Спонтанное и вызвали меры боли в мышиных моделях боли колена Monoarticular

Мы разработали вызвала мера боли артрита и его в сочетании с стандартный метод измерения спонтанной боли в разных мышиных моделях химически индуцированных артрита. Эти меры являются чувствительными и воспроизводимые для различных видов боли в суставах.

Боль является основной причиной инвалидности от артрита. В настоящее время существует неудовлетворенная потребность в адекватных методов лечения боли артрита. Доклинические модели являются необходимым и полезным для изучения механизмов боли и для оценки эффективности лечения артрита. Измерение боли в животных моделях артрита является сложной задачей. Мы разработали методы для измерения вызвала и спонтанной боли в трех моделях мышиных артрита. Мы quantitate ответов вызвала боль мышей подвергали фирмы пальпации болезненные колено. Мы также оценить спонтанной боли, доля вес и количество времени, на каждой из их 4 конечностей после индукции боли артрита в одном колене. Боли в суставах в этих моделях мыши производит значительное увеличение ответов вызвала боль и изменение веса подшипника. Поскольку мышь четвероногих, они разгрузки болезненной конечностей контралатеральной конечности, Передние конечности, или некоторые комбинации. Эти методы являются простыми, требуют минимального оборудования и воспроизводимость и чувствительные для обнаружения боли. Они полезны для изучения Болезнь модифицирующие артрит лечения и обезболивания при мышей.

Боль является основной причиной инвалидности от артрита^1,2. В настоящее время доступны анальгетиков часто являются неэффективными, токсичных и потенциально способствовать общенациональная наркотических проблема³. Операции не всегда является альтернативой для конечной стадии артрита, особенно в пожилом возрасте, которые могут иметь несколько сопутствующие заболевания. Внутрисуставные стероидов и viscosupplementation может быть эффективным в начале болезни, но обычно теряют свою эффективность в конце стадии болезни⁴. Существует большой неудовлетворенная потребность в эффективных анальгетиков для боли артрита, которая не может решаться с в настоящее время доступных методов лечения.

Доклинические модели полезны для понимания механизма действия лечения боли и прогнозирования ограничения токсичности, но боль измерения в животных является сложной задачей,⁵. Боли могут быть прямые и спонтанного (статический или динамический вес подшипника, ноги осанка, походка анализа, спонтанное движение и механических или тепловой чувствительностью) или косвенные/вызывали (тест Снятие задних конечностей, силы сжатия колена или томографии головного мозга) ⁶. легкие формы monoarthritis, анализа походки нечувствительна и не хватает согласованности⁷. Статический вес подшипника полезен для измерения боль в крыса гомотерия, но может быть трудным для мышей. Механический чувствительность таких мер, как фон Frey тест косвенно выявления сенсибилизации пусковая площадка ноги в параметре колена артрита, но не непосредственно измерить боль колена и громоздки для выполнения. Колено растягивающее усилие как измеряется с устройством абстрагироваться. (измерение давления приложения) могут быть использованы в крыс, но большое устройство сложно использовать в мышей без производить негативное поведение, которое не обязательно отражает боль⁸.

Мы разработали методы для измерения спонтанной и вызвала боль в трех различных моделях мышиных артрита, которые чувствительны и воспроизводимость измерения тяжести боли и обезболивающий эффекты внутрисуставных терапии^{9, 10}. Мы также можно соотнести боли с другими гистологических маркерами боль и экран исследуемых препаратов, которые не удастся в организме человека. Мы можем оценить синергизм скромно эффективных анальгетиков для выявления более эффективных комбинированной терапии. Используя проверенные методы для вызвала и спонтанной боли, мы избежать неспособность определить боль, которая отражается в одном типе боли поведение, но не другой и более тесно зеркало боли измерения в людей¹¹. Ограничивая боль оценки двух методологий, мы сводим к минимуму стресса на животных, которые могут повлиять на поведение боль и максимизировать производительность лаборатории.

Все животные процедуры и протоколы были одобрены Миннеаполис ветеранов вопросам здравоохранения системы (VAHCS) институциональные животное уход и использование Комитета и соответствует «Руководство для ухода и использования лабораторных животных» (Национальный академический пресс, США) ¹².

1. Выбор животных

Примечание: Для всех трех моделей артрита используются C57Bl6 мышей.

1. Использование мужского или женского пола мышей, но обратите внимание, что ответ на артрит боли может варьироваться в зависимости от пола и патогенезе модель тестируется.
2. Выберите мышей, которые достигли половой зрелости, больше не быстро растет и не достаточно стар, чтобы разработали спонтанное артрита, который мог посрамить боль измерений.
   Примечание: Двенадцать недель является идеальный возраст для боли измерения в модели, описанные, но это зависит от дизайна исследования. Возраст начала артрита зависит от продолжительности времени, необходимое для разработки модели. Острые воспалительные артрит (модель Каррагинан) требует 3 h развивать, поэтому животные 12 недель возраста во время индукции. Хронические воспалительные артрит (CFA модель) требует 3 недели развивать, поэтому животные 9 недель, в то время индукции. Хронические дегенеративные артрит (коллагеназа модель) требует 4 недели для разработки, поэтому животных, 8 недель в то время индукции. Модель более хронические дегенеративные артрит может использоваться, вызывая артрит в возрасте 6 недель. Это позволяет 6 недель развития повреждения суставов. Однако хронические дегенеративные артрит мышей не производят значительные вызвала боль.
3. Получите животных от источника национальной коммерческой заводчик.
4. Дом животные в группах до 8 животных в клетках стандартных поликарбоната с ad libitum грызунов диеты и воды.
5. Поддержание экологических условий при 72 ° C ± 1 ° C и 33% ± 1% влажности с 12 h свет/темно циклов.

2. внутрисуставные инъекции в колене

1. Создайте стерильные 30 G 2,5 мм, эффективная длина иглы 0,5 дюйма с оболочкой, изготовленной из полиэтиленовых труб с внутренним диаметром 0,38 мм и внешним диаметром 1,09 мм, оставив только 2,5 мм выступающих иглы. Это предотвращает слишком глубоко вставляя иглу и выход из сустава кзади.
2. Выберите один колено, чтобы придать, побрить его с помощью любого коммерчески доступных электрические лицевые волос триммер и стерилизовать providone йод скрабом.
3. Анестезировать мышь с 3% изофлюрановая в 100% O2 в 1 Л/мин для 3 мин ± 1 мин поддержания анестезии с помощью ураном во время процедуры. Подтвердите глубины анестезии, мыс пинча. Позаботьтесь, чтобы контролировать состояние дыхательной и свести к минимуму воздействие анестезии для поддержания адекватного дыхания.
4. Введите совместных на средней линии через коленного сухожилия, просто уступает по нижнему краю коленной чашечки, используя стерильные иглы ножнах, после того, как мышь полностью под наркозом. Этот подход передней срединной линии увеличивает точность ввода Объединенной и инъекционных исследуемого вещества.
5. Используйте тот же подход для парентерального введения вещества, вызывающие артрит и обезболивающее вещества. Фиктивные элементы изготавливаются вставляя иглу как выше, но без инъекций любого вещества.

3. производство артрита

1. Анестезировать животных как в шаге 2.3 выше.
2. Взвешивать соответствующие суммы (см. ниже) каррагинан, полный Фройнд адъювантов и тип IV коллагеназы и разбавляют до соответствующей концентрации с физиологическим в Ламинарный шкаф для безопасности и стерильности.
3. Придать 10 мкл 2,5% каррагинан, разводят в 0,9% стерильного физиологического раствора в колено как выше с помощью шприца Гамильтон производить острого воспалительного артрита. Артрит пики 3 ч после инъекции.
4. Внедрять, 30 мкл (30 мкг) из полного Фройнд адъювантной (CFA) в колено производить хронического воспалительного артрита. Есть первоначальный острой воспалительной фазы, что пики на 1 неделе затем хронической фазы, что пики на 3 недели после инъекции.
5. Придать 10 мкл, содержащие 10 МЕ типа IV коллагеназы производить хронические дегенеративные артрит. Артрит боли пики 4 недели после инъекции.

4. Измерение вызвала боль в суставах

1. Всегда проверьте нормальной компаратора колена сначала для того, чтобы свести к минимуму боль кросс за ответ (заводную) от болезненные колено¹³.
2. Поезд экзаменатора чтобы применить последовательное и твердое давление 700 gf/см² = 10 собаки, с помощью Palpometer уровень 4; устройство будет излучать 4 звуковых сигнала, когда этот уровень давления применяется. Это количество давления последовательно вызовет большую ответ боль от артрита, совместные чем от нормальной совместной.
   Примечание: Прибор откалиброван на заводе, чтобы выявить 4 звуковых сигнала, когда применяется соответствующий уровень давления. Использовать устройство для обучения только; не используйте на животных, но при изучении животных, применить количество давления, извлеченных посредством профессиональной подготовки.
3. Сдерживать мыши достаточно плотно, чтобы предотвратить случайные движения, удерживая загривок шеи с указательным и большим пальцем и с помощью 4-^й и 5-^й пальцы сдерживать хвост. Мыши должны быть в состоянии сделать дискретных, краткие движений с усилиями и при стимуляции, но не должны быть в состоянии двигаться свободно или непрерывно.
4. Администрировать неоднократные фирмы palpations (Palpometer уровень 4) одновременно в боковых и медиальной стороны каждого колена на приблизительно совместной линии с большим и указательным пальцами свободной руки раз в секунду на одну минуту запрещая мыши. Не используйте Palpometer для мыши экспертизы; Он используется только для обучения.
5. У второй наблюдатель подсчитать количество раз животное вокализов и борется, чтобы избежать сдержанность в этот период времени одну минуту. Оценка боли вызвала сумма боев и вокализации.
6. Всегда нам же экзаменатор всей учебы и подтверждение эксперта и наблюдателя ослепил относительно экспериментальных условие.

5. Измерение спонтанной боли в суставах.

Примечание: Расширенный с учетом динамических данными веса (ADWB) устройство вычисляет процент общего времени, которое животное проводит на каждой конечности и процентов общего веса на каждой конечности.

1. Заполните пластиковый стакан с 2 Л воды. Место пены колодки и Древесноволокнистая плита средней плотности, включенных в оборудование вместе с заполненной стакан на лабораторных и запишите вес.
2. Открыть программу «ADWB» и выберите тип датчика мыши .
3. Калибровка системы до каждого эксперимента:
   1. Выберите Полная калибровка под меню калибровки . Введите 0.00 в качестве тары значение и вес пены колодки, Древесноволокнистая плита средней плотности, пластиковый стакан и воды как вес калибровки, затем выберите следующий.
   2. Выберите тары до размещения ничего на датчик. Прежде чем выбрать получить предварительный просмотр, покрывают датчик колодки с предоставленного пенопластовую прокладку, Древесноволокнистая плита средней плотности и пластиковый стакан, наполненный 2 литра воды, в этом порядке. Выберите получить предварительный просмотр после калибровки вес на датчик.
   3. Выберите получить определение, отрегулируйте вес калибровки так, чтобы она равномерно распределяется по всей отдельных датчиков, и когда значение калибровки индикатор над 95. Этот процесс создает нормализованную означает для отдельных датчиков и подтверждает целостность отдельных датчиков. Наконец нажмите кнопку Далее.
   4. Сохраните файл калибровки в папку калибровки.
4. Выберите создать и, где это предусмотрено, введите имя проекта и имя животного для первого мыши проверяемое.
5. Выберите Обзор и открыть файл калибровки, который был создан для проекта. Выберите следующий, включить захват видео выбран, и нажмите кнопку OK.
6. Вес животного, выберите захвати запишите вес в программном обеспечении. Нажмите кнопку ОК.
7. Не акклиматизироваться мышей в камеру, до сбора данных, потому что это устройство измеряет спонтанного поведения.
8. Поместите мышь в камере в течение 5 минут тестирования. Когда животное находится в камере выберите Запуск. Программное обеспечение будет записывать деятельность животных в это время, захвата видео и синхронизации с данными датчика и автоматически разделить это видео на анализируемые и не анализируемые сегментов.
   Примечание: Программное обеспечение считает сегментов анализируемые при обнаружении по крайней мере один стабильной зоны. Стабильной зоны создается, когда датчики обнаруживают ≥2 g на одного датчика с минимум один прилегающих датчик обнаружения ≥1 g и распределение веса зоны при стабильным для более чем 0,38 s.
9. До первого анализа в серии выберите Easy забив и независимых лапы параметр.
   Примечание: Easy забив позволяет проверки итерации сегментов, где стабильной зоны не меняется на основе проверки первой стабильной зоны этого сегмента. Независимая настройка лапы обеспечивает наблюдателя с доступом к сочетаниям клавиш, которые позволяют отдельным идентификации каждой лапой. Наблюдателя назначает зон, которые отвечают минимальным критериям как правый задние, оставил задних, правый передний план, оставил носовой, передними лапами, другие части тела или игнорировать зоны с помощью сочетаний клавиш, удерживая курсор над сегментом в видео и масштабированное Карта активирована датчики.
10. Выберите >> для перемещения к первой анализируемые сегмента. Если стабильной зоны не имеют правильный лапы определены затем удерживайте курсор над этой зоной и нажать клавиш (право Хинд, s; левый лань, ; право передний, w; левый передний план, q; оба передних лапах, e; другой раздел тела, z, игнорировать зоны, x) что соответствует части тела правильным.
    Примечание: Не менее 1,5 мин анализируемые времени требуется для удовлетворения анализа порогов. Проанализированы сегменты добавляются и автоматически в среднем для вывода на paw(s) программного обеспечения.
11. ADWB программное обеспечение затем автоматически вычисляет процент анализируемого времени потратил и процент веса тела (g) на каждый из вариантов, четыре конечности. Экспортируйте эти значения в новую таблицу, выбрав результаты, экспорта, выбрав Да с просьбой оперативно вопрос, если только первые пять кратких линии должны быть экспортированы и выбрав местоположение вывода.
12. Усыпить животных вдыханием CO2, следуют торакотомией в конце периода исследования.
13. Для каждого дополнительного животного в той же группе выберите пункт создать и введите уникальное имя животного, но не изменяйте имя проекта. Выберите следующий, включить захват видео выбран, и нажмите кнопку OK. Выполните шаги 5.5 для 5.12 что касается первого животного.

Острые и хронические воспалительные и хронических дегенеративных боли в суставах был продюсирован IA инъекции в левом колене мужские и женские мышей C57BL/6J до боли оценки с использованием протокола, изложенные выше. Боли в суставах была измерена как вызвала боль ноты (EPS) и поведение спонтанной боли измеряется с устройством расширенный динамический вес подшипника (ADWB). Для целей настоящего доклада отдельные сравнения были сделаны с помощью тестов t студента. Для экспериментов, где сравниваются болеутоляющее дозы ANOVA может быть более подходящим статистического сравнения.

EPS (сумма совпадали драк плюс вокализации) увеличилось со всеми тремя типами боли в суставах (рис. 1). ADWB мер процент веса подшипника на левой задних конечностей, по сравнению с наивными мышей были сокращены в острые и хронические воспалительные боли в суставах. Женщины, но не мужчин с хроническими дегенеративными совместные боли (COL) показали аналогичные сокращения в ADWB мер (рисA). Мужчины с острые воспалительные боли в суставах переданы Передние конечности чем наивно животных больше веса. Вес подшипника на передние конечности, увеличилось в самок мышей, по сравнению с наивным, но не в мужчины с хроническими дегенеративными боли в суставах (COL) (рис. 2B). ADWB мер процент времени на пораженной конечности левая hind сократилось по сравнению с наивными мышей с острые и хронические воспалительные боли в суставах, но это не было статистически значимым. Эти животные значительно меньше времени на левой задние конечности чем на правой задних конечностей. В обоих мужчин и женщин с хроническими дегенеративными боли в суставах нет никакой разницы в времени, затрачиваемого на левой задних конечностей по сравнению с наивными. Самки с хронические дегенеративные боли в суставах, тратят больше времени на nonarthritic правой задних конечностей, по сравнению с наивными (рисA). Мышей с острой воспалительной совместной боли и женщины с хроническими дегенеративными боли в суставах, значительно больше времени на передние конечности чем наивно животных (рис. 3B).

Рисунок 1 . Вызвала боль ноты для левой (синий столбец) и право (красный столбец) задних конечностей. Правый задние конечности служил внутреннего контроля и не претерпела каких-либо IA инъекции. Измерения были проведены в следующих условиях: uninjected наивно (мужчины и женщины), острые воспалительные Каррагинан индуцированной артрит (CAR), хронические воспалительные Complete Фройнд в адъювант индуцированной артрит (CFA) и хронические невоспалительные Коллагеназы индуцированной артрит (COL - мужские и женские). В наивной животных EPS задних левого колена не было статистически отличается от права мужчин и только минимально разные, у самок (**P = 0,038) скорее всего из-за некоторых увеличение ответ боль в колене рассмотрел второй (слева) из-за кроссовера боли ответ. Во всех группах артритом суставов левого колена EPS был значительно больше, чем nonarthritic контралатеральной правого колена. При сравнении EPS левого колена артрита групп животных наивными, все артрит группы были значительно больше EPS баллы в артритом левого колена, по сравнению с наивными левой колени. Это было верно в мужчин и женщин. P < 0,05, по сравнению с мужской наивными, #P < 0,05 по сравнению с женской наивными. Все планки погрешностей в SEM все цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Поведение спонтанной боли, измеряется процент веса на конечностей. (A) поведение спонтанной боли, измеряется общий процент веса на левой (синий столбец) и право (красный столбец) задних конечностей. В обоих животных мужского и женского пола наивными был никакого существенного различия между % веса на левой и правой задних конечностей. Самцов мышей с автомобиля и CFA индуцированной боли в суставах и самки с COL индуцированной боли в суставах родила значительно меньше веса на левой задних конечностей, по сравнению с наивными. P < 0,05, по сравнению с мужской наивными, #P < 0,05 по сравнению с женской наивными. (B) поведение спонтанной боли, измеряется общий процент веса на передние конечности. Мужчины с автомобиля индуцированной острой боли в суставах и самок с COL индуцированной хронической боли в суставах существует значительное увеличение веса на передние конечности. Это не было видно в мужчины с CFA или COL индуцированной боли в суставах. Наивные девушки, как правило, нести больше веса на передние конечности чем naïve мужчины (P = 0.02). Другие части тела, такие как хвост или крупу может нести дополнительный вес. Эти обычно минимален и не значительно способствовать пониманию болевой реакции и, следовательно, не отображаются. P < 0,05, по сравнению с мужской наивными, по сравнению с женской наивно и мужской 4 недели COL в передних конечностей weightbearing #P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: поведение спонтанной боли, измеряется процент времени потрачено на конечностях. (A) поведение спонтанной боли, измеряется общий процент времени, затрачиваемого на слева (синий столбец) и право (красный столбец) задних конечностей. Существует никакого существенного различия между правой и левой задних конечностей в мужских и женских наивно мышей в отношении времени, затрачиваемого на конечности. Самцов мышей с автомобиля и CFA вызванных артритом появился тратить меньше времени weightbearing с артритом левой задних конечностей по сравнению с наивным, но это не было статистически значимым и вероятно из-за увеличение изменчивости в эту меру в этих мышей. Существует значительная разница в этих животных, сравнивая справа налево, как правый задние конечности провел больше всего времени weightbearing чем слева. У женщин с COL вызванных артритом правый задние конечности был weightbearing большую часть времени, чем в наивных женщин. P < 0,05, сравнивая право налево, #P < 0,05 по сравнению с женской наивно и мужской 4 недели COL времени потрачено на передние конечности. (B) поведение спонтанной боли, измеряется общее количество времени потрачено на передние конечности. Мужчины с автомобилей вызванных артритом и женщины с COL вызванных артритом мышей затрачено значительно больше времени weightbearing на передней конечности, чем сделал наивные животных. Женщины наивно мышей провел больше времени чем мужчины наивно животных на передних конечностей. P < 0,05, по сравнению с мужской наивными, #P < 0,05 по сравнению с женской наивными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Измерение боли в суставах в доклинических моделях воспалительного артрита и дегенеративных заболеваний суставов является все более ценным инструментом для оценки новых процедур для боли артрита и восстановление функции сустава^9,10. Измерение боли поведение у мышей с хронических дегенеративных заболеваний суставов является сложной задачей. Как четвероногих они могут снизить нагрузку при болезненных конечности к любой комбинации трех конечностей или хвост. Снижение функции в одной конечности могут не отображаться как очевидно, как это в двуногих людей. Как охотятся животных, мышей имеют преимущество выживания для сведения к минимуму боль поведения.

Этот доклад показывает, что боли в суставах из различных патологических механизмов могут быть измерены в мышах с методами простой и относительно недорогой. Воспалительные боли в суставах вызывает большие изменения в весе, учитывая время и распределения и поэтому могут быть более чувствительны модель для обнаружения анальгезии. Однако, другие модели боли в суставах будет иметь важное значение при оценке новых потенциальных анальгетиков, поскольку механизмы боли инициирования и поддержания, вероятно, разные с различной патологией. Мы нашли различий в моделях разгрузки между мужчинами и женщинами и среди различных моделей боли артрита.

Важно признать, что там может быть бременем, а также гендерные различия в поведении боль в мышей^14,,1516. Известно также, что есть собственный штамм различия в боль порогов. Мы обнаружили, что у мышей C57/Bl6, самки продемонстрировала значительно более спонтанной боли поведения (увеличение веса и время на передние конечности) чем самцов мышей с хроническими дегенеративными боли в суставах (рис. 2 и рис. 3). Мы не определить стадии эструса для этих самок мышей, поэтому мы не можем сказать, является ли это было влияет на наши результаты, но другие определили, что этап течки не объяснить наблюдаемые различия в мышей C57/Bl6¹⁷.

Вызвала боль поведение чувствителен к всех видов боли в суставах испытания и имеет хорошую воспроизводимость. Важно, что эксперт обучается доставить последовательной, стандартизированные пальпации давление и использовать методы последовательной сдержанность, которые позволяет спектр поведения боли для обнаружения боль и анальгезии. Важно всегда изучить нормальной колена впервые свести к минимуму боль ответ в нормальной колена из-за эффекта кроссовер и увеличить разницу между нормальной и болезненные колено болевой реакции. С помощью второго наблюдателя для вычисления реакции боли, которые составляют САЭ необходим, чтобы экзаменатор фокусируется на последовательное пальпации и последовательно подсчитаны огласовок и драки. Это может быть необходимо практиковать метод сдержанность в частности обеспечить животное может адекватно реагируют на боль, но не слишком легко реагирует с тем, чтобы ослабить боль в ответ. Преимуществом измерения EPS является аналогом измерения совместная болезненность в человека пациентов.

Мы считаем, что эти методы являются превосходят существующие методы в том, что они непосредственно измерить боль из суставов колена мышей, они могут быть использованы в различных моделях monoarthritis боли, они включают в себя как спонтанное и вызвала боль ответы и относительно недорогой, но надежный и воспроизводимость. Как терапии разработаны для более эффективного лечения артрита, эти методы будет полезным для подтверждения ли лечение на самом деле эффективны для итоги самых отключение артрит, боль.

Наши методы имеют некоторые ограничения. Прежде всего EPS мера ограничено требованием для одного эксперта и наблюдателя и потребность в очень последователен технику. Меры вызвали боль более автоматизирован и не подлежат как различия между наблюдателя. Дальнейшее уточнение EPS меры могли бы включать автоматизированные методы подсчета вокализации в ответ на пальпацию, например с помощью ультразвуковой bat детектор для подсчета вокализации. Этот метод необходимо будет сравнить с нашей текущий метод для подтверждения чувствительность и специфичность, прежде чем он может быть широко реализована.

В целом мы описываем две различные боли поведение меры для количественной оценки боли в суставах у мышей. Прежде чем выбрать экспериментальной модели следует учитывать различия в гендерных и процедите. Меры вызвали боли требуют тщательной подготовки и последовательного осуществления экзаменатор. Как спонтанное и вызвала боль поведения рекомендуется оценить выраженность боли и функционального ограничения и должно использоваться для полностью оценить последствия новых потенциальных анальгетиков.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Финансируется Департаментом ветеранов дел заслуга премии 2 I01 RX000379-05.