Исследование взаимодействия растений через общие микоризных сетей с использованием повернутый ядер

Большинство растений в общинах вероятно соединены арбускулы микоризы (AM), но главным образом путем выращивания растений с или без mycorrhizas исследовано посреднических взаимодействий завод им. Мы представляем способ манипулировать общих микоризных сетей среди микоризных растений для изучения их последствий для взаимодействия растений.

Арбускулы микоризных (AM) грибов влияют завод минеральных питательных и роста, следовательно, они имеют возможность влиять на завод взаимодействий. Сила их влияния в extraradical мицелия, которые распространяются за пределы зоны питательных поблизости корни, чтобы в конечном итоге объединению людей в рамках общей сети микоризных (CMN). Однако, большинство экспериментов, исследовали роль AM грибов в завод взаимодействия путем выращивания растений с против без микоризных грибов, метод, который не явно рассмотреть роль CMNs. Здесь мы предлагаем метод, который управляет CMNs расследовать их роль в завод взаимодействий. Наш метод использует изменение контейнеры с коническими днищами с нейлоновой сетки или гидрофобных материалов, охватывающих щелевые отверстия, ¹⁵N удобрения и бедных питательными веществами интерстициальных песка. CMNs либо остаются нетронутыми взаимодействующих индивидуумами, разрушенных в результате вращения контейнеров, или предотвратить от формирования твердых барьер. Наши результаты показывают, что вращение контейнеры достаточно, чтобы нарушить CMNs и предотвращения их воздействие на растения взаимодействия через CMNs. Наш подход выгодно, потому что он имитирует аспекты природы, такие как саженцев, выстукивать в уже созданной CMNs и использование набора AM грибов, которые могут предоставлять различные преимущества. Хотя наш эксперимент ограничивается расследованием растений на этапе сеянца, завод взаимодействие между CMNs могут быть обнаружены с помощью нашего подхода, которые поэтому могут быть применены для изучения биологических вопросы о функционировании CMNs в экосистемах.

Арбускулы микоризных (AM) грибов помощь растений в колонизации земель 460 миллионов лет назад¹ и сегодня, они являются вездесущими симбионтами большинства растений², предоставления им жизненно важных минеральных питательных веществ для роста. Тонкий, нитевидные гифы AM грибов комбикорма для минеральных питательных веществ за пределами зон питательных возле корней, часто сталкиваются и колонизировать корневых систем соседних растений в «общих микоризных сеть» (CMN). Общие микоризных сетей также могут образовывать при грибковых germlings присоединиться созданы сети³, или когда я гифы предохранитель (анастомозируют) с conspecific гифы^4,5,6,7. Масштабы этих extraradical ГИФы в почве огромен, с extraradical гифы, составляющие 20% до 30% общей почвы микробной биомассы в прерии и пастбищных почвах⁸ и растяжения для 111 m·cm^-3 в ненарушенных луга⁹ .

Общие микоризных сети раздел минеральных питательных веществ среди взаимосвязанных соседних растений^10,11,12,13. Растения могут получить до 80% их фосфора и 25% их требований азота от AM грибов, обеспечивая до 20% от их общей фиксированной углерода для грибов в возвращение¹⁴. Недавние работы культуры в пробирке корневого органа обнаружила, что CMNs преференциально обмен минеральных питательных веществ с принимающей корнями, которые обеспечивают наиболее углерода до^11,грибов¹². Кроме того различные виды грибов AM могут отличаться в их качества как симбиотические партнеров, причем некоторые грибки, обмена больше фосфора для меньше углерода, чем другие¹⁵. Хотя корень орган культуры являются полезной модели для изучения AM симбиоз, потому что они представляют тщательно контролируемых средах и возможность непосредственно наблюдать гиф межсоединений, они не включают фотосинтезирующим побеги, которые влияют на важные физиологические процессы фотосинтеза, транспирации и суточные изменения, а также составляющих углерода и минеральных питательных раковины.

В природе саженцы скорее задействовать уже созданных CMNs. До недавнего времени, однако, ученые только изучили влияние AM грибов на питание растений, растения с и без утра грибов, часто с одного вида гриба AM. Хотя эта работа была чрезвычайно информативным для нашего понимания арбускулы mycorrhizas, этот метод упустила потенциально решающую роль, которую могут иметь CMNs в взаимодействия среди растений взаимосвязанных узлов. В частности растения, которые сильно зависят от AM грибов для роста минимально взаимодействовать без утра грибов^16,17, возможно смешение наша интерпретация AM гриб опосредованного взаимодействия при использовании в качестве «контроль» для базового ссылка.

Мы предлагаем подход вращается ядро для расследования роли CMNs в завод взаимодействий и структурирование населения. Наш подход имитирует компоненты AM симбиоз в природе, потому что весь растений соединения учредила CMNs и все растения выращиваются с утра грибов. Путем удаления корня взаимодействий, наша методология специально фокусируется на взаимодействий, посредничестве AM грибов также отслеживая минеральных питательных движения в пределах CMNs. Наш подход основывается на предыдущей работе, которая использована повернутый ядер как на местах, так и в Теплице для понимания функционирования реально AM.

Повернутое основной метод был создан в литературе как метод для манипулирования extraradical гифы^18,19,20,21, и он имел несколько перевоплощений в зависимости от своей цели над в последние два десятилетия. Первоначально, Сетчатые мешки или барьеры, позволяя в рост гифы были использованы для обеспечения свободной от корня отсеков для количественной оценки суммы арбускулы микоризных ГИФы в почве^22,23. Затем цилиндрические ядер почвы, заключенный в жесткой воды трубы или пластиковые трубки с слотов в нейлоновая сетка проницаемые, охватываемых гифы, но не корни, были разработаны. Это легко может быть повернут сорвать extraradical мицелия^18,24,25. Повернутое ядер были помещены между растениями, и гиф длины почвы на грамм почвы¹⁸, флюсы ¹³C extraradical мицелия²⁴, или усвоение фосфора из растений свободный ядер были количественных¹⁸. Другой способ использования таких ядер был для выращивания растений в них в поле сократить колонизации корней AM грибов через частые гиф нарушения в качестве альтернативы к стерилизации или применение фунгицидов, оба из которых имеют косвенное воздействие на почву органических вопрос и другие микробы¹⁸.

Гиф сетки барьер подход использовался для расследования питательных секционирование и растений взаимодействия через CMNs, но в прямоугольные микромира, а не с повернутым ядер. Уолдер et al.²⁶ исследованы взаимодействия между Linum usitatissimum (лен) и сорго биколор (сорго) путем отслеживания минеральных питательных веществ для обмена углерода с использованием изотопов через CMNs любой из грибов AM Rhizophagus irregularis или Funneliformis mosseae²⁶. Микромира в их исследование включает в себя завод отсеков, разделенных сетка барьеры, гиф отсеки, доступные только для микоризных гифы и помечены гиф отсеков, которые содержали стабильных и радиоактивных изотопов. Как элементы управления исследования используют методы лечения без арбускулярными. ²⁷ песня et al. используется аналогичный подход для поиска это растение, которое сигналы могут перевозиться только среди установленных CMNs ф mosseae , когда один завод был заражен грибкового патогена. Кроме того аналогично Уолдер et al.²⁶, Merrild et al.²⁸ выросли растения в отдельных отсеков, разделенных сетка расследовать производительность завода Solanum lycopersicum (помидор) саженцев, связанных CMNs в большой Cucumis sativus завод (огурец), который представлял собой обильные углерода источник. Они также использовали процедуры без микоризных грибов вместо отсечения CMNs²⁸. В эксперимент, во-вторых, связанные углерода для обмена фосфора было рассмотрено с использованием сетчатых мешков с ³²P. микромира с гиф сетки барьеров и CMN, разорвав лечения были использованы Янош et al.²⁹, который исследовал конкуренции взаимодействие между саженцев саванны пород деревьев эвкалипта tetrodonta и пересадке дерева тропических лесов, Litsea железистый. В этом исследовании, Янош et al.²⁹ поднял отсеков, содержащие сеянцы несколько сантиметров, раздвижные слои сетки против друг друга, чтобы сломать гиф межсоединений²⁹.

Последним шагом в эволюции повернутый основной метод был выращивать растения внутри ядер, которые находятся в горшки или микромира^20,30. ВИСС³⁰ используется повернутый ядер для выяснения, если extraradical AM мицелия может колонизировать Сосна Эллиота саженцев при распространении от доноров или «медсестра» AM растения-хозяина, Tamarindus indicaи как extraradical мицелий ectomycorrhizal грибов влияет на производительность рассада. Большие коммерческие трубчатых Рассада контейнеры (Таблица материалов) в пределах микромира были либо твердого пластика (не CMNs) или прорези и покрыты гидрофобные мембраны. Щелевые Рассада контейнеры были либо не поворачивается (нетронутыми CMNs) или вращать разорвать установленных CMNs. повернутый ядер с различными сетки барьер, размеры были использованы Бабикова et al.²⁰ расследовать Билогические сигнализации через CMNs среди горошек Фаба растения (бин). В их исследовании Центральный доноров завод в 30 см диаметр мезокосмы было взаимосвязано корни и гифы (не барьер) или только CMNs через сетку 40 мкм. Центральный растения были разорваны из взаимодействия с соседних растений путем поворота сетки прилагается ядер, или CMNs помешала тонкой сетки 0,5 мкм, включающего ядро.

Здесь мы представляем метод, который сочетает в себе аспекты предварительного повернут основных подходов к изучить влияние CMNs на прямой завод взаимодействий, в сочетании с стабильного изотопа трассировки. Наш метод использует «целевой завод» подход, в котором Центральный завод интереса окружен соседних растений. Растения выращиваются внутри вращающийся Рассада контейнеры, которые прорези и покрыты нейлоновая сетка шелкографии, гидрофобные мембраны, или немодифицированных твердого пластика. Общие микоризных сетей разорваны один раз в неделю или сохранены, и ¹⁵N стабильных изотопов отслеживать движение азота от соседей повернутый ядер на главной мишенью завод. Сравнивая размер растений с поглощение минеральных питательных веществ и стабильных изотопов, мы определяем, какие растения могут воспользоваться или страдают от CMNs во взаимодействиях среди растений-хозяев.

1. Строительство и Ассамблеи поворотный ядер

1. Изменить коммерческие трубчатых Рассада контейнеры (впоследствии под названием «контейнеры»; Таблица материалов) чтобы иметь 19 мм в ширину x 48 см Длина отверстия.
   1. С помощью сверлильный с 19 мм отверстие увидел без центрального, экспериментального сверло, вырезать два отверстия, один над другим, в стороны контейнера (диаметр 2,5 см x 12,1 см длиной), так, чтобы отверстия около 1 см друг от друга. Держите контейнер против забор на буровых печати и остановка с короткой дюбель, который приспособит внутри контейнера, чтобы помочь удерживать его на месте во время бурения. Используйте контейнер с гибкой пластиковой для предотвращения растрескивания.
   2. Вырезать оставшиеся тонкий кусок пластика между отверстиями с ножницы, кусачки или по металлу (для жесткого пластика сабля пила) чтобы сделать один удлиненные открытия шириной около 2 см и 5 см длиной.
   3. Повторите шаги 1.1.1-1.1.2 на противоположной стороне контейнера.
2. Обложка слотов с нейлоновой сетки или гидрофобные мембраны (рис. 1A).
   1. Нарежьте нейлоновая сетка с 40 мкм поры 9,5 х 8,5 см. Вырежьте столько частей как контейнеры.
   2. Нейлоновая сетка внешне на контейнеры для покрытия оба отверстия с некоторым легким перекрытием в ткани с использованием высокопрочных, промышленных горячего клея клей.
   3. При необходимости предотвращения движения воды, такие как при использовании водорастворимого питательных веществ или стабильных изотопов, покрывают сетка слой нейлона с гидрофобные мембраны^31,32 (Таблица материалов), позволяющий ам гифы гриба до перевал, но движение только водяного пара и не жидкой воды.
   4. Место горячего клея вокруг отверстия в контейнере и длинные по краям сетки нейлона. Ролл контейнера на ткань, чтобы избежать горения пальцев. Добавьте слой клея вдоль края ткани, где сетка ребер перекрытия. Нажмите на край на некоторые картон плотно запечатать его. Всегда ролл последовательно в одном направлении, которое будет же направление вращения готовых контейнеров в горшки или микромира, так что не перекрытые сетки края будет толкнул потенциально копаться в субстрат.
   5. После остывания клея, лента верхние и нижние концы ткани в контейнер, чтобы предотвратить свободные края и копирования с помощью гибкой ленты, такие как электрика ленты.
3. Используя ту же ленту как шаг 1.2.5, покрывают маленькие отверстия по бокам конический конец (не отверстие на кончике нижней) каждого контейнера для предотвращения роста корней из контейнера в остальной части микрокосм горшок.
4. Чтобы предотвратить потери почвы обеспечивая дренаж, место стекла мрамора в нижней части каждого контейнера.
5. Для управления лечения, которые не связаны с любой потенциал для CMN форме между растениями используйте твердые, неизмененное контейнеры (рис. 1A).

2. Ассамблея горшки или микромира подогнать конические концы контейнеров

1. Чтобы гарантировать контейнеры стоять в неподвижном положении и имеют надлежащего дренажа, переверните горшок так что снизу вверх. Вырежьте вокруг нижней части горшка, оставляя небольшой lip для поддержки, используя сабля пила.
2. Подготовка пенополистирола
   1. Вырежьте пенополистирола, около 36 мм толщиной, чтобы тот же диаметр, как в нижней части горшка с помощью ленточной пилы с jig круг резки.
   2. Просверлить отверстия в пену с использованием буровых печати и 19 мм отверстие увидел (без центрального сверло) в шаблон, в котором будет располагаться контейнеры.
   3. Для целевой завод эксперимента сверлить центральное отверстие с равноудаленных отверстиями для соседних окружающих его лиц. Для горшок диаметром 15,5 см пространства шесть отверстия 12 мм друг от друга по окружности круга Диаметр 11 см (рис. 1B).
   4. Выложить отверстия, гексагонально или в массиве квадратный (рис. 1 c, D) для эксперимента микромира.

3. Заполнение контейнеров и горшки с почвы и песчаных смесей

1. Выберите желаемый грунтосмесь и добавить AM гриб поле собранные или пот культивированный посевным материалом в почву равномерно смешивая нарезанные кусочки корня (1 — 2 см длиной) тщательно с почвой. Смешайте желаемого почвы с бесплодных кварцевый песок или стеклянные бусы для уменьшения концентрации минеральных питательных веществ для растений.
2. Позиция заполненных контейнеров в просверленные пены или микрокосм нижней и заполнить интерстициального пространства с бесплодными субстрата.
3. Заполните интерстициального пространства между контейнеры со смесью бедных питательными веществами кварцевого песка, используя воронку для оказания помощи в заполнении небольших пространствах. Чтобы обеспечить адекватный дренаж и имитировать текстуру почвы, смесь средний размер частиц песка, например класс 6-20, с небольшой размер частиц песка, например класс 30-65, в бетономешалку.

4. Создание CMNs по всему горшки/микромира

1. Растений предварительной «медсестра» желаемого вида в каждый контейнер для поддержания AM грибов, так что они могут распространяться среди контейнеров и установить CMNs.
2. Когда все контейнеры создали саженцев, удалите побеги путем отсечения, так что только один человек остается в каждом контейнере.
3. Разрешить 2-3 месяца для роста растений и CMN учреждение.

5. Создание экспериментальной растений и лечения

1. Сеять экспериментальной растений, посев или пересадка в контейнеры. Если инициализация, подождите, пока все контейнеры имеют проросшие рассаду перед удалением медсестра предварительной обработки растений путем отсечения их побеги. Если пересадка, клип все до очистных сооружений до пересадки экспериментальных саженцев для предотвращения непреднамеренных последствий конкуренции.
2. Создание CMN лечения, либо оставив контейнеры не переехал в течение всего эксперимента (нетронутыми CMNs) или поворачивая их каждую неделю, чтобы физически разорвать гифы, распространение среди модифицированных контейнеры (разорвала CMNs; Рисунок 1A). При разрыве CMNs, вращайте каждый контейнер через один полный оборот, чтобы избежать непреднамеренного изменения надземной взаимодействия, особенно для гелиотропный растений.
3. Сильно воды все горшки или микромира сразу после поворота восстановить контакт между сторонами контейнеров и интерстициальный субстрата.

6. Отслеживание движения минеральных питательных веществ через CMNs

1. Удобрять растения соседних с 0,5% ¹⁵N обогащенный KNO₃ и NH₄Cl.
2. Цель человека с ¹⁴N удобрения равной концентрации Удобряйте.

7. Мониторинг и техническое обслуживание эксперимента

1. Регулярно (по крайней мере ежемесячно) повторно рандомизировать позиции горшки или микромира в течение эксперимента.
2. Еженедельно измерения роста, такие как высота или длинный лист длиной (для трав) для отслеживания роста начинает медленно, потому что это важно для урожая до растения становятся корень прыгните.

8. урожай эксперимента

1. Клип все наземные ткани и уложите помечены конвертов, которые определяют их лечения, горшок или микрокосм и положение отдельных растений.
2. Сухая трава тканей при 60 ° C до постоянного веса. Мера сухого веса каждой растительной ткани.
3. Разрешить почвы высохнуть до извлечения контейнеров и уборки корни.
4. Деликатно отмахнуться от как много почвы как можно дальше от корневых систем и мыть их в кастрюлю воды или под нежный поток воды на сито размера пор 250 микрон.
5. Разрешить корни просушите и весят всей корневой системы.
6. Клип корневой системы бессистемно и хранить корневых фрагментов в 50% этанола. После того, как они запятнаны³³, используйте эти фрагменты для количественного определения корневого колонизации с помощью метода пересечения сетки³⁴.
7. Повторно взвесить оставшиеся корневой системы и хранить его в обозначенные Бумажный конверт для просушки при 60 ° C для оценки сухого веса. Чтобы вычислить вес всей корневой системы используйте следующее уравнение:

9. минеральных питательных веществ и стабильного изотопа анализы

1. Группировка биомассы в «децилей» или 10 групп, «octiles» или 8 групп, «квартили» или четыре группы и т.д. саженцы после ранга упорядочение их по весу если количество ткани является слишком низким для минимальных требований для переваривания для определения минеральных питательных веществ концентрации.
2. Отправьте лиственного покрова контракт лабораторию для анализа минеральных питательных веществ и стабильных изотопов (Таблица материалов).
   1. Опишите изотопный изобилия, используя следующее выражение обычного:
      
      где R представляет ¹⁵N /¹⁴N коэффициент выборки или стандарта, который является атмосферный N.
   2. Использования немодифицированных, лечения твердый контейнер в качестве элемента управления для фона ¹⁵N соотношения в следующее уравнение баланса массы при количественной количество ¹⁵N, принятые Целевой завод в разорваны или нетронутыми CMN лечения:
      
      где δ¹⁵N представляет изотопный обилие целей, соседи и целевой растений не CMN лечения, а x (в виде десятичной дроби) процент азота полученные Целевой завода от соседа контейнеров, к которым был добавлен ярлык. Для каждого целевого растения собраны соседей получены значения δ¹⁵N_{соседей} .

Чтобы определить, как CMNs может влиять на производительность завода через питательных перегородки, мы выросли, Бородач Жерара Витман, травы прерии доминирующим, в эксперименте целевой завод с 6 равноудаленных соседей и нетронутыми, разорвала или не CMNs. Мы обнаружили, что разрыв или предотвращения CMNs уменьшилась цели надземной сухого веса (рис. 2), предполагая, что нетронутыми CMNs способствовали росту растений. Растения с отрубленной CMNs и предотвратить CMNs ответил особенно аналогично для их лечения, предполагая, что вращение контейнеров один раз в неделю была успешной в смягчении последствий CMNs. Разорвала CMN лечение, однако, может быть предпочтительным, как элемент управления потому что нейлоновая сетка (который был перекрытых на гидрофобные мембраны в этом эксперименте) в нетронутыми и разорвала лечения могут повлиять на динамику воды такие почвы щелевые контейнеров (повернут или нет) сушки быстрее, чем в контейнерах, не изменены.

Конкурс, в котором рост одного человека подавляет рост другой близлежащий личности, был обнаружен в неповрежденной CMN лечения но не разорвала или не CMNs лечения. Мы обнаружили, что только когда CMNs были целы Целевая и суммируются сосед размеры имеют негативные отношения, как продемонстрировано линейной регрессии (рис. 3). Отрезанные и не CMNs лечения не отличаются друг от друга, и вместе, их склоны не значительно отличаются от нуля. Следовательно они значительно отличаются от отрицательный наклон нетронутыми CMNs лечения (рис. 3). Кроме того мы обнаружили, что коэффициенты Джини, мера неравенства размер в диапазоне от нуля до одного, в котором нулевой отражает распределение совершенно одинакового размера, отличается среди лечения. Нетронутыми лечения CMNs имел наибольшее неравенство^10,35,36. Размер неравенства страдают от конкуренции внутри групп населения, особенно когда крупные особи доминировать приобретение ресурсов, тем самым непропорционально подавления роста малых лиц, также известный как асимметричное конкуренции^{37 , 38}.

Ли ограничение роста минеральные питательные вещества, и если CMNs способствовали активизации конкуренции для этих питательных веществ был определен путем сравнения минеральных питательных веществ листовой ткани концентрации против завод размер. Из всех минеральных питательных веществ оценку мы обнаружили, что только Mn концентрации в тканях листа были положительно связаны с целевой завод надземной сухого веса над все процедуры, с никаких существенных различий между склонами, предполагая, что Mn могут ограниченный рост среди всех методов лечения (рис. 4). Тем не менее фасады линии регрессии, которые показывают различия в концентрации между процедурами, были затронуты CMN разрыва и предупреждения. Внекорневая N концентрации не были существенно затронуты CMN лечения, но концентрация N значительно уменьшилась с надземной сухой вес целевых установок, предлагая потенциальным «разрежающего эффект» размер растений на ткани N^{39, 40}. Таким образом, N скорее всего не было ограничение роста минеральных питательных веществ в нашем эксперименте. В другой аналогичный эксперимент означает внекорневая P был существенно затронуты CMN лечения, но и показал разрежающего эффект по сравнению с завода размер для растений с нетронутыми CMNs³⁵.

Для изучения, если CMNs дифференциально раздела минеральных питательных веществ среди взаимосвязанных лиц, мы оценивали целевой растительной ткани для ¹⁵N в ткани листьев против завод размер. Мы добавили ¹⁵N-лейбл только к соседей контейнеров. Мы обнаружили, что целевой растения с нетронутыми CMNs выше ¹⁵N концентрации по сравнению с обеих процедур, которые не отличаются друг от друга (рис 5A). Хотя целевой надземной сухой вес был связан с количество азота, полученных от соседей контейнеров над нетронутыми и разорвала CMNs лечения, нетронутыми CMNs имел склоне сильно положительный, значительно отличается от того из разъединенных CMNs лечение (Рисунок 5B). Эти результаты показывают, что крупные растения, потенциально с обильным photosynthate, полученные более ¹⁵N CMNs полез в соседних контейнеры, чем небольших целевых лиц. Наши результаты также показывают, что гидрофобные мембраны успешно предотвратил свободной воды (и последующие ¹⁵N) движение в горшки.

В другой вращается ядро целевой завод эксперимент гуавы (гуайява guajava) саженцев были выращены в контейнерах больших Рассада, встроенный в больших горшках, и все (в том числе больших горшках) были заполнены с же относительно богатые питательными веществами почвы смесь. Когда CMNs были разорваны вращением в отсутствие соседей, рост растений значительно уменьшилась до такого же размера, как растения в контейнеры из твердых материалов, предполагая, что поворачивать растения просто сократили доступ к полной почвы объем больших горшках (Рисунок 6 ). Когда растения целевой любое количество соседей, завод размер уменьшился до аналогичных размеров, и каких-либо статистически необнаруживаемых эффект отсечения CMNs исчезли (рис. 6).

В полевой эксперимент с помощью поворота сердечники из труб ПВХ один из нас исследовано влияние extraradical мицелия на производительность завода в полевой эксперимент с Soapberry (saponaria Мыльное дерево L.) саженцев (рис. 7). Хотя extraradical мицелием за пределами труб имел небольшое влияние на рост растений в течение 13 месячный эксперимент, отделив его от вращения труб снизили внекорневая N, P и Cu концентрации существенно (на 25% или более).

Рисунок 1. Эксперимент установки контейнеров в целости, разорваны, или управления процедурами (A), горшки в целевой завод эксперимент (B), или микромира с гексагональной (C) или квадратные (D) макет контейнеров. Темные пятна овал на модифицированных контейнеры являются открытие в контейнер, покрытые 40 мкм нейлоновая сетка для грибные гифы проникнуть (A). Общие микоризных сети остаются нетронутыми без поворота контейнеров, разрушенных в результате вращения или лишены возможности установления с прочной пластиковый контейнер (A). В эксперименте горшок растение целевой контейнеры могут быть помещены в нижней пены, что позиции их (B). Для эксперимента микрокосм внизу можно положил вне в массив гексагональной с шестью равноотстоящих, ближайших соседей для каждой цели отдельных (C), или в квадратный массив с четырьмя ближайшими соседями и еще четыре, немного более отдаленной, Диагональ соседи для каждого «целевой» (D). Группа B изменяется от¹⁰Weremijewicz и др. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Означать (± SE) надземной, так и Билогические сухого веса (g) целевой Бородач Жерара лиц среди общих микоризных сети лечения. Трава сухая весов приводятся как положительные значения выше абсциссе и Билогические сухого веса являются положительные значения ниже абсциссе. Трава сухая масса баров, увенчанный в том же письме не отличаются Тьюки честно существенное различие пост hoc тест на ɑ = 0,05. Билогические сухой массы не отличаются среди лечения и таким образом, не увенчаны буквы. Этот показатель изменяется от Weremijewicz et al.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис. 3. Всего соседа (g) по сравнению с целевой завод надземной сухой вес (г для растений Бородач Жерара) . Растения с нетронутыми общих микоризных сетей (CMNs) представлены темные треугольники и сплошной линией, с отрубленной CMNs серые квадраты и пунктирная линия и не CMNs с белыми бриллиантами и пунктирная линия. Этот показатель изменяется от Weremijewicz et al.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Цель надземной сухого веса (g) против концентрации марганца внекорневая (мкгg·g^-1) из Бородач Жерара. Растения с нетронутыми общих микоризных сетей (CMNs) представлены темные треугольники и сплошной линией, с отрубленной CMNs серые квадраты и пунктирная линия и не CMN белыми бриллиантами и пунктирная линия. Этот показатель изменяется от Weremijewicz et al.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Δ¹⁵N (‰) ± SE целевой Бородач Жерара лиц (A) с нетронутыми общих микоризных сетей (CMNs; черные полосы), разорвала CMNs (серые полосы) и не CMN (Белый баров) и % азота, полученные от соседа контейнера почвы растениями с нетронутыми CMNs окружающего солнце (треугольники) или тени (серый квадрат) по сравнению с целевой надземной сухого веса (g; B). бары, увенчанный в том же письме панели A не отличаются Тьюки честно существенное различие пост hoc тест на ɑ = 0,05. Эти показатели изменяются от Weremijewicz et al.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. Означать (± SE) надземной, так и Билогические сухого веса (g) целевой гуайява guajava лиц среди общих микоризных сетей (CMNs) и сосед лечения. Вдоль абсциссе, лечения не сосед представлена «0N», один сосед по «1N,» и т.д., в то время как контроль лечения с не CMNs (привитых твердых контейнера и не соседей) представлена легкой заливки и букву «C». Биомассы растений с нетронутыми CMNs представлены твердых баров, в то время как те, с отрубленной CMNs hachured. Надземной сухого веса показываются как положительные значения выше абсциссе и Билогические сухого веса являются положительные значения ниже абсциссе. Бары, увенчанный в том же письме не отличаются Тьюки честно существенное различие пост hoc тест на ɑ = 0,05. Надземной, так и Билогические сухого веса управления лечения были только по сравнению с нетронутыми и разорвала CMN лечения с без соседей (обозначается греческой буквы) потому, что элемент управления не включает соседей как дополнительный фактор в лечении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. Расширение повернутый основного метода полевой эксперимент (A) и представитель 13-месячного Мыльное дерево saponaria л саженцев с нетронутыми (не поворачиваются) и разорвала (повернутый) общих микоризных сетей (B). Трубы поливинилхлоридные (9 см диаметр x 20 см высота) были пробурены с отверстием увидел иметь четыре 5,3 см диаметр отверстия в двух против пар. Нейлоновая сетка трафаретной печати с 30 мкм поры были покрыты отверстия через который extraradical мицелия может расширить как от, так и в ядрах, которые были заполнены с почвы от посадки сайта (A). Общие микоризных сетей сохранились нетронутыми или отрезанные от вращения с помощью большой разводной. Позиции в паре повернутый и не поворачивается ядер (около 20 см друг от друга), помечаются флагами каждые 2 м вдоль пяти разрезов в экспериментальный участок, расположенный в роще личи (A). Хлоротичными растений, с надписью «поворота» показано в Bявляется свидетельством нарушения extraradical мицелием, уменьшение N, P и Cu поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Наши результаты подтверждают, что наш метод повернутый ядро может резко сосредоточиться на роль CMNs в Билогические завод взаимодействий. Есть несколько важных шагов в протоколе, однако, если изменены, имеющих возможность влиять на способность обнаруживать CMN эффекты. Важно заполнить интерстициальных области окружающие контейнеры с средством бедных питательными веществами. В нашем эксперименте завод неудачной, вращается ядро целевой с саженцев деревьев гуавы, хотя наблюдалось заметное сокращение роста Целевой присутствии любое количество соседей, не эффекты CMNs на Билогические конкуренции были обнаружены, вероятно из-за Минеральные наличия питательных веществ на протяжении всего горшки. Напротив использование средство бедных питательными веществами между повернутый ядер гарантирует, что ГИФы должны достичь в соседней контейнеры, которые часто заполнены с гифы и корни (особенно при работе с корня интенсивный трав). Таким образом extraradical ГИФы в соседних контейнеры находятся в прямой конкуренции с корневой системы и должны раздела минеральные питательные вещества, полученные от таких «патчи» среди растений, подключенных к CMN. Другим важным компонентом в принятии Билогические взаимодействий обнаружению, чтобы избежать надземной конкуренции. Наш гуавы эксперимент показал, что эффект дополнительные почвы объем доступа к очевидным, когда растения целевой соседи не по существу был ликвидирован, когда целевой саженцы были тени соседей. С помощью трав, которые главным образом растут вертикально, или ограничение Рассада листья коронки для предотвращения дублирования поможет смягчить надземной взаимодействий.

Использование несколько жесткие контейнеры Сетчатые мешки, имеет решающее значение в поддержании длинный эксперимент с легкостью разрыв CMNs вращением. В попытке раннего CMN эксперимент, пытаясь вытащить нож между Сетчатые мешки разорвать CMNs не только привели к поврежденные пакеты, от которых корни могут выступать, но также, как представляется, благоприятно увеличить аэрация почвы, что приводит к значительно усиленный рост растений при CMNs были разорваны. Потому что поворот основной подход аккуратно движется каждый контейнер в инвариантной позиции (благодаря поддержки позиции отверстия в нижней части горшка или микрокосм), он уменьшает окружающие субстрата дезорганизации и потенциальных аэрации. Это абсолютно необходимо, однако, тщательно воды горшки после вращения контейнеров для возвращения низкого уровня рождаемости, интерстициальный песка субстрата тесно связаться контейнеров.

Предлагаемый повернутый основной метод могут быть изменены в ряде способов ответить на различные вопросы, касающиеся функционирования CMNs и extraradical мицелия. Например количество углерода для растений-хозяев предоставлять CMNs может быть уменьшена затенение¹⁰. Тени ткань обернута вокруг пленки модифицированных саженцев окружить индивидуальных контейнеров был успешен на сокращение углерода провизионирования к CMNs и, следовательно, поглощение ¹⁵N от CMNs¹⁰. Кроме того, структура населения могут быть исследованы в больших микромира (рис. 1 c, D) состоит из многих растений, каждое в индивидуальных, повернутого контейнера. Важно отметить, однако, что необходимо позаботиться о том, чтобы избежать pseudoreplication⁴¹ , при этом. Отдельные растения являются наиболее определенно не «реплицирует», потому что они не являются независимыми от других растений в микромире. Вместо этого весь экспериментальное подразделение (горшок или микрокосм) является репликацию, поэтому мы использовали усредненные или составил сосед завод размеров на горшок до запуска дисперсионный анализ или линейной регрессии.

Наш подход может быть изменен для полевых исследований исключить корневой конкуренции и исследовать влияние нетронутыми CMNs. Путем замены контейнеров с ПВХ трубы штук с большими отверстиями, покрытые нейлон шелкотрафаретная сетка, повернутый ядер может выдержать суровых полевых условиях, как в Soapberry эксперименте. Как наш эксперимент горшок гуавы, однако, эффект отсечения потенциальных CMNs нельзя было отличить от просто ограничение объема грунта, из которого могут быть приобретены минеральных питательных веществ.

Наш подход обеспечивает контролируемое, тщательного сравнения растений, взаимодействующих через CMNs против микоризных растений, которые упорно не взаимосвязаны (вместо растений, полностью отсутствуют mycorrhizas). Таким образом он имитирует аспекты природы, такие саженцы присоединения создана CMNs, а также использование набора AM грибов. Недавняя работа продемонстрировала, что разных видов грибов AM могут быть различные качества партнеров для растений, и что наличие второго вида гриба AM на корневой системы может вызвать «отказывающихся» гриб видов предоставлять больше фосфора в обмен на углерода, чем когда только на⁴²корневой системы. Кроме того различных видов плесневых грибов может предоставить преимущества помимо минеральных питательных приобретение к заводе узлов, таких как засухи и солености терпимости или защиты от патогенов². Эти результаты подчеркивают важность использования набора грибов учредить CMNs. Несмотря на его реализма, заметным ограничением нашего подхода является продолжительность эксперимента. Размер контейнеров или трубы ПВХ ограничивает количество времени, прежде чем растения стали корень связан и таким образом стремится ограничить фокус только саженцы или молодые саженцы. Тем не менее мы полагаем, что существует значительная гибкость в разработке целевых завод вращается ядро экспериментов, в которых один или оба целей, так и соседей можно манипулировать в самых разнообразных способов понять роль CMNs.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы хотели бы поблагодарить два анонимных рецензентов для их предложений. Мы также благодарим многочисленных магистрантов, которые помогли с построения горшки, микромира и прорези контейнеров и ВОЗ оказывали помощь с поддержания и промысловые эксперименты. Мы также благодарим Северный Центральный колледж для запуска средства (для JW) и учреждений, а также Эшли Войцеховский для получения Северный Центральный Колледж Рихтер Грант поддержки эксперимент с использованием этих методов. Часть этой работы была финансируется национальной науки докторской диссертации улучшение Грант фонда (DEB-1401677).