Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители

Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.

Электрофорез геля дна агарозы с помощью является общим инструментом в лаборатории молекулярной биологии, позволяя разделения фрагментов ДНК по размеру. После разделения ДНК является визуализированы пятнать. Эта статья демонстрирует использование тиазол оранжевые пятна ДНК. Тиазол оранжевый выгодно общих пятная методов, в том, что чувствительные, недорогой, возбудимых с УФ или синий свет (во избежание повреждения образца) и безопаснее, чем бромид ethidium. Лаборатории, уже оснащены для запуска ДНК электрофорез эксперименты с использованием бромид ethidium обычно можно переключиться существующих протоколов, с помощью ультрафиолетовый свет для обнаружения красителей без дополнительных изменений. Синий свет обнаружения повреждения образца дополнительно может быть достигнуто с фильтром источника и выбросов синий свет. Лаборатории, уже оборудованные для обнаружения синий свет можно просто переключиться красителей без дополнительных изменений к существующим протоколам.

Этот метод предназначен для выявления ДНК в гелях агарозы, используя тиазол оранжевый (для) для флуоресценции обнаружения. Из-за его низкой стоимости и благоприятные безопасности профиля тиазола оранжевый может увидеть особую пользу в Бакалавриат учебных лабораторий и исследовательских лабораторий, выполняющих молекулярной биологии, особенно перешнуровок и клонирования.

Бромид ethidium остается наиболее распространенных краситель для обнаружения ДНК в гелях агарозы. Это главным образом потому, что она может быть получена весьма недорого и только требует возбуждения с ультрафиолетовый свет для обнаружения. Обе ethidium бромид и тиазол оранжевый недорогой, с низкой обнаружения пределов (1-2 нг/пер)¹. Есть два главных недостатка бромид ethidium, однако, которые тиазол оранжевый улучшает.

Во-первых, бромид ethidium является мутагенным² с специальной обработки, доставки и удаления требования, тогда как тиазол оранжевый менее мутагенные (3 – 4 x менее мутагенному Эймс теста)^3,4 и может быть вообще утилизировать вместе с общие химические отходы.

Во-вторых бромид ethidium требует ультрафиолетовый свет для обнаружения. Тиазол оранжевый при желании также можно использовать УФ-излучения, но также могут быть обнаружены с синим светом. Ультрафиолетовый свет, в то время как широко используется, имеет несколько характерных недостатков. Во-первых это ущерб человеческой кожи и глаз. В то время как ультрафиолета может безопасно использоваться обученными профессионалами, кожи или глаз случайных (функционально похож на солнечных ожогов) от Лаборатория УФ света не являются редкостью особенно с неопытными учеными. Во-вторых ультрафиолета чрезвычайно повреждения ДНК образцов⁵, что снижает успех течению экспериментов (например, перевязки и трансформации)^1,6,7. В позволяет обнаруживать с голубой свет (λ_{ex, Макс} = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показывают сильного возбуждения)), которая не вызывает повреждения кожи или ДНК повреждения (хотя любой интенсивный свет все еще могут быть вредны для глаз), значительно снижается риск как ученый и образец.

Является не только Люминесцентную краску альтернативой бромид ethidium; его преимуществом является стоимость. ЧТОБЫ был обнаружен в 1980-х как пятно ретикулоцитов⁸и утилита в ряде на основе ДНК флуоресценции эксперименты^{9,10,11,12,13}. В настоящее время он продается с несколькими поставщиками. Это родительский комплекса дополнительных, более дорогие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители и ведет себя аналогично во время электрофореза, используя УФ или синий свет для обнаружения¹. Кроме того в то время как другие красители более чувствительны к очень низкой концентрации ДНК чем бромистый этидий или к, для универсального электрофорез эксперименты, такие красители являются дорогими во многих контекстах.

1. Подготовка геля

Примечание: Для общего гель Протоколы электрофореза, смотрите также П.Ю. ли, и др. ¹⁴.

1. Смешайте агарозы (~ 1% w/v, процент может варьироваться для определенного размера Цветоделение) в буфере (примерно 70 мл для мини-гель (8 x 7 см)). Буферы, обычно TAE (tris ацетат ЭДТА, 40 мм трис, ацетат 20 мм, 1 мм ЭДТА, рН около 8,6) или КЭ (tris Борат ЭДТА, 90 мм трис, Борат 90 мм, 2 мм ЭДТА, рН около 8,3)).
2. Добавьте тиазол оранжевый в конечной концентрации 1,3 мкг/мл.
   1. Растворите тиазол оранжевый в ДМСО сделать Стоковый раствор 10000 x (13 мг/мл). Пока не особенно светочувствительных Храните в темной, когда не в пользе. Это решение является стабильным при комнатной температуре для ~ месяцев; долгосрочного хранения может быть достигнуто путем замораживания аликвоты (ДМСО будет заморозить в стандартный холодильник). Не забудьте полностью расплава и Ресуспензируйте замороженный раствор перед использованием.
      Примечание: Гель может также быть запятнано с TO после электрофореза (см. шаг 2.6). Время имеет улучшенную безопасность профиль над бромид ethidium, стандартные молекулярной биологии лаборатории безопасности меры предосторожности, которые следует сохранить.
3. Микроволновая печь смесь агарозы, буфера и тиазол оранжевый распустить агарозы (примерно 60 s). Этот шаг обычно именуется как «плавления». Водоворот (5 s) для оказания помощи роспуск, при необходимости.
   Примечание: Чтобы также могут быть добавлены после микроволновой печи, если предпочтительнее.
4. Дайте раствору агарозы для охлаждения кратко перед заливкой в аппарат литья гель, содержащий соответствующие гребень.
5. Позвольте затвердеть в гель агарозы решение.

2. Загрузка и запуск гель

1. Место в аппарате электрофорез геля, если не уже присутствует.
2. Добавление идущий буфер (ТЭ или КЭ как выше) для покрытия поверхности геля.
3. Загрузите образцы ДНК (обычно 10 мкл) с помощью загрузки красителя. Включать калибровки лестница ДНК для справки.
4. Присоедините крышку и электроды (гель следует запустить к красной анода (положительные)).
5. Применить напряжения (обычно ~ 100В для мини-гель, хотя размер геля может потребоваться изменение напряжения для предотвращения повреждения гель) до тех пор, пока загрузка краситель объездил соответствующее расстояние (около 4-7 см для мини-гель, хотя расстояние может варьироваться в зависимости от точного применения).
   Примечание: Как и бромид ethidium и многие другие ДНК связывающих красители, положительно заряженных тиазол оранжевый. Следовательно эти красители будут мигрировать в противоположном направлении, electrophoresing ДНК. Для образцов, которые выполняются далеко вниз гель для укрепления отделения в конечном итоге краситель отделится от небольших фрагментов ДНК, что приводит к слабой пятнать. В этих случаях гель следует быть окрашены как шаг 2.6. Эта ситуация характерна не только для обеспечения, любой положительно заряженные краситель, который обратимо взаимодействует с ДНК будет демонстрируют такое поведение (включая бромид ethidium, чтобы и другие).
6. Если для не был добавлен перед гель литья (шаг 1.2), пятна, погружая гель в буфере, содержащий тиазол оранжевый.
   1. Подготовить достаточно буфера (ТЭ или КЭ) содержащие 1,3 мкг/мл тиазол оранжевый полностью покрыть гелем и замочить гель с мягким перемешиванием до полосы являются полностью обнаружено (примерно 20 мин).

3. Визуализация тиазол оранжевый агарозном геле (УФ transilluminator)

1. Удалите из аппарат для электрофореза и место на transilluminator УФ гель.
   Предупреждение: УФ света повреждения кожи и глаз. Не забудьте надеть соответствующую глаз (очки) и защиты лица (щит). Руки должны иметь Перчатки и должны носить с длинными рукавами.
2. При желании, вырежьте желаемой диапазоны дна от геля (для дальнейших пищеварение или перевязки, например). Разоблачить гель УФ света для как короткий отрезок времени можно во время обрезания. УФ-излучения (независимо от ДНК краситель) повреждает ДНК.
3. Извлечь ДНК от геля фрагмента с помощью легко доступных комплект или протокол¹⁵.

4. Визуализация тиазол оранжевый агарозном геле (синий свет transilluminator или фонарик)

1. Удалите гель от аппарат для электрофореза и место на синий свет transilluminator (~ 470 Нм длины волны максимальная выбросов). Кроме того, синий светодиод (~ 470 Нм) фонарик могут быть направлены на гель (либо из выше или ниже).
   Примечание: Хотя чувствительность ниже, используя синий свет transilluminator бромидом ethidium, ДНК, окрашенных бромидом ethidium могут быть обнаружены с помощью этого протокола синий свет.
2. Используйте фильтр янтаря выбросов (~ 560 Нм longpass, очки или площади) для фильтрации синий свет, позволяя визуализации флуоресценции от комплексов ДНК: тиазол оранжевый.
   Примечание: Без фильтра янтаря выбросов, это очень трудно обнаружить полосы ДНК из-за интенсивности источник возбуждения синий свет.
   Предостережение: Хотя синий свет не хватает способности остро повреждение тканей (контрастные УФ), длительное воздействие интенсивного синего света может повредить глаза и очки янтарных выбросов или фильтр следует использовать.
3. При желании, вырежьте желаемой ДНК полос от геля для дальнейшего применения.
   Примечание: Так как синий свет не повреждать ДНК, это не необходимо быстро вырезать полосы (например, когда с помощью УФ возбуждения в шаге 3.2).
4. Извлечь ДНК от геля фрагмента с помощью легко доступных комплект или протокол¹⁵.

5. изображения захвата

1. Выберите соответствующие параметры возбуждения и выбросов в аппарат гель изображений. Возбуждение и выбросов тиазол оранжевый (λ_{ex, Макс} = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показать сильное возбуждение, помимо сильного возбуждения в ультрафиолетовых длинах волн); λ_ет = 527 Нм) почти идентичны общей синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители, поэтому инструменты могут предустановленные настройки фильтра, которые могут быть использованы.
   Примечание: Некоторые настройки фильтра для голубой свет – необнаруживаемых коммерческих красители фактически использовать повреждения УФ-излучения для возбуждения, поэтому следует проявлять осторожность при визуализации до вырезания полос. По возможности используйте источник возбуждения голубой свет, когда ДНК полос будет вырезан после визуализации.
2. В отсутствие изображений системы с соответствующими фильтрами место желтый фильтр между камерой и источник возбуждения гель/синий свет.

Тиазол оранжевый позволяет обнаружение ДНК, без использования бромид ethidium и без использования ДНК повреждения УФ-излучения. Бромид ethidium известный быть мутагенными свойствами, поэтому его ликвидации из лаборатории может быть выгодным. Свет УФ повреждений ДНК и снижает эффективность преобразования значительно, в то время как синий свет не повреждают ДНК. Пределы обнаружения сходны между бромид ethidium, тиазола оранжевый и общие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих ДНК краситель (рис. 1, смотрите Таблицу материалы), с предел обнаружения для всех трех красителей, будучи ~ 1-2 нг/Лейн в мини-гель ¹.

Для общих приложений, таких как вырезать группу энзима ограничения переваривается тиазола оранжевый это особенно хорошо подходит. Обнаружение ДНК с возбуждением синий свет является надежной и простой, и ученый не спешить на акцизный ДНК, как они будут, если обнаружение с ультрафиолетовым светом. Плазмида была сокращена с энзимами ограничения изолировать вставкой (рис. 2, один гель является фотосъемка тремя различными способами). Insert легко обнаружить с TO с голубой свет в дополнение к УФ, позволяя нисходящие приложения происходят без опасения повреждения ДНК от ультрафиолета.

Рисунок 1 . Обнаружение ДНК с помощью тиазол оранжевый, общий голубой свет – необнаруживаемых коммерческих ДНК красителя и бромид ethidium, используя синий или УФ света. Гель фрагмент изображения представляют два раза разрежения 120-ng-группы ДНК через гель (группа — Группа 3.0 КБ от 2-журнал лестница). Эта цифра была изменена с о ' Нил, et al.¹, воспроизводится с разрешения. Смотрите о ' Нил, et al.¹ для получения подробной информации эксперимента.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Несколько изображений же тиазол оранжевый окрашенных агарозном геле ограничение дайджест. () Возбуждения с УФ transilluminator. (B) возбуждения с голубой свет transilluminator. (C) возбуждения с голубой свет фонарика (кончик которого видна слегка, не в фокусе, в изображении внизу). Переулок 1:2-журнал лестница, 1 мкг всего ДНК (помечены основных полос 3.0 КБ, 1.0 КБ и 0,5 КБ). Лейн 2: 0,5 мкг pEF-GFP плазмидной ДНК (5.1 kb) переваривается с HindIII (ожидаемый размер 5.1 kb). Лейн 3: 0,5 мкг pEF-GFP переваривается с HindIII и EcoRI (ожидаемые размеры: 3.7 КБ, 1.3 КБ). Гель выполнялся с 1,3 мкг/мл тиазол оранжевый в геле. Все изображения, снятые с помощью стандартных выбросов фильтр (590/110 Нм), экспозиции, оптимизированный для интенсивных полос.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Бромид ethidium уже давно стандартным инструментом в лаборатории молекулярной биологии, несмотря на известные токсичности. Он также страдает от требующих УФ света, который повреждает ДНК, как он определяется. Тиазол orange предлагает недорогой альтернативой бромид ethidium, а также полезные, но дорогие коммерческие красители.

Таким образом, преимущества тиазол оранжевый являются два раза. Во-первых тиазола оранжевый просто может использоваться в качестве замены бромид ethidium. Гели могут быть одинаково готовы бромистый этидий, с TO замещено пятно (шаг 1.2). Пределы обнаружения сходны (~ 1-2 нг/Лейн)¹. Для переключения красители, потому что тиазол оранжевый могут быть обнаружены с УФ-излучением (шаг 3) как раз как бромистый этидий требуется никакого дополнительного оборудования. Воздействие УФ света быстро повреждает ДНК, однако и может вызвать сбой вниз по течению экспериментов например перевязки и преобразования¹. Ультрафиолетовый свет также повреждения кожи и глаз, требующих тщательного меры предосторожности.

Второе преимущество TO является, что он предлагает возможность перехода от УФ возбуждения. Обнаружение с голубым (заменив шаг 3 шаг 4) устраняет повреждения ДНК и ограничивает риск для ученого. Синий свет возбуждения и обнаружения в может быть достигнуто с голубой свет transilluminator, а также с недорогой синий светодиодный фонарик (оба ~ 470 Нм максимального выбросов волны, как требующих фильтр янтаря выбросов). Надлежащее применение волны возбуждения (шаг 4.1) и выбросов фильтров (4.2) имеет важное значение для успеха эксперимента (см. также шаг 5.1). Источники света и выбросов фильтры легко доступны, однако, и с минимальными инвестициями, labs может получить преимущества синий свет возбуждения и избежать повреждения УФ света.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была поддержана запуска средства для пог от Университет Кристофера Ньюпорта.