Investigación de las interacciones de la planta a través de redes de micorrizas comunes utilizando núcleos girados

Mayoría de las plantas dentro de las comunidades probablemente está interconectada por los hongos arbusculares micorrícicos (AM), pero la mediación de las interacciones de la planta por ellos ha sido investigada principalmente por cultivo de plantas con y sin micorrizas. Se presenta un método para manipular redes mycorrhizal comunes entre plantas micorrizadas para investigar sus consecuencias en las interacciones planta.

Arbusculares micorrícico (AM) influencian crecimiento y absorción de nutrientes minerales de la planta, por lo tanto, tienen el potencial para influir en las interacciones de la planta. El poder de su influencia se encuentra en el micelio extra-radical que extienden más allá de las zonas de agotamiento de nutrientes cerca de las raíces, en definitiva, interconectar individuos dentro de una red común de micorriza (CMN). Mayoría de los experimentos, sin embargo, ha investigado el papel de los hongos AM en las interacciones de plantas por cultivo de plantas con y sin micorrizas, un método que no aborda explícitamente el papel de CMNs. Aquí proponemos un método que manipula CMNs para investigar su papel en las interacciones de la planta. Nuestro método utiliza contenedores modificados con partes inferiores cónicas con una malla de nylon o material hidrofóbico que cubren aberturas ranuradas, ¹⁵N fertilizante y una arena intersticial pobres en nutrientes. CMNs se quedan ya sea intacto entre los individuos interactuantes, cortado por la rotación de los contenedores, o impedido de formación por una barrera sólida. Nuestros resultados sugieren que contenedores de rotación es suficiente para interrumpir las CMNs y prevenir sus efectos sobre las interacciones planta través de CMNs. Nuestro enfoque es ventajoso porque imita los aspectos de la naturaleza, como plantas de semillero en CMNs ya establecidos y el uso de un conjunto de hongos AM que puede proporcionar diversos beneficios. Aunque nuestra experiencia se limita a investigar las plantas en la etapa de plántula, planta las interacciones a través de CMNs pueden detectarse mediante nuestro enfoque que por lo tanto puede ser aplicado a investigar cuestiones biológicas sobre el funcionamiento de CMNs en ecosistemas.

Arbusculares micorrícico (AM) asistida por las plantas en la colonización de la tierra hace 460 millones de años¹ y en la actualidad, son simbiontes ubicuas de la mayoría plantas², les proporciona nutrientes minerales vitales para el crecimiento. Las hifas delgadas, filiformes de hongos AM forraje para nutrientes minerales más allá de las zonas de agotamiento de nutrientes cerca de las raíces, a menudo encontrar y colonizar sistemas radicales de los vecinos de las plantas en una "red micorriza común" (CMN). Redes mycorrhizal comunes también pueden formar hongos germlings join estableció redes³, o cuando estoy hifas fusible (anastomizar) con hifas conespecíficos^4,5,6,7. La medida de estos extra-radical hifas en el suelo es enorme, con extra-radical hifas que constituyen el 20% al 30% de la biomasa microbiana total del suelo en pradera y pasto de suelos⁸ y estirar para 111 m·cm^-3 en un pastizal⁹ .

Redes mycorrhizal comunes partición de nutrientes minerales entre interconectados vecinas plantas^10,11,12,13. Las plantas pueden recibir hasta 80% de su fósforo y 25% de sus requerimientos de nitrógeno de hongos AM, mientras que proporciona hasta un 20% de su total fijada carbono para los hongos en retorno¹⁴. Trabajo de órgano de la cultura de la raíz in vitro reciente ha encontrado que CMNs preferencial intercambian nutrientes minerales con raíces de host que proporciona el carbón la mayoría hongos^11,12. Además, diferentes especies de hongos AM pueden diferir en su calidad como socios simbióticos con algunos hongos intercambiando más fósforo para menos carbono que otros¹⁵. Aunque los cultivos de órganos de la raíz son modelos beneficiosos para estudiar la simbiosis AM porque presentan ambientes cuidadosamente controlados y la capacidad de observar directamente las interconexiones hifal, no incluyen brotes de fotosíntesis que afectan importantes procesos fisiológicos como fotosíntesis, transpiración y cambios diurnos, así como constituir nutrientes de carbono y minerales se hunden.

En la naturaleza, las plántulas más probables aprovechar CMNs ya establecidos. Hasta hace poco, sin embargo, científicos han sólo examinado el impacto de los hongos AM en nutrición vegetal por cultivo de plantas con y sin hongos AM, a menudo con una sola especie de hongo de AM. Aunque este trabajo ha sido tremendamente informativo para nuestra comprensión de las micorrizas arbusculares, este método ha pasado por alto el papel potencialmente crucial que CMNs pueden tener en las interacciones entre plantas hospederas interconectados. En particular, las plantas que son altamente dependientes de hongos AM crecimiento interactúan mínimamente sin AM hongos^16,17, posiblemente confundir nuestra interpretación de interacciones mediadas por el hongo AM cuando se utiliza como 'controles' para línea de base referencia.

Proponemos un enfoque de núcleo gira para la investigación del papel de CMNs en interacciones de la planta y la estructuración de la población. Nuestro enfoque imita los componentes de la simbiosis de AM en la naturaleza porque toda combinación de plantas establecido que cmns y todas las plantas se cultivan con hongos AM. Mediante la eliminación de las interacciones de la raíz, nuestra metodología se centra específicamente en las interacciones mediadas por hongos AM mientras también seguimiento de movimiento de nutrientes minerales en CMNs. Nuestro enfoque se basa en trabajos anteriores que ha utilizado corazones rotados en el campo y en invernadero para entender AM funcionamiento realista.

El método base rotada se ha establecido en la literatura como un método para manipular los hyphae extra-radical^18,19,20,21, y ha tenido varias reencarnaciones dependiendo de su propósito en las últimas dos décadas. Inicialmente, bolsas de malla o barreras permitiendo el crecimiento de las hifas se usaron para proporcionar compartimentos libres de raíz para cuantificar la cantidad de hifas de micorrizas arbusculares en el suelo^22,23. Luego, se desarrollaron núcleos cilíndricos de suelo en tubos rígidos de agua o tubo con ranuras cubiertas de una malla de nylon penetrable por hifas, pero no las raíces, de plástico. Estos podrían girarse fácilmente para interrumpir el micelio extra-radical^18,24,25. Los núcleos rotados se colocaron entre las plantas, y longitudes hyphal suelo por gramo de suelo¹⁸, flujos de ¹³C micelio extra-radical²⁴o la absorción de fósforo de corazones libres de planta fueron cuantificados¹⁸. Otro uso de tales corazones fue crecer las plantas dentro de ellos en el campo para reducir la colonización de raíces por los hongos AM desbaratando hyphal frecuente como alternativa a la esterilización o la aplicación de fungicidas, los cuales tienen efectos indirectos sobre el suelo orgánico materia y otros microbios¹⁸.

El enfoque de la barrera de malla hyphal se ha utilizado para investigar a repartir nutrientes e interacciones de la planta a través de CMNs, pero en microcosmos rectangular en lugar de girados corazones. Walder et al²⁶ investigaron las interacciones entre Linum usitatissimum (lino) y Sorghum bicolor (sorgo) trazando nutriente mineral para el intercambio de carbono mediante isótopos a través de CMNs de cualquiera de los hongos AM de Rhizophagus irregularis o Funneliformis mosseae²⁶. El microcosmos de sus compartimientos de la planta de estudio compuesto por separados por mallas barreras, compartimientos hyphal sólo accesibles a hifas de micorrizas y compartimientos hyphal etiquetados que contienen isótopos radiactivos y estables. Como controles, el estudio utilizó tratamientos sin micorrizas. Canción et al²⁷ utiliza un enfoque similar para encontrar esa planta señales podrían ser llevadas solamente entre establecidos CMNs de F. mosseae cuando una planta fue infectada por un hongo patógeno. También, semejantemente a Walder et al²⁶, Merrild et al.²⁸ crecieron plantas en compartimentos individuales separados por malla para investigar el rendimiento de la planta de semillero de Solanum lycopersicum (tomate) por CMNs se relaciona un gran Cucumis sativus planta (pepino) que representa una fuente de abundante carbón. También utilizaban tratamientos sin micorriza en lugar de cortar CMNs²⁸. En un experimento en segundo lugar, relacionados con carbón para intercambio de fósforo fue examinada usando bolsas de malla con ³²P. microcosmos con barreras de malla hifal y CMN cortar como tratamiento fueron utilizada por Janos et al²⁹, quien investigó competitivo interacciones entre las plántulas de las especies de árboles de la sabana Eucalyptus tetrodonta y trasplantes del árbol del bosque lluvioso, Litsea glutinosa. En ese estudio, Janos et al²⁹ levantó compartimientos que contienen las plántulas unos centímetros, deslizamiento capas de malla uno contra el otro para romper las interconexiones hyphal²⁹.

El último paso en la evolución del método base rotada ha sido crecer las plantas dentro de los corazones que están en macetas o microcosmos^20,30. Girar los corazones Wyss³⁰ solía para determinar si micelio extra-radical AM podría colonizar las plántulas de Pinus elliottii al separarse de un donante o 'enfermera' AM la planta hospedera, Tamarindus indicay micelio extra-radical cómo de ectomicorrícicos rendimiento de semilla de hongos influencias. Contenedores de plántula tubular comercial grande (Tabla de materiales) dentro de un microcosmos fueron o plástico sólido (no CMNs) o ranuran y cubrieron con una membrana hidrofóbica. Plántula ranurado contenedores fueron o no rotadas (CMNs intactos) o girar para cortar núcleos establecidos de CMNs. girada con barrera de malla diferentes tamaños fueron utilizados por Babikova et al²⁰ para investigar las señales a través de CMNs entre Vicia FABA plantas (frijol). En su estudio, una planta central donante en mesocosmos de diámetro 30 cm fue interconectada por raíces e hifas (sin barrera) o sólo por CMNs establecidos a través de una malla de 40 μm. Centrales fueron cortadas de las interacciones con las plantas vecinas a través de la rotación de los núcleos de acoplamiento cerrado o CMNs fueron prevenidos por una malla fina de 0,5 μm que encierra el núcleo.

Aquí, presentamos un método que combina aspectos de los enfoques de base gira previos para examinar la influencia de CMNs sobre interacciones planta directo combinado con seguimiento de isótopos estables. Nuestro método utiliza un enfoque de 'planta de destino', en el cual la planta central de interés es rodeada de plantas vecinas. Las plantas se cultivan dentro de contenedores de plantita rotable ranurados y cubiertos con malla de nylon del silk-screen, membrana hidrofóbica, o son de plástico sólido sin modificar. Redes mycorrhizal comunes cortadas una vez por semana o conserva intactas, y los isótopos estables de ¹⁵N rastrear el movimiento del nitrógeno de corazones rotado de vecinos a la planta objetivo central. Al comparar el tamaño de la planta con captación de isótopo estable y nutrientes minerales, evaluamos qué plantas pueden beneficiar o sufrir de CMNs en las interacciones entre plantas hospederas.

1. construcción y montaje de núcleos rotativos

1. Modificar envases comerciales plántula tubular (posteriormente llamado 'contenedores'; Tabla de materiales) tener 19 mm de ancho x aberturas de longitud 48 cm.
   1. Usando un taladro con un agujero de 19 mm VI sin un taladro de giro central, piloto, corte dos agujeros, uno arriba del otro, en los lados de un envase (diámetro 2,5 cm x 12,1 cm de longitud) para que los agujeros son aproximadamente de 1 cm de separación. Sostenga el recipiente contra una valla en el taladro y tiene una parada con un pasador corto que cabe dentro del contenedor para ayudar a mantener en su lugar durante la perforación. Use un recipiente de plástico flexible para evitar que se quiebren.
   2. Cortar el restante delgado de plástico entre los agujeros con unas tijeras, un cortador de alambre o tijeras (para plástico rígido use una sierra de sable) hacer una alargada apertura de unos 2 cm de ancho y 5 cm de largo.
   3. Repita los pasos 1.1.1, 1.1.2 en el lado opuesto del recipiente.
2. Cubrir las ranuras con malla de nylon o membrana hidrofóbica (figura 1A).
   1. Corte de malla de nylon con poros μm 40 trozos de 9,5 x 8,5 cm. Cortar tantas piezas como recipientes.
   2. Pegamento de la malla de nylon externamente en los envases para cubrir ambas aberturas con un traslapo leve en la tela con pegamento de alta resistencia, industrial.
   3. Si es necesaria la prevención del movimiento del agua, tal como al usar nutrientes solubles en agua o isótopos estables, la capa de malla de nylon con una membrana hidrofóbica^31,32 (Tabla de materiales) que permite cubrir soy hifa del hongo a pasar, pero sólo el movimiento de vapor de agua y agua no líquida.
   4. Coloque el pegamento caliente alrededor de las aberturas en el contenedor y a lo largo de los bordes laterales de la malla de nylon. Roll contenedor sobre la tela para evitar que se queme los dedos. Añadir una capa de pegamento a lo largo del borde de la tela donde la malla de los bordes de traslapo. Presione el borde sobre algún cartón para sellarlo bien. Siempre rodar constantemente en una dirección que será la misma dirección de la rotación de los envases terminados dentro de macetas o microcosmos, por lo que no será colocado el borde de la malla superpuesta potencialmente cavar en el sustrato.
   5. Una vez que el pegamento se haya enfriado, con cinta adhesiva los extremos superior e inferior de la tela al contenedor para evitar que los bordes sueltos y ripeo usando una cinta métrica flexible, tales como cinta de electricista.
3. Usando la misma cinta como en el paso 1.2.5, cubrir los pequeños agujeros en los lados del extremo cónico (no el agujero en la punta de la parte inferior) de cada contenedor para evitar el crecimiento de la raíz fuera del contenedor en el resto del olla/microcosmos.
4. Para evitar la pérdida de suelo al tiempo que proporciona drenaje, coloque una canica de vidrio en la parte inferior de cada envase.
5. Para un tratamiento de control que implique cualquier potencial para un CMN para formar entre las plantas, utilice recipientes sólidos, sin modificar (figura 1A).

2. montaje de macetas o microcosmos para encajar los extremos cónicos de los envases

1. Para asegurar la posición vertical en una posición fija y tener un drenaje adecuado, voltea una olla para que la parte inferior quede mirando hacia arriba. Corte alrededor de la parte inferior de la maceta, dejando un pequeño borde de apoyo, utilizando una sierra de sable.
2. Preparación de la espuma de poliestireno
   1. Cortar la espuma de poliestireno, 36 mm de espesor, el mismo diámetro que la parte inferior de la maceta utilizando una sierra de cinta con una plantilla de corte del círculo.
   2. Agujeros en la espuma usando un agujero de taladro y 19 mm Sierra (sin un central taladro de torcedura) en el patrón en el que se ubicarán los contenedores.
   3. Para un experimento de la planta de destino, perfore un agujero central con agujeros equidistantes para los vecinos personas que lo rodean. Para una maceta con un diámetro de 15,5 cm, espacio seis agujeros de 12 mm de separación alrededor de la circunferencia de un círculo de diámetro 11 cm (figura 1B).
   4. Coloque los agujeros hexagonal o de una matriz cuadrada (figura 1, D) para un experimento de microcosmos.

3. llenado de los envases y macetas con las mezclas de suelo y arena

1. Seleccionar una mezcla de suelo deseado y agregar soy hongo campo recolectados o inóculo cultivado en maceta al suelo mezclando uniformemente picada pedazos de raíz (1-2 cm de largo) con el suelo. Mezclar el suelo deseado con un sílice infértil granos de arena o vidrio para disminuir la concentración de nutrientes minerales disponibles para las plantas.
2. Coloque los envases llenados en el fondo perforado de espuma o microcosmos y llenan el espacio intersticial de un sustrato estéril.
3. Llene el espacio intersticial entre recipientes con mezcla de arena de sílice de pobres en nutrientes con un embudo para rellenar pequeños espacios. Para asegurar un drenaje adecuado y mímico la textura del suelo, tamaño de las partículas arena media, tales como grado de 6-20, con arena de tamaño de partícula pequeño, tales como grado de 30-65, en una mezcladora de cemento de la mezcla.

4. establecimiento de CMNs en macetas/microcosmos

1. Plantar plantas de pretratamiento 'enfermera' de la especie deseada en cada recipiente para mantener hongos AM, por lo que pueden propagarse entre los contenedores y establecer CMNs.
2. Cuando todos los envases han establecido plantas de semillero, eliminar brotes por recorte por lo solamente un individuo permanece en cada contenedor.
3. Permitir 2-3 meses para el crecimiento de las plantas y el establecimiento de la CMN.

5. establecimiento de plantas experimentales y tratamientos

1. Sembrar plantas experimentales por siembra o trasplante en envases. Si siembra, espere hasta que todos los contenedores tienen una plántula germinada antes de retirar las plantas de tratamiento previo enfermera por recorte de sus brotes. Si el trasplante, clip de plantas de todo el tratamiento previo antes de trasplantar experimental para evitar efectos no deseados.
2. Establecer tratamientos CMN ya sea dejando los contenedores no se movió durante la duración del experimento (CMNs intactos) o girarlos semanal para separar físicamente hifas que se extiende entre los contenedores modificados (CMNs cercenadas; Figura 1A). Cuando cortar CMNs, gire cada contenedor a través de una rotación completa para evitar sin querer alterar las interacciones sobre tierra, particularmente para plantas heliotropismo.
3. Mucho agua todos los potes o microcosmos inmediatamente después de la rotación para restablecer el contacto entre el sustrato intersticial y los lados de los contenedores.

6. seguimiento de movimiento de nutrientes minerales a través de CMNs

1. Fertilizar las plantas vecinas con 0,5% ¹⁵N enriquecido KNO₃ y NH₄Cl.
2. Fertilizar el individuo blanco con un fertilizante de ¹⁴N de igual concentración.

7. monitoreo y mantenimiento del experimento

1. Regularmente (al menos cada mes) volver a desordenar las posiciones de las macetas o microcosmos en el transcurso del experimento.
2. Semanalmente medir el crecimiento, tales como altura o más largo hoja longitud (para gramíneas) para controlar cuando el crecimiento empieza a frenar, porque es importante cosechar antes de que las plantas se convierten en root-limite.

8. la cosecha del experimento

1. Enganche todo el tejido sobre el suelo y coloque plantas individuales en sobres marcados que identifican su tratamiento, pote o microcosmos y posición.
2. Tejidos sobre tierra secos a 60 ° C hasta peso constante. Medir el peso seco de cada tejido de la planta.
3. Permita que la tierra se seque antes de la extracción de los contenedores y recolección de las raíces.
4. Cepille delicadamente todo tanto del suelo como sea posible de los sistemas de la raíz y lavar en un recipiente de agua o bajo un chorro suave de agua sobre un tamiz de tamaño de poro de 250 micrones.
5. Permita que las raíces se seque al aire y pesar todo el sistema de raíz.
6. Clip sistema radicular al azar y guarde los fragmentos de raíz en etanol al 50%. Después de que se tiñen³³, utilizar estos fragmentos para la cuantificación de la colonización de la raíz usando el método de intersección de cuadrícula³⁴.
7. Volver a pesar el resto radicular y guárdelo en un sobre de papel rotulado para secar a 60 ° C para la evaluación del peso seco. Utilice la siguiente ecuación para calcular el peso de todo el sistema de raíz:

9. Análisis de isótopos estables y nutrientes minerales

1. Agrupar las plantas de semillero por biomasa en "deciles" o 10 grupos "octiles" o 8 grupos "cuartiles" o grupos de cuatro, etc. después de la fila-ordenándoles por peso si la cantidad de tejido es insuficiente para los requisitos mínimos de digestión determinar nutrientes minerales concentraciones.
2. Enviar muestras foliares a un laboratorio contratado para análisis de isótopos estables y nutrientes minerales (Tabla de materiales).
   1. Describir la abundancia isotópica, mediante la siguiente expresión habitual:
      
      donde R representa el ¹⁵N /¹⁴N proporción de una muestra o del estándar que es atmosférico N.
   2. Uso el no-modificado, tratamiento sólido envase para servir como un control para los cocientes de ¹⁵N de fondo en la siguiente ecuación de balance de masa al cuantificar la cantidad de ¹⁵N de una planta de destino en roto o intactos tratamientos CMN:
      
      donde δ¹⁵N representa la abundancia isotópica de objetivos, vecinos y las plantas en el no tratamiento de CMN, y x representa (como una fracción decimal) el nitrógeno por ciento obtienen por la planta de destino de los envases de vecino que se añadió la etiqueta. Se obtienen valores δ¹⁵N_vecinos de vecinos compuestos de la planta de cada destino.

Para determinar cómo CMNs pueden influir el rendimiento de la planta a través de la partición de nutrientes, crecimos Andropogon gerardii Vitman, una hierba de la pradera dominante, en un experimento de planta objetivo con 6 vecinos equidistantes e intacto, cortado o no CMNs. Encontramos que cortar o impedir CMNs disminuido peso seco parte aérea de objetivos (figura 2), sugiriendo que intacto CMNs promovieron el crecimiento de la planta. Plantas cortadas CMNs y prevenidos CMNs respondieron notablemente similar a sus tratamientos, lo que sugiere que la rotación de los contenedores una vez por semana fue exitosa en la mitigación de los efectos de CMNs. El tratamiento de CMN cortado, sin embargo, puede ser recomendado: como un control dado que la malla de nylon (que fue cubierta por una membrana hidrofóbica en este experimento) en tratamientos intactos y cortadas puede afectar dinámica del agua como el suelo de contenedores ranurados (rotado o no) más rápidamente que en contenedores no modificado de secado.

Competencia, en el que el crecimiento de un individuo suprime el crecimiento del otro como individuo, fue detectada en el tratamiento de CMN intacto pero no en la cortada o no tratamientos de CMNs. Encontramos que solamente cuando estaban intactos CMNs blanco y tamaños vecino sumados tienen una relación negativa como se demuestra por la regresión lineal (figura 3). La cortada y no tratamientos CMNs no difirieron entre sí, y juntos, sus pendientes no difirió significativamente de cero. Por lo tanto, difieren significativamente de la pendiente negativa del tratamiento CMNs intacto (figura 3). Además, se encontró que los coeficientes de Gini, una medida de la desigualdad de tamaño que va de cero a uno en que cero refleja una distribución perfectamente igual tamaño, diferenciada entre tratamientos. El tratamiento de CMNs intacto tuvo la mayor desigualdad^10,35,36. Las desigualdades de tamaño son afectadas por la competencia dentro de las poblaciones, especialmente cuando los individuos grandes dominan la adquisición de recursos, tal modo desproporcionadamente suprimiendo el crecimiento de individuos pequeños, también conocido como competencia asimétrica^{37 , 38}.

Si nutrientes minerales eran limitantes de crecimiento, y si CMNs contribuyeron a la intensificación de la competencia por los nutrientes se determinó mediante comparaciones de concentraciones de tejido foliar de nutrientes minerales versus tamaño de la planta. De todos los nutrientes minerales evaluados, encontramos que sólo Mn hoja tejido concentraciones fueron asociadas positivamente con el peso seco parte aérea de la planta objetivo sobre todos los tratamientos, sin diferencias significativas entre las pendientes, lo que sugiere que puede haber limitado Mn crecimiento entre todos los tratamientos (figura 4). Sin embargo, elevaciones de la línea de regresión, que sugieren diferencias en las concentraciones medias entre tratamientos, fueron afectados por cortar la CMN y prevención. Significa que las concentraciones foliares de N no fueron afectadas significativamente por los tratamientos de CMN, pero la concentración de N disminuyó significativamente con el peso de las plantas, sugiriendo un potencial "efecto dilución del tamaño de la planta en tejido N^39, seco de parte aérea ⁴⁰. por lo tanto, N no era probablemente el nutriente mineral limitación de crecimiento en nuestro experimento. En otro experimento similar, significa P foliar fue afectada significativamente por el tratamiento del CMN, pero también mostró un efecto de dilución, comparado con el tamaño de plantas intactas de CMNs³⁵la planta.

Para examinar si CMNs diferencialmente partición de nutrientes minerales entre individuos interconectados, se evaluó el tejido de la planta de destino de ¹⁵N en tejidos de la hoja versus tamaño de la planta. Habíamos añadido ¹⁵N-etiqueta sólo a los contenedores de vecinos. Encontramos que las plantas con CMNs intactas tenían concentraciones más altas de ¹⁵N en comparación con ambos tratamientos, que no difirieron entre sí (figura 5A). Aunque peso seco parte aérea destino se asoció con la cantidad de nitrógeno obtenida de contenedores de vecinos sobre los tratamientos de CMNs intactos y cercenados, CMNs intactos tenían una pendiente fuertemente positiva, significativamente diferente de la de las CMNs cortadas tratamiento (figura 5B). Estos resultados sugieren que plantas grandes, potencialmente con abundante fotosintatos, obtienen más ¹⁵N CMNs alcanzando a las vecinas contenedores de individuos blanco pequeño. Nuestros resultados también sugieren que la membrana hidrofóbica previno con éxito agua libre (y posterior ¹⁵N) movimiento dentro de macetas.

En otro experimento de la planta de núcleo gira destino, plántulas de árboles de guayabo (Psidium guajava) fueron cultivadas en plántulas grandes contenedores encajados grandes ollas, y todos (incluyendo las macetas grandes) fueron llenados con el mismo suelo relativamente ricos en nutrientes mezcla. Cuando CMNs se cortó por la rotación en la ausencia de vecinos, crecimiento de las plantas disminuyó significativamente para el mismo tamaño que las plantas en envases sólidos, sugiriendo que plantas giradas simplemente habían reducido acceso al volumen completo del suelo de las macetas grandes (figura 6 ). Cuando las plantas tenían un número de vecinos, tamaño de la planta se redujo a tamaños similares, y cualquier efecto estadísticamente detectables de cortar CMNs desaparecieron (figura 6).

En un experimento de campo con rotación-corazones hechos de tubo de PVC, uno de nosotros investigó la influencia del micelio extra-radical sobre el rendimiento de la planta en un experimento de campo con plántulas de jaboncillo (Sapindus saponaria L.) (figura 7). Aunque el micelio extra-radical más allá de tubos tenía poco efecto en el crecimiento de las plantas durante el experimento de trece meses, cortar por la rotación de tuberías había reducido foliar N, P y Cu concentraciones substancialmente (por 25% o más).

Figura 1. Experimentar la instalación de contenedores en intacto, cortada, o tratamientos de control (A), macetas, en una planta de destino experimento (B), o microcosmos con un hexagonal (C) o cuadrado (D) diseño de envases. Manchas ovales en contenedores modificados son una abertura en el recipiente cubierto con una malla de nylon de 40 μm de hifas de los hongos penetrar (A). Redes mycorrhizal comunes permanecen intactas con la no rotación de los envases, se cortó por rotación o se impiden establecer con un recipiente de plástico sólido (A). En un experimento de olla planta de destino, contenedores pueden colocarse en un fondo de espuma que les (B) posiciones. Para un experimento de microcosmos, el fondo puede por puesto hacia fuera en una matriz hexagonal con seis equidistantes, vecinos de cada destino individual más cercanos (C), o en una matriz cuadrada con cuatro vecinos más cercanos y otros cuatro, un poco más distante, diagonal vecinos de cada destino (D). Panel B es modificado de Weremijewicz et al¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Significa (± SE) subterráneas y sobre tierra secan pesos (g) de los individuos de Andropogon gerardii de destino entre los tratamientos micorriza red común. Peso seco parte aérea se muestra como valores positivos por encima de la abscisa y pesos secos soterradas son valores positivos por debajo de la abscisa. Barras de peso seco parte aérea rematados por la misma letra no son diferentes por prueba de post hoc de diferencia honestamente significativa de Tukey en ɑ = 0.05. Pesos secos subterráneas no difirió entre tratamientos y por lo tanto, no están encabezadas por letras. Esta figura es modificada de Weremijewicz et al¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Vecino total (g) versus destino planta aérea peso seco (g) plantas de Andropogon gerardii de. Plantas con intactas redes de micorrizas comunes (CMNs) están representadas por triángulos oscuros y una línea sólida, con CMNs cercenadas por plazas gris y una línea discontinua y no CMNs por diamantes blancos y una línea de puntos. Esta figura es modificada de Weremijewicz et al¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Objetivo peso seco parte aérea (g) versus las concentraciones de manganeso foliar (μg·g^-1) de Andropogon gerardii. Plantas con intactas redes de micorrizas comunes (CMNs) están representadas por triángulos oscuros y una línea sólida, CMNs cercenadas por plazas gris y una línea discontinua y no CMN por diamantes blancos y una línea de puntos. Esta figura es modificada de Weremijewicz et al¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Δ¹⁵N (‰) ± SE de individuos de Andropogon gerardii de destino (A) con intactas redes de micorrizas comunes (CMNs; barras negras), no cortó CMNs (barras grises) y CMN (barras blancas) y el nitrógeno por ciento obtuvo del vecino recipiente suelo por las plantas con CMNs intactos ambiente sol (triángulos) o sombra (cuadrados grises) versus peso seco parte aérea destino (g; B). bares rematados por la misma letra en el panel A no diferencian por prueba de post hoc de diferencia honestamente significativa de Tukey en ɑ = 0.05. Estas cifras son modificadas de Weremijewicz et al¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Significa (± SE) subterráneas y sobre tierra secan pesos (g) de individuos de Psidium guajava de destino entre redes mycorrhizal comunes (CMNs) y tratamientos de vecino. a lo largo de la abscisa, a ningún tratamiento de vecino está representado por "0N", un vecino por "1N", etc., mientras que un tratamiento de control con ningún CMNs (envase sólido inoculado y no hay vecinos) está representado por sombreado claro y la letra "C". Biomasa de las plantas con CMNs intactos están representados por barras sólidas, mientras que aquellos con CMNs cortadas hachured. Peso seco parte aérea se muestra como valores positivos por encima de la abscisa y pesos secos soterradas son valores positivos por debajo de la abscisa. Barras con la misma letra no difieren en la prueba de post hoc de diferencia honestamente significativa de Tukey en ɑ = 0.05. Peso seco parte aérea y las del tratamiento control sólo fueron comparado con tratamientos de CMN intactos y cortados con los no vecinos (indicados por letras griegas) porque el control no incluye a vecinos como un factor adicional en el tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Extensión del método base rotada para un experimento de campo (A) y representante de 13 meses de edad Sapindus saponaria L. plántulas con intacto (no rota) y redes mycorrhizal comunes (rotadas) (B). Tubos de policloruro de vinilo (9 cm diámetro x 20 cm de altura) se perforaron con un serrucho para tener cuatro orificios de 5,3 cm de diámetro en dos pares opuestos. Los huecos se cubrieron con una malla de serigrafía de nylon con poros μm 30 a través de la cual micelio extra-radical podría extenderse desde y en los corazones que se llenaron con suelo del sitio de siembra (A). Redes mycorrhizal comunes se mantuvieron intactos o cortadas por rotación con una llave de tubo grande. Posiciones de emparejado girada y no girar los corazones (unos 20 cm de separación) están marcados por las banderas cada 2 m a lo largo de cinco transectos en la parcela experimental ubicada en una arboleda de lichi (A). Se muestra evidencia de la alteración de micelio extra-radical reducción de N, P y Cu absorción por las plantas cloróticas con la etiqueta de "gira" se muestra en B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados afirman que nuestro método de núcleo girar bruscamente puede centrarse en el papel de CMNs en las interacciones de las plantas. Hay varios pasos críticos en el protocolo, sin embargo, que si alterado, tienen potencial para influir en la capacidad de detectar efectos CMN. Es fundamental para llenar los recipientes circundantes área intersticial con un medio pobre en nutrientes. En nuestro experimento de planta objetivo fracasado, núcleo rotado con plántulas de árboles de guayaba, aunque hubo una reducción marcada del crecimiento de la blanco en presencia de cualquier número de vecinos, efectos sobre la competencia de las CMNs no fueron detectados, probablemente causa de disponibilidad de nutrientes minerales en las macetas. En contraste, el uso de un medio pobre en nutrientes entre núcleos girados asegura que hifas deben llegar a los vecinos los contenedores a menudo están llenos de hifas y raíces (especialmente cuando se trabaja con las hierbas de raíz-intensivos). Extra-radical hifas en recipientes vecinos así en competencia directa con sistemas de raíces y deben partición de nutrientes minerales de estos 'parches' entre plantas conectadas a un CMN. Otro componente crítico en la fabricación de las interacciones detectables es evitar la competencia aérea. Nuestro experimento de guayaba reveló que esencialmente se elimina el efecto de acceso de volumen de suelo más evidente cuando las plantas no hay vecinos cuando plántulas de destino eran sombra de los vecinos. Utilizando gramíneas que crecen en su mayoría verticalmente, o coronas de hojas de plántulas para evitar superposición de restricción ayudaría a mitigar las interacciones sobre tierra.

El uso de envases algo en vez de bolsas de malla, es fundamental en el mantenimiento de una larga experiencia con facilidad de CMNs seccionamiento mediante rotación. En una tentativa temprana en un experimento CMN, tratando de tirar un cuchillo entre bolsas de malla para separar CMNs no sólo dio lugar a bolsas dañadas que las raíces podrían sobresalir pero también parecían favorable aumentar la aireación del suelo resultando en crecimiento vegetal mejorado dramáticamente cuando CMNs se cortó. Porque el enfoque de núcleo rotado suavemente mueve cada envase en una posición invariable (gracias a los orificios de posición favorable en la parte inferior de la olla o microcosmos), minimiza la interrupción de sustrato circundante y posible aireación. Sin embargo, es absolutamente crítico, fondo del agua las macetas después de la rotación de los contenedores para volver el sustrato arena intersticial, de baja fertilidad estrechamente en contacto con los envases.

El método propuesto base rotada puede ser modificado en un número de maneras de responder a una variedad de preguntas sobre el funcionamiento de las CMNs y micelio extra-radical. Por ejemplo, puede reducirse la cantidad de carbono disponible para las plantas del anfitrión proporcionar CMNs por sombreado¹⁰. Paño de la cortina envuelto alrededor de protectores de semilla modificada para rodear a los envases individuales era acertado en la reducción de carbono provisioning a CMNs y por lo tanto, la absorción de ¹⁵N de CMNs¹⁰. Además, la estructura de la población puede ser investigada en microcosmos grande (figura 1, D) que comprende muchas plantas, cada una en un recipiente individual, rotado. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que se debe tener cuidado para evitar pseudoreplication⁴¹ al hacerlo. Las plantas individuales son sin duda no 'Replica' porque no son independientes de las otras plantas en un microcosmos. En cambio, toda la unidad experimental (olla o microcosmos) es una repetición, razón por la cual utilizamos tamaños de planta vecino promedio o danados por maceta antes de ejecutar el análisis de varianza o regresiones lineales.

Nuestro enfoque puede modificarse para que estudios de campo excluir la competencia de raíz e investigar la influencia de CMNs intactos. Por sustituir los contenedores con piezas de tubo de PVC con orificios cubiertos con serigrafía de nylon del acoplamiento, girar los corazones pueden soportar condiciones duras, como en el experimento de jaboncillo. Similar a nuestro experimento de pote de guayaba, sin embargo, el efecto de cortar CMNs potencial podría no distinguirse simplemente restringir el volumen de suelo de que se podían adquirir nutrientes minerales.

Nuestro enfoque proporciona una comparación controlada, cuidadosa de plantas interactuando a través de CMNs versus plantas micorrizadas que persistentemente no están interconectadas (en vez de carecer totalmente de micorrizas de plantas). Por lo tanto, imita los aspectos de la naturaleza, como plantas de semillero unirse a establecido CMNs, así como el uso de un conjunto de hongos AM. Trabajo reciente ha demostrado que diversas especies de hongos AM pueden ser socios de calidad diferentes a las plantas, y que la presencia de una segunda especie de hongo de AM en un sistema de raíz puede inducir una especie de hongo 'falta' para proporcionar más fósforo a cambio de carbono que cuando solamente en el sistema radicular⁴². Por otra parte, diferentes especies de hongos pueden proporcionar beneficios que no sean de adquisición de nutrientes minerales a anfitriones, tales como sequía y tolerancia a la salinidad o protección contra patógenos². Estos resultados subrayan la importancia de la utilización de un conjunto de hongos establecer CMNs. a pesar de su realismo, una visible limitación de nuestro enfoque es la duración del experimento. El tamaño de los recipientes o tubos de PVC limita la longitud del tiempo antes de que plantas se convierten en destino de raíz y así tiende a restringir el foco únicamente plántulas o árboles jóvenes. Sin embargo, nos sometemos a que existe una considerable flexibilidad en el diseño de experimentos de núcleo gira destino planta en la que uno o ambos objetivos y vecinos pueden ser manipulados en una amplia variedad de formas de entender los roles de CMNs.

Los autores no tienen nada que revelar.

Nos gustaría agradecer a los revisores anónimos por sus sugerencias. También agradecemos a los numerosos estudiantes que han ayudado con la construcción de botes, microcosmos y ranurado contenedores y que han contribuido con el mantenimiento y recolección de experimentos. También agradecemos a North Central College para inicio fondos (JW) y actuales instalaciones, así como Ashley Wojciechowski para la obtención de North Central College Richter becado apoyando un experimento usando estos métodos. Parte de este trabajo fue financiado por una nacional ciencia Doctoral disertación mejora subvención de la Fundación (DEB-1401677).