Кишечная палочка-синтез белка на основе свободных клеток: протоколы для технологии, надежные, гибкие и доступные платформы

Этот протокол подробно шаги, расходы и оборудование, необходимое для создания E. coli-на основе клеточных экстрактов и реализовать в vitro реакции синтеза белка в течение 4 дней или меньше. Чтобы использовать гибкий характер этой платформы для широкого применения, мы обсуждаем условий реакции, которые могут быть адаптированы и оптимизированы.

За последние 50 лет свободных клеток синтез белка (СЛТ) стала мощной технологии осваивать транскрипционный анализ и трансляционная потенциала клеток в пробирке. Устраняя необходимость поддержания жизнеспособности клетки и устраняя сотовой барьер СЛТ был основополагающим для новых приложений в biomanufacturing традиционно сложных белков, а также приложений в быстрого прототипирования для Метаболический инжиниринг и функциональной геномики. Наши методы для реализации E. coli-платформе СЛТ позволяют новым пользователям для доступа к многим из этих приложений. Здесь мы описываем методы для подготовки экстракт обогащенного СМИ, недоумение колбы и воспроизводимый метод лизис перестраиваемый на основе sonication клеток. Этот экстракт может затем использоваться для выражения протеина, способных производить 900 мкг/мл или более супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в как раз 5 h от экспериментальной установки для анализа данных, учитывая, что соответствующий реагент запасы были подготовлены заранее. По оценкам запуска получения реагентов стоит $4500, которая будет поддерживать тысячи реакций по ориентировочной цене $0.021 за мкг белка, произведенного или $0.019 за мкл реакции. Кроме того методы выражения протеина зеркало легкость установки реакции, видели в коммерчески доступных систем за счет оптимизации готовые смеси реагентов, на долю от стоимости. Чтобы разрешить пользователю использовать гибкий характер СЛТ платформы для широкого применения, мы определили целый ряд аспектов платформы, которые могут быть настроены и оптимизированы в зависимости от имеющихся ресурсов и результатов выражения протеина желаемого.

Бесплатный мобильный синтез белка (СЛТ) стала технология, которая разблокирована ряд новых возможностей для производства белка, функциональной геномики, метаболический инжиниринг и более в течение последних 50 лет^1,2. По сравнению с стандартным в vivo белка выражение платформ, СЛТ предоставляет три основных преимущества: 1) клетки бесплатный характер платформы позволяет производство белков, которые бы потенциально токсичных или иностранных в ячейке^{3,4 ,5,6}; 2) инактивации геномной ДНК и внедрение шаблона ДНК кодирования gene(s) интерес канал все системные энергии в рамках реакции на производство белки интерес; и 3) открытый характер платформы позволяет пользователю изменять и контролировать условия реакции и композиции в режиме реального времени^7,,⁸. Такой непосредственный доступ к реакции поддерживает увеличение биологических систем с расширенной химия и окислительно-восстановительных условий для производства новых белков и тюнинг метаболических процессов^{2,9, 10}. прямого доступа также позволяет пользователю комбинировать СЛТ реакции с анализов деятельности в системе одного горшок для более быстрого дизайн строить тест циклов¹¹. Способность выполнять СЛТ реакции в малый объем капли или устройств на базе бумаги далее поддерживает усилия обнаружения высокой пропускной способностью и быстрое прототипирование^{12,13,14,15 ,16}. В результате эти преимущества и подключи и играй характер системы, СЛТ однозначно включен разнообразные применения биотехнологии такие как производство белков, которые трудно solubly Экспресс в vivo^{17, 18,19,20}, обнаружение заболевания^21,22,23, по требованию biomanufacturing^{18,24 ,25,26,27}и образование^28,29, все из которых проявить гибкость и полезность платформы клетки бесплатно.

СЛТ систем могут быть сгенерированы из различных сырой лизатов от обеих линий клеток прокариот и эукариот. Это позволяет для различных вариантов в системе выбор, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки в зависимости от интереса. СЛТ систем также различаются по времени приготовления, стоимости и производительности. Наиболее часто используются ячейки, что экстракты производятся из зародышей пшеницы, кролик ретикулоцитов, насекомое клетки и клетки Escherichia coli , с бытием наиболее экономически эффективных на сегодняшний день при производстве высокий объемный урожайность белка³⁰ . В то время как другие СЛТ системы может быть выгодным для их врожденной столб-поступательные изменения техники, новых приложений с помощью кишечной палочки-на основе техники способны преодолеть разрыв, создавая site-specifically фосфорилированных и гликозилированного белков на спрос^{31,,3233,34,35}.

СЛТ реакции могут выполняться в любом пакете, непрерывный обмен клетки бесплатно (CECF) или непрерывный поток свободных клеток (CFCF) форматы. Формат пакета является закрытой системой, время жизни которого реакции ограничена из-за уменьшения количества реактивов и накопление ингибирующее побочные реакции. Методы CECF и CFCF увеличить время жизни реакции и тем самым привести к повышенной объемной белка урожай по сравнению с пакетной реакции. Это достигается путем предоставления побочных продуктов синтеза белка необходимо удалить из реакции судна, в то время как новые реактивы поставляются в ходе реакции². В случае CFCF протеин интереса также могут быть удалены из реакционной камеры, в то время как в CECF, протеин интереса остается в реакционной камере, состоящая из^36,полупроницаемой мембраны³⁷. Эти методы являются особенно ценными в преодолении бедных объемные урожайности трудно Экспресс белков интерес^{38,39,40,,4142, 43}. Проблемы в реализации CECF и CFCF подходов, что 1) в то время как они приводят к более эффективному использованию механизма био ответственных за транскрипции и трансляции, они требуют особенно больших количеств реагентов, что увеличивает общую стоимость и 2) они требуют более сложных установок реакции и специализированного оборудования, по сравнению с пакетный формат⁴⁴. Чтобы обеспечить доступность для новых пользователей, протоколы описаного фокус на пакетный формат в реакционных объемов 15 мкл с конкретными рекомендациями для увеличения объема реакции на миллилитр масштаба.

Представленные здесь методы позволяют реализовать рост клеток, извлекать подготовки и пакетная установка реакции формат для е. coliнеспециалистов с основных лабораторных навыков (например, студентов)-на основе системы СЛТ. Этот подход является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступные наборы без ущерба для легкости установки комплекта основе реакции. Кроме того этот подход позволяет приложениям в лаборатории и на местах. При принятии решения о реализации СЛТ, новых пользователей следует тщательно оценить эффективность системах выражения протеина обычных для запуска инвестиций, поскольку СЛТ не могут быть выше в каждом конкретном случае. Описанные здесь методы СЛТ позволяют пользователю напрямую реализовать целый ряд приложений, в том числе функциональной геномики, испытания, производство белков, которые являются неразрешимыми в vivo выражение, а также поле высокой пропускной способности приложения, включая биодатчики и учебных комплектов для синтетической биологии. Дополнительные приложения, такие как метаболический инжиниринг, тюнинг белка выражение условий, обнаружение заболеваний, и масштабирования с помощью методов CECF или CFCF по-прежнему возможны, но может потребовать опыта с платформой СЛТ для дальнейшего изменения реакции условий. Наши методы сочетают в себе рост обогащенного СМИ и озадачен колбы, с относительно быстрым и воспроизводимые методами лизис клеток через sonication, а затем упрощенной установки реакции СЛТ, которая использует оптимизированные премиксы⁴⁵. Хотя методы клеточного роста стали несколько стандартизированы в этой области, методы для лизиса клеток варьируются в широких пределах. В дополнение к sonication общие лизис методы включают использование французской прессе, гомогенизатор, шарик загонщиков, или лизоцима и другие биохимические и физические нарушения методы^{46,47,48, 49}. с помощью наших методов, примерно 2 мл экстракт сырой клетки получены на 1 Л клеток. Это количество клеток экстракт может поддерживать четыре сотни 15 мкл СЛТ реакции, каждый производства ~ 900 мкг/мл репортер sfGFP белка из шаблона плазмида pJL1-sfGFP. Этот метод по цене $ 0,021/мкг производства sfGFP ($.019/мкл реакции), за исключением стоимости труда и оборудования (Дополнительные рис. 1). Начиная с нуля, этот метод может быть реализован в течение 4 дней одного человека и повторять что СЛТ реакции может быть завершена в течение часов (рис. 1). Кроме того протокол может масштабироваться объема для больших партий реагента подготовки в соответствии с потребностями пользователя. Важно протокола, представленные здесь может быть реализован специалистами лаборатории обучены не-такие как студентов, как он только требует основных лабораторных навыков. Процедуры, описанные ниже и сопровождающие видео были разработаны специально для повышения доступности E. coli СЛТ платформы для широкого использования.

1. средства массовой информации подготовка и рост клеток

1. 1 день
   1. Полоска E. coli BL21*(DE3) клетки от глицерина складе на плиту LB агар и проинкубируйте по крайней мере в 18 ч при 37 ° C.
   2. Подготовка 50 мл LB СМИ и автоклав решение на жидких цикла в течение 30 мин при температуре 121 ° C. Хранить при комнатной температуре.
2. День 2
   1. Подготовьте 750 мл 2 x YTP СМИ и 250 мл раствора 0.4 М Д-глюкозы, как описано в дополнительной информации.
   2. Наливайте 2 x YTP СМИ в газобетона 2,5 Л озадачен колбу и D-глюкозы раствор в стеклянной бутылке газобетона 500 мл. Автоклав оба решения на основе жидкого цикла для 30 мин при температуре 121 ° C.
   3. Убедитесь, что оба стерильные растворы хранятся при 37 ° C, если рост клеток выполняется на следующий день, чтобы увеличить темпы роста после прививки. Не следует сочетать решения до прививки.
      Примечание: Решения могут храниться при температуре 4 ° C для 1-2 d при необходимости, хотя 2 СМИ x YTP чрезвычайно подвержен загрязнению.
   4. Запустите на ночь культуры BL21(DE3), прививки 50 мл с одной колонии BL21(DE3), с помощью цикла стерилизации и стерилизации во избежание загрязнения LB СМИ.
   5. Место 50 мл BL21*(DE3) LB культуры в 37 ° C 250 об/мин, пожимая инкубатора и расти на ночь для 15-18 ч.
   6. Подготовить и простерилизуйте все материалы, необходимые для дней 3 и 4, в том числе: две бутылки 1 Л центрифуги, 4 x холодной 50 мл конические трубы (весят и записи масс трех) и многие 1.5 мл пробирок отцентрифугировать.
3. День 3
   1. Удаление 50 мл на ночь культуры BL21*(DE3) в LB от тряски инкубатора и измерить ОД₆₀₀ на спектрофотометр с помощью 1:10 разрежения с LB СМИ. Рассчитать объем ночь культуры необходимо добавить 1 Л средств массовой информации для начала ОД₆₀₀ 0.1 (к примеру, если ОД₆₀₀ 1:10 разрежения читается как 0.4, прививать 25 мл неразбавленного ОД₆₀₀ = 4.0 ночь культуры в 1 Л 2 x YTP G).
   2. Удаление утепленные 2 x YTP средства массовой информации и решения D-глюкозы из инкубатора 37 ° C наряду с 50 мл LB культуры. Тщательно используя стерильную методику, Залейте раствор Д-глюкозы в 2 x YTP СМИ (избегая сторон озадачен колбу).
      Примечание: Добавление D-глюкозы завершает рецепт для 1 Л 2 x YTPG.
   3. Поддержании стерильных, прививать 1 Л раствора 2 x YTPG с соответствующим объемом 50 мл культуры начать 1 Л культуры 0.1 ОД₆₀₀. Немедленно переведите привитых культуры 1 Л в 37 ° C, пожимая инкубатор на 200 об/мин.
   4. Возьмите первый ОД₆₀₀ чтения после первого часа роста (запаздывание фазы типичный занимает 1 час). Не разбавлять культуры. Продолжить, замеры ОД₆₀₀ примерно каждые 20-30 мин до₆₀₀ ОД 0,6.
   5. По достижении ОД₆₀₀ = 0,6, добавляют 1 мл 1 м IPTG (конечная концентрация в культуре 1 Л = 1 мм) 2 x YTPG культуры.
      Примечание: Идеальный индукции ОД₆₀₀ -0,6; Однако широкий спектр 0,6-0,8 является приемлемым. Индукции с IPTG — для внутреннего производства T7 РНК-полимеразы (T7RNAP).
   6. После индукции Измерьте ОД₆₀₀ примерно каждые 20-30 мин до тех пор, пока он достигает 3.0.
      Примечание: Охлаждения центрифуги до 4 ° C в течение этого времени. Подготовка холодной S30 буфера, как подробно указано в дополнительной информации. Если буфер S30 готовится заранее, убедитесь, что DTT не добавляется до дня использования.
   7. Как только ОД₆₀₀ достигает 3.0 (рисунок 2A), залейте культуры в холодной центрифуги бутылка 1 Л в ледяной воде ванны. Подготовьте заполненные водой бутылка центрифуге 1 Л равный вес использоваться как баланс в центрифуге.
      Примечание: Значения поглощения варьируются от инструмент инструмент. Хотя ОД₆₀₀ урожай BL21(DE3) не является чувствительным переменной, рекомендуется, что пользователь оценивать и оптимизировать эту переменную как мера устранения неполадок. Больших спектрофотометры может привести к относительно низкой ОД₆₀₀ чтений по сравнению с небольших основанных на кювету спектрофотометры.
   8. Центрифуга бутылки 1 Л за 10 мин на 5000 x g и 10 ° C до Пелле клетки.
   9. Медленно слить супернатант и утилизируйте его в соответствии с института биологических отходов процедур. Место гранул на льду.
   10. С помощью стерильных шпателя, скрести клетки гранулы из бутылки центрифуги и перенести его на холодной 50 мл Конические трубки.
   11. Добавьте 30 мл холодного S30 буфера Конические трубки и Ресуспензируйте Пелле клеток, vortexing с короткими очередями (20-30 сек) и периодов отдыха (1 мин) на льду до тех пор, пока полностью высокомобильна с не куски.
   12. После того, как гранулы полностью высокомобильна, используйте другой 50 мл Конические трубки с водой как баланс и центрифуги для 10 мин на 5000 x g и 10 ° C (предварительно охлаждается до 4 ° C).
       Примечание: Это завершает 1^st 3 моет, необходимых при уборке клетки.
   13. Вылейте супернатант и утилизируйте его в соответствии с института биологических отходов процедур. Ресуспензируйте лепешка с 20-25 мл холодного S30 буфера и центрифуги для 10 мин на 5000 x g и 10 ° C (предварительно охлаждается до 4 ° C).
       Примечание: Это завершает 2^nd 3 стирок.
   14. Опять же вылейте супернатант и утилизируйте его в соответствии с института биологических отходов процедур. Добавьте ровно 30 мл буфера S30 и вихрь снова, чтобы Ресуспензируйте гранулы.
   15. Использование 3 предварительно взвешенный, холодная 50 мл конические трубы и Серологические Пипетки наполнитель с стерильной пипеткой, кратные 10 мл ресуспензированы гранул/S30 буферной смеси в каждой из 3 конические трубы.
       Примечание: Разделение клетки на 3 трубы не требуется, но этот шаг приводит к меньше ячейка окатышей (~ 1 g) для повышения удобства в последующих шагах.
   16. Центрифуга все трубы, используя соответствующие остатки, при необходимости, за 10 мин на 5000 x g и 10 ° C (предварительно охлаждается до 4 ° C).
       Примечание: Это завершает шаг окончательной стирки.
   17. Вылейте супернатант и утилизируйте его в соответствии с института биологических отходов процедур. Удалите избыток S30 буфера, тщательно протирая внутри конические пробки и крышки с чистой ткани; не прикасайтесь гранулы.
   18. Reweigh трубы на аналитический баланс и запишите вес окончательной гранул на каждой трубе.
       Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент. Гранулы может быть заморожен в жидком азоте и температуре-80 ° C на срок до одного года, пока она не понадобится для приготовления экстракта.

2. сырой сотовый экстракт подготовка - день 4

1. Для приготовления экстракта держите клетки холодной на льду во время каждого шага. Добавьте 1 mL холодной S30 буфера на 1 г клеточной массы таблетки. Убедитесь, что Дитиотреитол (DTT) была дополнена S30 буфер до конечной концентрации 2 мм.
   Примечание: Остыть microcentrifuge до 4 ° C в течение этого времени.
2. По vortexing с короткими очередями (20-30 сек) и периодов отдыха (1 мин) на льду до тех пор, пока полностью высокомобильна Ресуспензируйте Пелле клеток. Если ресуспендирования трудно, оставьте окатышей на льду за 30 мин до размораживания.
3. Перевод 1.4 мл ресуспензированы клеток на 1,5 мл отцентрифугировать.
4. Поместите один 1.5 мл пробирку, содержащую 1.4 мл ресуспензированы клеток в ледяной водой ванну в стакан. Sonicate 45 s на следуют 59 s покинуть на 3 всего цикла, с амплитудой установлен на 50%. Закройте и инвертировать трубы осторожно смешать периоды выкл. В общей сложности доставить 800-900 J энергии каждой трубы отцентрифугировать 1,5 мл, содержащих 1.4 мл ресуспензированы клеток (рис. 3A и 3B).
   Примечание: Этот шаг чувствителен к sonicator тип и модель используется и должны быть оптимизированы, если оборудование отличается от перечисленных для этой процедуры. Два взаимодополняющих подхода может использоваться для масштабирования количество экстракта, подготовленные в ходе этого шага: 1) несколько 1,5 мл отцентрифугировать трубы может быть sonicated параллельно, или 2) больших томов может быть sonicated в конические трубы (до 15 мл ресуспендирования клеток в трубу) , масштабирования количества энергии доставлены как описано ^29,45.
5. Сразу же после завершения sonication 4.5 мкл 1 М DTT (дополняющий дополнительные 2 мм DTT) 1.4 мл lysate и перевернуть несколько раз перемешать. Место труб на льду. Повторите шаги 2.4 и 2.5 для любых дополнительных трубок ресуспензированы клеток, прежде чем приступать к центрифугирования.
6. Microcentrifuge образцы на 18,000 x g и 4 ° C на 10 минут (рис. 3 c).
7. Пипетка супернатант в новой трубки отцентрифугировать 1,5 мл. Не беспокоить гранулы; Это предпочтительнее оставить некоторые супернатант поддерживать чистоту чем нарушить гранулы в усилия по максимизации доходности.
8. Инкубируйте супернатант из предыдущего шага в 250 об/мин и 37 ° C 60 мин, лентой трубы для встряхивания платформы инкубатора (это реакция стока).
9. Microcentrifuge образцы на 10000 x g и 4 ° C на 10 мин.
10. Удалить супернатант не нарушая гранулы и перенести его на новой трубки. Создание многих 100 мкл аликвоты экстракта для хранения.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и экстракт может быть заморожен в жидком азоте и температуре-80 ° C для до одного года, пока она не понадобится для реакций СЛТ. По крайней мере 5 циклов замораживания оттаивания можно прошел без ущерба для извлечения производительности (рис. 4).

3. Сотовый бесплатно белка синтез пакетный формат реакции

1. Оттепель решения A и B, ДНК шаблон, BL21(DE3) экстракт (если замороженные), T7RNAP и Алиготе молекулярного уровня воды.
   Примечание: СЛТ реакции шаблон можно найти в Дополнительной информации. Рецепты решения A и B приводятся в Дополнительной информации и соответствуют конкретным концентрации для многочисленных реагентов для поддержки PANOx-SP на основе энергетической системы СЛТ. Роль каждого реагента и приемлемым вариации концентраций этих реагентов, поддерживающие СЛТ были определены⁵⁰. Протокол T7RNAP очистки можно найти в дополнительной информации⁵¹. Дополнительные T7RNAP может увеличить объёмный урожайность, но не является необходимым, если T7RNAP индуцируется во время роста клеток. Плазмида ДНК шаблон (pJL1-sfGFP) может быть подготовлен с использованием комплекта maxiprep с двумя моет, используя буфер умывальник в комплекте, следуют постобработки ДНК очистка с помощью ПЦР очистка kit (рис. 2B). Линейная ДНК шаблоны могут также использоваться в реакциях СЛТ.
2. Ярлык необходимое количество отцентрифугировать трубы, необходимые для реакций СЛТ.
   Примечание: Реакции могут быть выполнены в различных размеров судна, однако меньше судно может уменьшить объемные белка урожай (рис. 2 c). Масштабирование реакцию в того же размера судна может также уменьшить объемные урожайности, как функция снижения обмена кислорода, за счет снижения в отношение площади поверхности к тома. При увеличении объема реакции выше 100 мкл, рекомендуется использовать плоское дно хорошо пластин ^31,37,52.
3. 2.2 мкл раствора A, 2.1 мкл раствора B, 5 мкл BL21*(DE3) экстракт, 0,24 мкг T7RNAP (16 мкг/мл конечная концентрация), 0,24 ng шаблона дна (16 конечная концентрация нг/мл), и воды довести окончательный объем до 15 мкл.
   Примечание: Во время установки реакции во избежание оседания компонентов и обеспечить, чтобы каждый реакции Vortex решения A и B часто получает однородных Алиготе каждого решения. Избегайте vortexing экстракт, вместо инвертировать трубки смешивать.
4. После того, как были добавлены все реагенты реакции, mix каждую пробирку закупорить вверх и вниз или слегка vortexing обеспечивая, что окончательный реакционную смесь объединяется в один шарик 15 мкл в нижней части трубки отцентрифугировать 1,5 мл.
5. Место каждой реакции в инкубатор 37 ° C без встряхивания за 4 ч или 30 ° C на ночь.
   Примечание: Успешное реакции можно качественно оценить визуально основаны на зеленый цвет sfGFP продукта в пределах СЛТ реакционную смесь (рис. 3D). Выражение протеина интереса может быть подтверждена SDS-PAGE (дополнительный рисунок 2).

4. Количественная оценка репортер белка, [sfGFP]

1. Загрузите 48 мкл 0,05 М HEPES, рН 8, в каждый хорошо необходимы для количественной оценки (обычно выполняется в трех экземплярах на реакции трубки).
2. Удаление реакции из инкубатора. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать каждой реакции, а затем перевести 2 мкл реакции в 48 мкл 0,05 М HEPES, рН 8. Накапайте вверх и вниз снова в хорошо перемешать.
3. После того, как все реакции загружаются и смешанные, место пластину 96 хорошо в флуориметр и измерения флуоресценции конечной точки sfGFP.
   Примечание: Волны возбуждения и выбросов для квантификации флуоресценции sfGFP находятся 485 Нм и 510 нм, соответственно.
4. С помощью ранее созданного калибровочной кривой, определите [sfGFP] от полученных флуоресценции чтений.
   Примечание: Инструкции для создания стандартной кривой концентрации sfGFP против интенсивности флуоресценции приводятся в дополнительной информации (дополнительный рис. 3). Пользователям потребуется установить калибровочной кривой для своего инструмента, поскольку чувствительность инструмента может отличаться.

Мы представили на основе sonication E. coli экстракт подготовки протокола, который может быть завершен в течение четырех дней, с Рисунок 1 демонстрирует процедурные разбивка на каждый день. Есть податливость шаги, которые могут быть завершены в каждый день с различными приостановка очков, но мы нашли этот рабочий процесс будет наиболее эффективным для выполнения. Кроме того клетки окатышей (шаг 1.3.18) и полностью готова экстракт (шаг 2.10) стабильны-80 ° c для по крайней мере год, позволяя пользователю создавать большие запасы каждого, чтобы сохранить для использования в позднее время¹⁷. Не только это экстракт стабильное течение длительного времени, но экстракт также можно пройти по меньшей мере пять заморозить циклов оттаивания без значительной потери производительности (рис. 4). Это позволяет для большего аликвоты экстракта храниться для многократного использования, если Морозильная Камера хранения пространство ограничено. Однако мы рекомендуем несколько меньших аликвоты (~ 100 мкл) экстракта, когда это возможно.

С каждой новой экстракт подготовки мы рекомендуем, что пользователь выполняет магния титрования для того, чтобы определить оптимальное количество магния для пакетной выписки. Пользователи могут количественно партии партии изменчивость общего белка концентрацию экстракта клеток в assay Брадфорд. Для выше выполняет экстракты, мы обычно видим концентрации общего белка 30-50 мг/мл, и в этом диапазоне нет очевидных корреляции между концентрациями общего белка и экстракт производительность ячейки. Поэтому мы рекомендуем пользователям настраивать концентрации магния соответственно для обеспечения максимальной белков и нуклеиновых кислот функциональность для каждого пакета экстракт. Уровни магния имеют важное значение для надлежащей репликации, транскрипции и трансляции ДНК, но чрезмерный уровень может быть пагубным для этих процессов⁵³. Чтобы продемонстрировать эту зависимость, мы провели совместное титрования магния и извлекать тома для определения оптимального сочетания, что минимизирует количество экстракта необходимо, сохраняя при этом продуктивной реакции (рис. 5). Из этого эксперимента для мы рекомендуем использовать 5 мкл концентрированного экстракта и 10 мм Mg^{2 +} экстракт с содержанием общего белка 30 мг/мл, для того чтобы получить более 1000 мкг/мл sfGFP.

Наш опыт работы с СЛТ также позволило нам определить шаги в рамках протокола, которые могут быть изменены без ущерба для общей производительности системы и другие, которые являются неотъемлемой частью для высокой исполняющей системы СЛТ. Прежде всего окончательный ОД₆₀₀ клеток урожая существенно не влияет на конечный результат реакции СЛТ, а клетки реально могут быть собраны где-нибудь от 2.7-4.0 ОД₆₀₀. Это представляет раннего экспоненциальной фазе роста где рибосома концентрация на ячейку является самым высоким и трансляционного оборудования является наиболее активной поддержки быстрого роста. Это наблюдение позволяет пользователям гибкость для оптимизации своих собственных процедур. Мы рекомендуем что уборки приблизительно 3,0 ОД₆₀₀ для того, чтобы захватить клетки на од₆₀₀ ближе к 3.3, время сбора урожая является полным (рисунок 2A). Переменные, которые влияют на урожайность СЛТ включают шаблон ДНК качество, размер судна реакции и относительные количества клеток экстракт и магния иона в реакции. Мы нашли ДНК качества иметь заметные различия партии к партии. Чтобы решить эту проблему, мы рекомендуем пользователям очистить ДНК через Миди или макси prep, следуют дополнительного шага очистки ДНК, либо на столбце очистки ДНК используется в maxiprep, или после очистки с помощью дополнительного комплекта очистки ДНК. Это улучшает воспроизводимость качества ДНК для СЛТ реакций и результаты в более надежного производства белка (Рисунок 2Б). Реакционный сосуд также влияет объемные урожайности, таким образом, что белок производства установок одинаковых реакции в различных томах судно может отличаться до 40%. Он предположил, что импульс в объемном урожайности наблюдается в более крупных судов из-за увеличения площади поверхности реакционной смеси, позволяющие улучшить обмен кислорода (рис. 2 c), и другие дальнейшего повышенный объемный урожайности, запустив СЛТ реакции в большие плоскодонные пластины, которые мы рекомендуем для реакций над 100 мкл^17,,3137,52.

Рисунок 1 : График роста культуры, производство выдержки клетки, установки и количественной оценки реакций СЛТ. Пользователь может реализовать СЛТ платформы для их исследования приложений через четыре дня рабочего процесса. Подготовка реагента представляет основного времени и стоимости инвестиций для первого раунда этого эксперимента и существенно уменьшается после того, как создаются запасы реагентов. Кроме того клетки окатышей и подготовленные ячейки экстракт может храниться более года в-80 ° C, позволяя пользователю начать временной шкалы на различные шаги для более быстрых результатов. Пользователь может также приостановить на различные шаги, чтобы изменить сроки этого рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Изменяемые условия для СЛТ и воздействие на объемные реакция урожайности. A. извлечение сравнения производительности на основе сбора урожая BL21(DE3) клеток на различных чтений₆₀₀ ОД. Основываясь на этом участке, мы рекомендуем, уборки в ОД₆₀₀ 3.3 производить по крайней мере 1000 мкг/мл целевого белка. Реакции были выполнены в масштабе 15 мкл в 1,5 мл пробирок отцентрифугировать. Б. сравнение двух протоколов мыть maxiprep ДНК с и без после очистки ДНК очистке. pJL1-sfGFP плазмид претерпел maxiprep с одним или двумя моет, следуют после очистки очистки, очистки комплект ПЦР. Для достижения ~ 900 мкг/мл экспрессии белков, мы предлагаем, независимо от количества maxiprep смывки ДНК после очистки очистки. Реакции были выполнены в масштабе 15 мкл в 1,5 мл пробирок отцентрифугировать. C. 15 мкл СЛТ реакции выступал в различных судов от 2 мл до 0,6 мл отцентрифугировать трубы. «Отрицательная» представляет отрицательный контроль, где шаблон не ДНК был добавлен к реакции. Все планки погрешностей представляют 1 стандартное отклонение трех независимых реакций для каждого условия, каждый из которых был количественно в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 3 : Ключ процедурных установок и результаты для создания продуктивных экстракт. A. правильной установки sonication ледяной воде ванны для обеспечения охлаждения образца, в то время как тепло генерируется во время sonication. B. 1,5 мл отцентрифугировать трубка содержащие высокомобильна клеток Пелле pre (слева) и sonication пост (справа). Результате lysate должен отображать более темный оттенок, по сравнению с ресуспензированы клеток Пелле. C. надлежащего разделения супернатант и Пелле ячейки lysate после 18 000 x g центрифугирования. D. СЛТ реакции после 4 ч инкубации при температуре 37 ° C. 1,5 мл отцентрифугировать справа (успешный реакции) показывает видимый флуоресценции белков репортер sfGFP ~ 900 мкг/мл. Отрицательный контроль труб на левом, отсутствует шаблон ДНК и имитация неудачного реакции, показывает ясное решение с не флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 4 : Извлекать изменения экспрессии белка свыше 5 циклов замораживания оттаивания СЛТ. Экстракт, приготовленный из же роста прошли пять заморозить циклов оттаивания через жидкого азота флеш замораживание после оттаивания на льду. Никаких существенных изменений в производительности экстракт для выражения sfGFP были замечены над пяти циклов замораживания оттаивания. Реакции были выполнены в масштабе 15 мкл в 1,5 мл пробирок отцентрифугировать. «Отрицательная» представляет отрицательный контроль, где шаблон не ДНК был добавлен к реакции. Все планки погрешностей представляют 1 стандартное отклонение трех независимых реакций для каждого условия, каждый из которых был количественно в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : СЛТ для реакции с различной [мг²⁺] и извлекать тома против [sfGFP]. [Мг]^{2 +}варьировались от 8 мм до 14 мм с шагом 2 мм и извлекать тома, варьировались от 3 мкл до 7 мкл с шагом в 1 мкл. Цветовой код представляет [sfGFP] изготовлены из высокого (красный) к низким (фиолетовый). Чтобы максимизировать эффективность реагента при сохранении производства высоким содержанием белка, мы рекомендуем использовать 5 мкл концентрированного экстракта и 10 мм Mg²⁺ для выдержки, которые имеют содержание общего белка ~ 30 мг/мл, как определяется assay Брадфорд. Исходные точки для создания контурное были основаны от конечной точки флуоресценции трех независимых реакций для каждого условия, каждая из которых была измерена в трех экземплярах. Реакции были выполнены в масштабе 15 мкл в 1,5 мл пробирок отцентрифугировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные Рисунок 1: стоимость с мкг белка, произведенного в микролитр реакции на шесть клеток бесплатно белка синтез платформах. Наша платформа сравнивается с пяти различных клеток бесплатно белка синтеза наборы/платформы с различной производительности и цены. Наша платформа СЛТ sonication на основе более экономически эффективным в обоих $/ мкг белка и $/ мкл реакции, чем большинство коммерческих комплекты и обеспечивает легкость комплект для установки реакции, а оставшиеся затраты сопоставимы с других научных платформ СЛТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные Рисунок 2: SDS-PAGE sfGFP выражения в СЛТ. Ячейки бесплатно реакции синтеза белка с (+ ДНК) и без (-ДНК) ДНК шаблон для sfGFP были запущены на 12% гель SDSPAGE для демонстрации выражение sfGFP, на 27 кДа (черная стрелка). Были использованы традиционные методы SDS-PAGE. Каждый пример загружены на геле экстракт включены 18 мкг, общего белка, основанный на Брэдфорд пробирного количественного определения общего белка в клетке. На основании измерения интенсивности флуоресценции и нашей стандартной кривой, мы оцениваем, что «+ ДНК» Лейн содержит 0,42 мкг sfGFP. Чтобы получить эти образцы, СЛТ реакции были запущены в масштабе 15 мкл в 1,5 мл отцентрифугировать трубы производства объемных урожайности в соответствии с рис. 3 c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная цифра 3: калибровочной кривой для sfGFP на Cytation-5. Эта кривая было определено с помощью методов, изложенных выше. Все данные, собранные для этого манускрипта был преобразован из конечной точки флуоресценции чтений [sfGFP] в мкг/мл, используя этот калибровочной кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Синтез белков, клеток бесплатно стала мощной и благоприятных технологий для различных приложений, начиная от biomanufacturing быстрое прототипирование биохимических систем. Спектру приложений поддерживают способность контролировать, управлять и увеличить клеточными в режиме реального времени. Несмотря на расширение влияния этой технологии платформы, остается широкий адаптации медленно из-за технических нюансов в осуществлении методов. Благодаря этим усилиям мы стремимся обеспечить простоту и ясность для установления эту технологию в новой лаборатории. С этой целью наш протокол для е. coli-платформа синтез белка на основе свободных клеток может быть достигнуто в время запуска четырех дней лаборатории обучены не-эксперты, например студентов (рис. 1). Кроме того, после того, как производятся запас реагентов и экстракт, последующие СЛТ пакетного реакции может быть создана, инкубировали и количественно в как раз 5 h. Единый, 1 Л рост клеток может привести к достаточно экстракт для четырехсот 15 мкл СЛТ реакций, в то время как единый пакет препаратов других свободных клеток реагентов может поддерживать тысячи реакций. Реагент препараты также могут быть расширены необходимости даже больших запасов. СЛТ реакции может быть установка в духе высокой пропускной способности, с помощью 96-луночных плиту или ПЦР трубы для тестирования различных условий параллельно. Объемные урожайность будет уменьшаться при использовании небольших судов, как показано на рисунке 2 c. СЛТ реакции может также быть расширена от микролитров десятки миллилитров объема общей реакции для того чтобы увеличить урожайность общего белка для одного условия. При масштабировании до объема, главным соображением является, что объемный реакция урожайности уменьшаться как коэффициент поверхности площадь и объем реакции уменьшается^37,52. Для масштабирования при сохранении подобных объемных урожайности экспрессии белков, пользователям следует разделить том реакции на многочисленные реакции сосудов и/или увеличить размер судна. Для реакции весы, начиная от 15 мкл - 100 мкл в объеме, рекомендуются многочисленные 15 мкл реакции параллельно. Для реакций, превышающей 100 мкл в объеме рекомендуется 24-ну пластины с плоским дном, и 12-ну плиты рекомендуются для реакции томов свыше 600 мкл. Такие комбинации томов реакции и судов обеспечивают согласованность в объемном реакция урожайности после масштабирования^17,31,37,52. Расширение масштабов за пределами этих томов может быть достигнуто путем использования нескольких скважин пластины параллельно. Используя этот формат, реакции может быть расширена до более чем 10 мл общего объема. Оптимизация реакции объем реакции судна комбинация может поддерживать приложения biomanufacturing без ущерба для производительности реакции.

При выполнении этот протокол, есть несколько ключевых соображений, которые влияют объемные реакция урожайности, а также показатели, связанные с неэффективные экстракт. Для обеспечения надлежащего лизис и избежание денатурации функциональных транскрипция/перевод механизма, важно для уменьшения производства во время лизис тепла. Погружайте ресуспендирования клеток в ледяной воде ванны во время sonication быстро рассеивать тепло во время sonication (рис. 3A). Показателем эффективного клеток лизис является появление темнее появление lysate клетки по сравнению с pre-sonicated пробы (рис. 3B). Для пользователя гибкости sonicator и зонд, показано на рисунке 3A адаптируется к ряду томов из 100 мкл до 15 мл ресуспензированы клеток. Для этого, пользователь может настроить количество джоули доставлены для лизиса желаемого объема клеток. Кроме того большие объемы экстракт может быть подготовлен через два взаимодополняющих подхода. Пользователи могут sonicate несколько труб параллельно, и/или sonicate большего количества клеток взмучивания, масштабирование количество энергии пропорционально с томом как описано^29,45. Другой шаг, который указывает на качество экстракт является центрифугирования шаг после лизиса клеток. После лизиса клеток, мы рекомендуем центрифугирования в 18000 x g обеспечить четкое разделение между супернатант (транскрипция/перевод машин, раздробленной геномной ДНК, которая больше не функционирует шаблон транскрипция/перевод) и Пелле ( нежелательные клетчатых компонентов клеточной мембраны и осажденный белки) (рис. 3 c). Мы нашли что центрифугирования в 18000 x g улучшает разделения, что приводит к Улучшенная воспроизводимость, по сравнению с спинов на более низких скоростях, например g 12000 x. Для удобства мы рекомендуем использовать столешницы охлажденных центрифугу, способным достичь не менее 12000 x г. Этот шаг обычно выполняется на 30000 x g, которые должны быть рассмотрены, если соответствующее оборудование доступны^{54,55,56,,5758, 59 , 60}. Экстракт производительность не зависит от центрифугирования скорости на этот шаг, учитывая, что надлежащее разделение достигается. При удалении желаемого супернатанта, это лучше избегать любых облачно материалов, которые существуют на границе между супернатант и Пелле, поскольку это загрязнение снизит производительность экстракта. Стремясь за чистоту супернатант приводит к более продуктивной экстрактов и стоит уменьшение количество экстракта, полученные для новых пользователей.

Важно отметить, что хотя методы, которые мы представили воспроизводимость и может быть выполнена учеными с минимальным опытом, может быть партии партии и вариация реакции и реакции. Это может объясняться различия в составе proteomic lysate после sonication⁶¹. Партии партии изменчивости, которую мы наблюдали обычно уменьшается после добавок с T7RNAP и оптимизации концентрации магния. Экзогенных T7RNAP является распространенным среди СЛТ реакции для поддержки оптимального белков, и мы считаем, что наличие двух источников T7RNAP - эндогенного выражение в BL21*(DE3) и дополнительные T7RNAP до конечной концентрации 16 мкг/мл - улучшает воспроизводимость партии партии для новых пользователей^45,46. С опытом работы пользователи могут изменять свои эксперименты, чтобы использовать только один источник T7RNAP, при желании. Количественное определение содержания общего белка новой партии экстракт и соответствующую корректировку мг^{2 +} концентрации может также помочь уменьшить различия партии партии в объемный белка выражение урожайности. Вариации в выражении протеина также может быть из-за различий в размерах и структуре протеина интереса, использование кодон гена и его соответствующий сайт связывания рибосома гена интереса, а также тип вектора выражения используется^{62 ,63}. По этим причинам некоторые белки могут не выразить а также модель белка sfGFP, обусловило снижение объемной урожайности от СЛТ реакций.

Ограничения метода представленных СЛТ включают что оно не может быть непосредственно подходит для всех приложений клеток-Free, таких как метаболический инжиниринг и тюнинг выражение условий, без дополнительных изменений к протоколам. Однако мы считаем, что этот протокол будет служить основой для создания платформы СЛТ в новой лаборатории и обеспечивают неспециалистов с возможностью осуществлять вводный реакции свободных клеток в их лабораториях. После первоначального внедрения исследователи могут экспериментировать с платформы вносить собственные изменения для более конкретных приложений, основанных на других литературы в области.

СЛТ платформы по цене $ 0,021/мкг белка (за исключением стоимости труда и оборудования), что делает наша система, конкурентоспособным ценам с коммерческие наборы без ущерба для простоты установки реакции. Оценки сравнительной стоимости мкл реакции показывают аналогичные тенденции ( рис. 1дополнительный ). Оценим затраты запуска для ~ $4500 для всех реактивов и дополнительные $3200 для специализированного оборудования, например sonicator. Человеко-часов для завершения этой процедуры оцениваются в ~ 26 h для всех prep реагент от земли вверх. Однако после того, как были подготовлены большие запасы реагентов, спрос на труд существенно уменьшаются. Кроме того как накопленный опыт с платформы, мы рекомендуем масштабирования размер роста клеток, экстракт подготовка и подготовка реагента для максимизации эффективности время. Учитывая расходы на запуск, мы рекомендуем СЛТ платформы для приложений в синтетической биологии, высок объём усилия, и белка выражение условия, несовместимы с традиционными белка выражение платформы из-за конфликта с ячейкой Биохимия и жизнеспособности ограничения. В этих специализированных случаях, когда желаемый метод включена платформой СЛТ большую стоимость СЛТ в vivo выражение является оправданным.

Дальнейшее развитие платформы СЛТ может обеспечить более широкие утилита усилиям биотехнологии такие как метаболический Инжиниринг ферментативные пути, производства и характеристика традиционно сложных белков, нестандартные аминокислоты Включение и неестественным белков, производства слоистых медицины и расширяется за пределы лаборатории в классе для стволовых образование^64,,6566. Эти усилия будут подкрепляться продолжающиеся усилия для подробного описания платформы СЛТ. Лучшее понимание состава выдержки клетки приведет к дальнейшее уточнение к Улучшенная реакция урожайности и гибкость в реакции условий^61,,6768.

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Авторы хотели бы признать д-р Дженнифер VanderKelen, Андреа Лаубшер и Тони Turretto технической поддержки, Уэсли Kao, Layne Уильямс и Кристофер Hight полезные обсуждения. Авторы также признают финансовой поддержки от Билла и Линда Фрост фонд, центр для приложений в биотехнологии в Chevron биотехнологии применяются исследовательский фонд Грант, Cal Поли исследовательских, научных и творческой деятельности грантовой программы (RSCA 2017), и Национальный научный фонд (NSF-1708919). MZL признает Калифорнийский государственный университет выпускников Грант. MCJ признает армии исследований бюро W911NF-16-1-0372, Национальный научный фонд предоставляет MCB-1413563 и MCB-1716766, военно-воздушные силы исследований лаборатории центра передового опыта Грант FA8650-15-2-5518, обороны угрозы сокращения агентства грант HDTRA1-15-10052/P00001, Дэвида и Люсиль Пакард, Camille Дрейфус преподаватель стипендиат программы, Департамент из энергии BER Грант де SC0018249, человека границ научной программы (RGP0015/2017), Грант ЭТОП DOE Объединенный институт генома, и Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго доверия сообщества для поддержки.