Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare thiazole orange per la rilevazione di DNA negli esperimenti di elettroforesi del gel. L'uso dell'arancio di tiazolo permette l'eliminazione del bromuro di etidio, e rilevazione di fluorescenza può essere realizzato con UV o luce blu.

L'elettroforesi del gel del DNA usando agarosio è uno strumento comune in laboratori di biologia molecolare, consentendo la separazione dei frammenti di DNA di dimensioni. Dopo la separazione, il DNA è visualizzato dalla macchiatura. In questo articolo viene illustrato come utilizzare DNA thiazole orange a macchia. Arancio di tiazolo paragona favorevole ai comuni metodi di colorazione, in quanto è sensibile, poco costoso, eccitabile con UV o luce blu (per evitare danni di campione) e più sicuro che il bromuro di etidio. Laboratori già attrezzati per eseguire esperimenti di elettroforesi di DNA usando il bromuro di etidio possono passare generalmente coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti, utilizzando la luce UV per il rilevamento. Rilevamento di luce blu per evitare danni di campione può inoltre avvenire con un filtro di origine e di emissione di luce blu. Laboratori già attrezzati per il rilevamento di luce blu possono semplicemente passare coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti.

Lo scopo di questo metodo è per identificare il DNA in gel dell'agarosi usando thiazole orange (a) per la rilevazione della fluorescenza. A causa del suo profilo di sicurezza favorevole e basso costo, arancio di tiazolo può vedere particolare beneficio nei laboratori di insegnamento universitario e laboratori di ricerca, esecuzione di biologia molecolare, specialmente legature e clonazione.

Il bromuro di etidio rimane il colorante più comune per il rilevamento del DNA in gel dell'agarosi. Questo è principalmente perché si può ottenere molto a buon mercato e solo richiede eccitazione con luce UV per il rilevamento. Entrambi etidio bromuro e thiazole orange sono economici, con rilevamento basso limiti (1-2 ng/lane)¹. Ci sono due principali svantaggi al bromuro di etidio, tuttavia, che migliora l'arancio di tiazolo.

In primo luogo, il bromuro di etidio è un agente mutageno² con gestione speciale, spedizione e requisiti di smaltimento, mentre thiazole orange è meno mutagena (3 – 4 x meno mutagena nel test di Ames)^3,4 e possono generalmente essere smaltiti con comuni rifiuti chimici.

In secondo luogo, il bromuro di etidio richiede luce UV per il rilevamento. Thiazole orange similmente possibile utilizzare luce UV se desiderato, ma può anche essere rilevata con luce blu. Luce UV, mentre comunemente usati, ha alcuni svantaggi salienti. In primo luogo, è dannoso per gli occhi e la pelle umana. Mentre la luce UV può essere utilizzata in modo sicuro da professionisti qualificati, pelle o occhi danni accidentali (funzionalmente simili a scottature) da laboratorio UV luce non sono infrequenti specialmente con gli scienziati inesperti. In secondo luogo, la luce UV è estremamente dannoso a DNA campioni⁵, che riduce il successo di esperimenti a valle (ad esempio la legatura e trasformazione)^1,6,7. TO permette la rilevazione con luce blu (λ_{ex, max} = 510 nm (488 nm e 470 nm mostrano anche forte eccitazione)), che non provoca danni alla pelle o DNA danni (anche se qualsiasi luce intensa può ancora essere dannoso per gli occhi), diminuendo notevolmente i rischi per entrambi lo scienziato e l'esempio.

Non è l'alternativa di tintura fluorescente solo al bromuro di etidio; il suo vantaggio è il costo. A è stato scoperto nel 1980 come una macchia di reticolociti⁸e ha trovato il programma di utilità in un certo numero di fluorescenza basati sul DNA esperimenti^{9,10,11,12,13}. È attualmente venduto da più fornitori. A è il composto progenitore di ulteriori, più costoso, coloranti commerciale blu-luce – rilevabile e si comporta allo stesso modo durante l'elettroforesi, usando UV o luce blu per rilevazione¹. Inoltre, mentre altri coloranti sono più sensibili a concentrazioni molto basse di DNA di EtBr o TO, per esperimenti di elettroforesi generico, questi coloranti sono proibitivamente costosi in molti contesti.

1. preparare il gel

Nota: Per protocolli di elettroforesi del gel di carattere generale, vedere anche P.Y. Lee, et al. ¹⁴.

1. Mescolare agarosio (~ 1% w/v, percentuale può essere variata per separazioni di particolari dimensioni) nel buffer (circa 70 mL per un mini-gel (8 x 7 cm)). I buffer sono comunemente TAE (pH tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato 20 mM, 1 mM EDTA, circa 8,6) o TBE (pH di tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato di 90 mM, 2 mM EDTA, circa 8,3)).
2. Aggiungere thiazole orange a una concentrazione finale di 1,3 μg/mL.
   1. Sciogliere thiazole orange in DMSO per ottenere una soluzione stock di 10.000 x (13 mg/mL). Mentre non particolarmente fotosensibile, conservare a nel buio quando non in uso. Questa soluzione è stabile a temperatura ambiente per ~ mesi; archiviazione a lungo termine può essere ottenuta da congelare aliquote (DMSO congelare in un frigorifero standard). Essere sicuri di tutto sciogliere e risospendere una soluzione congelata prima dell'uso.
      Nota: Il gel anche può essere macchiato con TO dopo elettroforesi (Vedi punto 2.6). Mentre per ha un profilo di sicurezza migliore sopra il bromuro di etidio, sicurezza del laboratorio di biologia molecolare standard precauzioni dovrebbero essere mantenute.
3. Forno a microonde la miscela di agarosio, buffer e thiazole orange per sciogliere agarosio (circa 60 s). Questo passaggio si riferisce comunemente come "fusione". Ricciolo (5 s) per facilitare la dissoluzione se necessario.
   Nota: A può anche essere aggiunto dopo microwaving se si preferisce.
4. Consentire la soluzione di agarosio raffreddare brevemente prima di versare nell'apparecchio di colata di gel contenente un pettine adatto.
5. Consentire la soluzione di agarosio solidificare in un gel.

2. caricamento e l'esecuzione del gel

1. Posizionare il gel nell'apparato elettroforesi se non è già presente.
2. Aggiungere tampone in esecuzione (TAE o TBE come sopra) per coprire la superficie del gel.
3. Caricare i campioni di DNA (comunemente 10 μL) usando una tintura di caricamento. Includere una scaletta di dimensionamento del DNA per riferimento.
4. Fissare il coperchio e gli elettrodi (il gel deve essere eseguito verso l'anodo rosso (positivo)).
5. Applicare tensione (in genere ~ 100V per un mini-gel, anche se la dimensione del gel può richiedere una tensione modificata per evitare di danneggiare il gel) fino a quando il caricamento della tintura ha percorso una distanza adeguata (circa 4-7 cm per un mini-gel, anche se la distanza può variare a seconda applicazione precisa).
   Nota: Come il bromuro di etidio e molti altri coloranti di legame al DNA, arancio di tiazolo è caricato positivamente. Di conseguenza, questi coloranti migrerà nella direzione opposta di electrophoresing del DNA. Per i campioni che sono molto malandati il gel per la separazione avanzata, alla fine il colorante si separerà dai più piccoli frammenti di DNA, con conseguente colorazione debole. In questi casi, il gel deve essere macchiato come descritto al punto 2.6. Questa situazione non è univoco per TO, qualsiasi carica positiva colorante che reversibilmente interagisce con il DNA verrà presentano questo comportamento (compreso il bromuro di etidio, a e altri).
6. Se a non è stato aggiunto prima del gel colata (punto 1.2), macchia immergendo il gel in tampone contenente thiazole orange.
   1. Preparare abbastanza buffer (TAE o TBE) contenente 1,3 thiazole μg/mL arancio completamente coprire il gel e immergere il gel con agitazione delicata fino a quando le bande sono completamente rilevato (circa 20 min).

3. Visualizzazione del gel di agarosio arancione thiazole (transilluminatore UV)

1. Rimuovere il gel dalla apparato elettroforesi e posto su un transilluminatore UV.
   Attenzione: La luce UV è dannoso per la pelle e gli occhi. Assicuratevi di indossare appropriati degli occhi (occhiali) e protezione per il viso (visiera). Le mani dovrebbero avere guanti e maniche lunghe dovrebbero essere indossati.
2. Se lo si desidera, cut-out desiderato fasce del DNA dal gel (per ulteriore digestione o legatura, per esempio). Esporre il gel ai raggi UV per più breve una lunghezza di tempo possibile durante l'asportazione. Luce (a prescindere dalla tintura DNA) UV danneggia il DNA.
3. Estrarre il DNA dal gel slice usando un prontamente disponibili in kit o protocollo¹⁵.

4. Visualizzazione del gel di agarosio arancione thiazole (luce blu transilluminatore o torcia)

1. Rimuovere il gel dalla apparato elettroforesi e posto su un transilluminatore a luce blu (lunghezza d'onda massima emissione nm ~ 470). In alternativa, un LED blu (~ 470 nm) torcia elettrica può essere diretto presso il gel (sia da sopra o sotto).
   Nota: Mentre la sensibilità è inferiore utilizzando un transilluminatore a luce blu con bromuro di etidio, DNA colorato con bromuro di etidio può essere rilevato utilizzando questo protocollo di luce blu.
2. Utilizzare un filtro di emissione ambra (~ 560 nm longpass, occhiali di protezione o Piazza) per filtrare la luce blu, che consente la visualizzazione di fluorescenza da complessi di DNA: thiazole orange.
   Nota: Senza il filtro di emissione ambra, è molto difficile da rilevare le fasce del DNA a causa della intensità della sorgente di eccitazione di luce blu.
   Attenzione: Anche se luce blu manca la capacità di acutamente danneggiano i tessuti (UV a contrasto), prolungati esposizione alla luce blu intensa potrebbe danneggiare gli occhi e occhiali di emissione ambra o filtro deve essere utilizzato.
3. Se si desidera tagliare desiderati fasce del DNA dal gel per ulteriori applicazioni.
   Nota: Poiché la luce blu non danneggia il DNA, non è necessario tagliare rapidamente le fasce (ad esempio quando usando l'eccitazione UV nel passo 3.2).
4. Estrarre il DNA dal gel slice usando un prontamente disponibili in kit o protocollo¹⁵.

5. acquisizione immagine

1. Selezionare le impostazioni appropriate di eccitazione e di emissione in gel-imaging apparato. L'eccitazione e emissione dell'arancio di tiazolo (λ_{ex, max} = 510 nm (488 nm e 470 nm mostrano anche forte eccitazione, oltre alla forte eccitazione alle lunghezze d'onda UV); λ_em = 527 nm) sono quasi identici alla politica commerciale comune blu-luce – rilevabile coloranti, così strumenti possono avere predisposto le impostazioni di filtro che possono essere utilizzate.
   Nota: Alcune impostazioni di filtro per le tinture commerciale blu-luce – rilevabili effettivamente utilizzare raggi dannosi UV per l'eccitazione, quindi usare cautela se imaging prima di tagliare le fasce. Se possibile, utilizzare una sorgente di luce blu eccitazione quando bande di DNA saranno escisse dopo formazione immagine.
2. In assenza di un sistema di imaging con filtri appropriati, è necessario inserire un filtro ambrato tra la fotocamera e la sorgente di eccitazione gel/blu-luce.

Arancio di tiazolo consente l'individuazione di DNA, senza utilizzare il bromuro di etidio e senza l'utilizzo di luce UV danneggiano il DNA. Bromuro di etidio è ben noto per essere mutageno, quindi eliminarlo dal laboratorio può essere vantaggioso. Luce UV danneggia il DNA e abbassa l'efficienza di trasformazione in modo significativo, considerando che la luce blu non danneggia il DNA. Limiti di rilevazione sono simili tra il bromuro di etidio, thiazole orange e un colorante DNA commerciale comune, blu-luce – rilevabile (Figura 1, Vedi Tabella materiali), con il limite di rilevazione per tutti e tre i coloranti essendo ~ 1-2 ng/lane in un mini-gel ¹.

Per applicazioni comuni come il taglio di una banda di enzima di restrizione digerito, thiazole orange è particolarmente adatto. Rilevazione di DNA con luce blu eccitazione è robusto e semplice, e lo scienziato non avere fretta per asportare il DNA come farebbero se rilevare con luce UV. Un plasmide è stato tagliato con enzimi di restrizione per isolare un inserto (Figura 2, un gel è imaged tre modi diversi). L'inserto è facilmente rilevabile con TO con luce blu oltre a UV, permettendo applicazioni a valle si verificano senza timore di danni al DNA da esposizione ai raggi UV.

Figura 1 . Rilevazione di DNA usando thiazole orange, un colorante DNA comune commerciale blu-luce – rilevabile e bromuro di etidio utilizzando blu o luce UV. Gel di fetta immagini rappresentano le diluizioni di una banda di 120-ng di DNA attraverso il gel (band è un gruppo di 3,0 kb da scaletta 2-log). Questa figura è stata modificata da o ' Neil, et al.¹, riprodotto con permesso. Vedere o ' Neil, et al.¹ per i dettagli completi dell'esperimento.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Immagini multiple del gel dell'agarosi arancione-macchiato thiazole stesso di una raccolta di limitazione. (A) eccitazione con transilluminatore UV. (B) eccitazione con transilluminatore a luce blu. (C) eccitazione con torcia di luce blu (la punta che è leggermente visibile, fuori fuoco, nell'immagine in basso). Lane 1:2-registro scaletta, 1 μg di DNA totale (le principali bande di 3,0 kb e kb 1,0 0,5 kb sono etichettati). Corsia 2: 0.5 μg pEF-GFP del DNA del plasmide (5,1 kb) digerito con HindIII (previsto dimensione 5,1 kb). Corsia 3: 0,5 μg di pEF-GFP digerito con HindIII ed EcoRI (previsto dimensioni: 3,7 kb, 1,3 kb). Gel è stato eseguito con 1,3 thiazole μg/mL arancione nel gel. Tutte le immagini scattate utilizzando il filtro di emissione standard (590/110 nm), ottimizzato per bande di intense esposizione.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il bromuro di etidio è stata a lungo uno strumento standard nel laboratorio di biologia molecolare, nonostante la tossicità conosciuta. Si soffre anche che richiedono luce UV, che danneggia il DNA, come essa viene rilevata. Thiazole orange offre una conveniente alternativa al bromuro di etidio, nonché coloranti commerciale utile ma costosi.

I vantaggi dell'arancio di tiazolo sono così due volte. In primo luogo, arancio di tiazolo può essere utilizzato semplicemente come una sostituzione per il bromuro di etidio. Gel possono essere preparati in modo identico per EtBr, con TO sostituito come la macchia (punto 1.2). Limiti di rilevazione sono simili (~ 1-2 ng/lane)¹. Nessun equipaggiamento supplementare è necessaria per passare coloranti perché arancio di tiazolo possa essere rilevato con luce UV (passaggio 3) proprio come EtBr. L'esposizione a luce UV rapidamente danneggia il DNA, tuttavia e può causare un errore di esperimenti a valle, come la legatura e trasformazione¹. Luce UV è anche dannoso per la pelle e gli occhi, che richiedono precauzioni di sicurezza attenzione.

Il secondo vantaggio di TO è che offre la possibilità di spostamento dall'eccitazione UV. Rilevamento con luce blu (sostituendo il passaggio 3 con il passaggio 4) Elimina il danno al DNA e limita il rischio allo scienziato. Rilevamento della TO e luce blu eccitazione può essere raggiunto con un transilluminatore a luce blu e anche con una poco costoso torcia LED blu (entrambi ~ 470 nm emissione massima lunghezza d'onda, entrambe che richiedono un filtro di emissione ambra). Applicazione appropriata di lunghezze d'onda di eccitazione (punto 4.1) e filtri di emissione (passo 4.2) è essenziale per il successo dell'esperimento (Vedi anche punto 5.1). Fonti di luce e filtri di emissione sono prontamente disponibili, tuttavia, e con un investimento minimo, laboratori possono i vantaggi della blu-luce di eccitazione ed evitare danno luce UV.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio al TDG da Christopher Newport University.