг деления клеток ADE для достижения трансфекции пластин ы 1536 колодцев. Однако достижение таких миниатюрий стоит того только в том случае, если биоасса в таком миниатюрном формате осуществимо.

В заключение мы разработали простой, высокопроизводительный и точный метод трансфекции, имеющий ряд преимуществ из-за миниатюризации: (1) снижение затрат на реагент трансфекции; (2) сокращение отходов препаратов ДНК; (3) обеспечение того, чтобы даже новички могли успешно выполнять трансфекцию клеток. Действительно, это требует только несколько простых ручных шагов, а именно разбавления ДНК до 100 нг / Л, дозирование его на исходной пластине (один плазмид / хорошо) в соответствии с электронной таблицей генерируемых шаблоник и с помощью таблетки на основе трубачирования руководства, а также подготовка клеточной подвески перед посевом. Нанодоситель на основе ADE отвечает за трудоемкую и подверженную ошибкам доставку дозы и мультиплексирование плазмидов, согласно данному шаблону эксперимента.

Кроме того, в то время как этот протокол мог бы обеспечить большинство основных биологических намерений классических экспериментов трансфекции, он мог бы также открыть новые пути для экспериментов на основе массивов. Например, выражая или сбивая каждый человеческий белоковыжий ген из коллекции ORFeome человека³⁶ или CRISPR-Cas9 библиотечных подходов^37,соответственно, потребуется менее 24 ч на специальной автоматизированной платформе (53 x 384- хорошо пластин), а не 2-3 дней человеческой работы, предполагая, что использование ДНК-предустановленной пластины банка. Благодаря высокой эффективности и высокой производительности, представленный здесь протокол может даже быть в состоянии достичь новых непулированных подходов для CRISPR-Cas9 на основе исследований с библиотеками gRNA/CRISPR-Cas9-выражения плазмидов. Действительно, мягкие клеточные изменения фенотипа, которые в настоящее время не могут позволить необходимый шаг сортировки клеток, наконец, будет управляемым, как один хорошо будет представлять один постучал гена.

Авторам нечего раскрывать.

Авторы раскрыли получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и/или публикации этой статьи: Inserm, Лилльский университет, Институт Лилля Пастера, Conseil Regional du Nord, и PRIM-HCV1 и 2 (Пале де Рехерш Междисциплинарное сюр-ле-Медикамент), Национальная эгенство Речерче (ANR-10-E-PX-04-01), Федер (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и Европейское сообщество (ERC-STG INTRACETB. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра С. Моуре, д-ра Б. Виллеман, д-ра Р. Ферру-Клемента и д-ра Х. Гроульта за их критический обзор и исправление рукописи.