Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

En los últimos 50 años, síntesis de proteínas libres de células (CFPA) ha emergido como una potente tecnología para aprovechar la capacidad transcripcional y traduccional de células dentro de un tubo de ensayo. Obviando la necesidad de mantener la viabilidad de la célula y eliminando la barrera celular, PFC ha sido fundamental para aplicaciones emergentes en biofabricación de proteínas tradicionalmente difíciles, así como aplicaciones de prototipado rápido para Ingeniería Metabólica y genómica funcional. Nuestros métodos para la implementación de un e. coli-basado PFC plataforma permiten a los usuarios nuevos para acceder a muchas de estas aplicaciones. Aquí, se describen métodos para preparar extracto mediante el uso de medios enriquecidos, frascos desconcertados y un método reproducible de lisis celular armonioso basado en baño de ultrasonidos. Este extracto puede utilizarse para expresión de proteínas capaces de producir 900 μg/mL o más de proteína fluorescente verde super carpeta (sfGFP) en apenas 5 h de la disposición experimental para análisis de datos, dado que las existencias de reactivos apropiados han sido preparadas de antemano. El costo estimado de inicio de obtención de reactivos es de $4.500 que se sostienen miles de reacciones a un costo estimado de $0,021 por μg de proteína producida o $0,019 por μl de reacción. Además, los métodos de expresión de la proteína reflejan la facilidad de la instalación de reacción en sistemas comercialmente disponibles debido a la optimización de reactivos Premezclados, a una fracción del costo. Con el fin de que el usuario pueda aprovechar la naturaleza flexible de la plataforma de PFC para aplicaciones generales, hemos identificado una gran variedad de aspectos de la plataforma que puede ser afinado y optimizado dependiendo de los recursos disponibles y los resultados de la expresión de la proteína deseada.

Síntesis de proteína sin células (PFC) ha emergido como una tecnología que ha abierto un número de nuevas oportunidades para la producción de proteínas, genómica funcional, ingeniería metabólica y más en los últimos 50 años^1,2. En comparación con el estándar en vivo plataformas de expresión de la proteína, PFC proporciona tres ventajas fundamentales: 1) la naturaleza libre de la plataforma permite la producción de proteínas que serían potencialmente tóxicas o ajenas a la célula^{3,4 ,5,6}; 2) inactivación de la DNA genomic y la introducción de una plantilla de DNA que codifican los genes de interés canalizar toda la energía sistémica dentro de la reacción a la producción de la proteína de interés; y 3) el carácter abierto de la plataforma permite al usuario modificar y supervisar las condiciones de reacción y composición en tiempo real^7,8. Este acceso directo a la reacción es compatible con el aumento de los sistemas biológicos químicos ampliados y condiciones redox para la producción de nuevas proteínas y la afinación de procesos metabólicos^{2,9, 10}. directa acceso también permite al usuario combinar la reacción de PFC con ensayos de actividad en un sistema del solo-pot para ciclos de diseño-construcción-prueba más rápida¹¹. La capacidad para realizar la reacción de PFC en gotas de pequeño volumen o en los dispositivos basados en papel más apoya esfuerzos de descubrimiento de alto rendimiento y prototipado rápido^{12,13,14,15 ,16}. Como resultado de estas ventajas y la naturaleza de listo del sistema, PFC únicamente ha permitido una variedad de aplicaciones de la biotecnología como la producción de proteínas que son difíciles de expresar soluble en vivo^{17, 18,19,20}, detección de la enfermedad^21,22,23, en demanda de biofabricación de^{18,24 ,25,26,27}y educación^28,29, todos los cuales muestran la flexibilidad y la utilidad de la plataforma libre de células.

Sistemas de PFC pueden ser generados desde una gran variedad de lisados crudos de ambas variedades de células procariotas y eucariotas. Esto permite diversas opciones en el sistema de elección, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas dependiendo de la aplicación de interés. Sistemas de PFC también varían mucho en productividad, costo y tiempo de preparación. Los más comúnmente utilizan celular se producen extractos de germen de trigo, reticulocitos de conejo, células de los insectos y células de Escherichia coli , siendo esta última la más rentable hasta la fecha mientras que produce los mayores rendimientos volumétricos de la proteína³⁰ . Mientras otros sistemas de PFC pueden ser ventajosos para su maquinaria de modificación poste-de translación innata, surgiendo aplicaciones utilizando e. coli-maquinaria base son capaces de cerrar la brecha mediante la generación de site-specifically fosforilada y proteínas glicosiladas en demanda^{31,32,33,34,35}.

Reacciones de PFC se pueden ejecutar en cualquier lote, continuo intercambio sin células (CECF) o flujo continuo sin células (CFCF) formatos. El formato por lotes es un sistema cerrado cuya reacción es limitada debido a la disminución de cantidades de reactivos y la acumulación de subproductos inhibitorios de la reacción. Métodos CECF y CFCF aumentan la vida útil de la reacción y así dar lugar a rendimientos volumétricos creciente de la proteína en comparación con la reacción de lote. Esto se logra permitiendo que los subproductos de la síntesis de la proteína debe sacar el recipiente de la reacción mientras que nuevos reactivos se suministran en el transcurso de la reacción². En el caso de CFCF, la proteína de interés también puede removerse de la cámara de reacción, mientras que en la CECF, la proteína de interés permanece en la cámara de reacción compuesta por una membrana semipermeable^36,37. Estos métodos son especialmente valiosos para superar los bajos rendimientos volumétricos de difícil-a-expresan proteínas de interés^{38,39,40,41,42, 43}. Los desafíos en la implementación de los enfoques CECF y CFCF son 1) mientras que resultan en un uso más eficiente de la maquinaria de la bio responsable de la transcripción y traducción, que requieren en particular grandes cantidades de reactivos que aumenta el costo general y 2) requieren más complejas configuraciones de reacción y equipo especializado en comparación con el formato de lote⁴⁴. Con el fin de garantizar la accesibilidad para los nuevos usuarios, los protocolos describen foco en el formato por lotes en volúmenes de reacción de 15 μl con recomendaciones específicas para aumentar el volumen de reacción a la escala de mililitro.

Los métodos presentados en este documento permiten no expertos con habilidades básicas de laboratorio (como estudiantes) para implementar el crecimiento celular, preparación del extracto y formato reacción configuración de lote para una e. coli-basado sistema de PFC. Este enfoque es rentable en comparación con los kits disponibles en el mercado sin sacrificar la facilidad de la instalación de reacción basado en el kit. Además, este enfoque permite a las aplicaciones en el laboratorio y en el campo. Cuando se decide implementar PFC, nuevos usuarios completamente deben evaluar la eficacia de los sistemas de expresión de la proteína convencional para la inversión de arranque, como PFC no puede ser superior en todos los casos. Los métodos de PFC aquí descritos permiten al usuario aplicar directamente una variedad de aplicaciones, incluyendo la genómica funcional, la producción de proteínas que son insuperables para expresión en vivo , así como campo de prueba de alto rendimiento aplicaciones como biosensores y kits educativos para la biología sintética. Aplicaciones adicionales tales como la ingeniería metabólica, de las condiciones de expresión de la proteína, detección de enfermedades y escalado utilizando métodos CECF o CFCF siguen siendo posibles pero pueden requerir experiencia con la plataforma de PFC más modificación de la reacción condiciones. Nuestros métodos de combinan crecimiento en medios enriquecidos y el desconcertado, con métodos relativamente rápidos y reproducibles de lisis celular mediante sonicación, seguido por una configuración simplificada de reacción de PFC que utiliza mezclas optimizadas⁴⁵. Mientras que los métodos de crecimiento celular han convertido en algo estandarizados dentro de este campo, métodos de lisis celular varían ampliamente. Además de sonicación, métodos de lisis comunes incluyen la utilización de una prensa francesa, un homogeneizador, batidores de grano, o lisozima y otras perturbaciones bioquímicas y físicas métodos^{46,47,48, 49}. nuestros métodos, se obtienen aproximadamente 2 mL de extracto crudo de la célula por 1 L de las células. Esta cantidad de extracto celular puede soportar 400 15 μl PFC reacciones, cada producción ~ 900 μg/mL de proteína de sfGFP de reportero de la plantilla de plásmido pJL1-sfGFP. Este método cuesta $ 0,021/μg de sfGFP producido ($.019/μl de reacción), excluyendo el costo de mano de obra y equipo (suplementario Figura 1). A partir de cero, este método puede aplicarse en 4 días por una sola persona y repetir reacciones PFC pueden completarse dentro de las horas (figura 1). Además, el protocolo puede ser aumentado en volumen para lotes más grandes de preparación de los reactivos para satisfacer las necesidades del usuario. Lo importante es el protocolo que presentamos se puede implementar laboratorio entrenado no expertos como estudiantes, ya que sólo requiere conocimientos básicos de laboratorio. Los procedimientos descritos a continuación y el video que lo acompaña han sido desarrollados específicamente para mejorar la accesibilidad de la plataforma de PFC de e. coli de amplio uso.

1. los medios preparación y crecimiento de la célula

1. Día 1
   1. Las células de e. coli BL21*(DE3) racha de un glicerol acción sobre una placa de agar LB e incuban durante al menos 18 h a 37 ° C.
   2. Preparar 50 mL de medio LB y autoclave la solución en un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C. Almacenar a temperatura ambiente.
2. Día 2
   1. Preparar 750 mL de 2 medios de x YTP y 250 mL de solución 0,4 de M D-glucosa como se describe en la información complementaria.
   2. Verter los 2 medios de x YTP en un autoclave frasco desconcertado de 2,5 L y la solución de D-glucosa en una botella de vidrio de 500 mL esterilizado. Autoclave de ambas soluciones en un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C.
   3. Asegúrese de que ambas soluciones estériles se almacenan a 37 ° C, si el crecimiento celular se realiza en el día siguiente, para maximizar las tasas de crecimiento a la inoculación. No combine soluciones hasta la inoculación.
      Nota: Las soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante 1-2 d si es necesario, aunque los medios de x YTP 2 es propenso a la contaminación.
   4. Iniciar una cultura de la noche de BL21(DE3) al inocular 50 mL de medio LB con una sola Colonia de BL21(DE3) utilizando un bucle esterilizada y técnica estéril para evitar la contaminación.
   5. Coloque 50 mL de la cultura BL21*(DE3) LB a 37 ° C 250 rpm de agitación incubadora y crecer durante la noche para 15-18 h.
   6. Preparar y esterilizar todos los materiales necesarios para los días 3 y 4, incluyendo: dos botellas de centrífuga de 1 L, 4 x 50 mL frío tubos cónicos (pesaje y registro masas de tres) y muchos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Día 3
   1. Extraiga la cultura noche de 50 mL de BL21*(DE3) en LB de la incubadora agitación y mida OD₆₀₀ en un espectrofotómetro usando un 1:10 dilución con los medios LB. Calcular el volumen de la cultura durante la noche es necesario añadir a 1 L de media para una partida de OD₆₀₀ de 0.1 (por ejemplo, si un OD₆₀₀ de un 1:10 dilución se lee como 0.4, inocular 25 mL del OD sin diluir₆₀₀ = 4.0 cultura durante la noche en 1 L de 2 x YTP G).
   2. Retire el calentado 2 x YTP los medios de comunicación y soluciones de D-glucosa de la incubadora de 37 ° C junto con los 50 mL de LB cultura. Utilizando una técnica estéril, vierta cuidadosamente la solución de D-glucosa en el medio de x YTP 2 (evitando las partes de la mufla desconcertada).
      Nota: Además de D-glucosa completa la receta para 1 L de 2 x YTPG.
   3. Mantener una técnica estéril, inocular el 1 L de solución de x YTPG 2 con la cantidad apropiada de la cultura de 50 mL para empezar la cultura de 1 L en un 0.1 OD₆₀₀. Inmediatamente Coloque el cultivo inoculados de 1 L a 37 ° C Incubadora de agitación a 200 rpm.
   4. Tomar el primer OD₆₀₀ lectura después de la primera hora de crecimiento (fase lag típico dura 1 h). No diluir la cultura. Continúe tomando OD₆₀₀ mediciones aproximadamente cada 20-30 min hasta OD₆₀₀ 0.6.
   5. Al llegar a OD₆₀₀ = 0.6, añadir 1 mL de 1 M IPTG (concentración final en la cultura L 1 = 1 mM) a la cultura de x YTPG 2.
      Nota: Inducción Ideal OD₆₀₀ es 0,6; sin embargo, es aceptable un rango de 0.6-0.8. Inducción por IPTG es de producción endógena de la T7 ARN polimerasa (T7RNAP).
   6. Después de la inducción, medir el OD₆₀₀ aproximadamente cada 20-30 min hasta llegar a 3.0.
      Nota: Enfriar el centrifugar a 4 ° C durante este tiempo. Preparar el tampón frío de S30 como se detalla en la información complementaria. Si el búfer de S30 es preparado por adelantado, asegúrese de que la TDT no se agrega hasta el día de uso.
   7. Una vez que el OD₆₀₀ alcanza 3.0 (figura 2A), vierta la cultura en una fría botella de centrífuga de 1 L en un baño de agua helada. Preparar una botella de centrífuga 1 L lleno de agua de igual peso para ser utilizado como un equilibrio en la centrifugadora.
      Nota: Los valores de extinción varían de instrumento a instrumento. Mientras que la OD₆₀₀ de cosecha de BL21(DE3) no es una variable sensible, se recomienda que el usuario evaluar y optimizar esta variable como medida de solución de problemas. Espectrofotómetros más grandes pueden producir relativamente más bajos OD₆₀₀ lecturas en comparación con los espectrofotómetros más pequeños basados en la cubeta.
   8. Centrifugue las botellas de 1 L por 10 min a 5.000 x g y 10 ° C para que sedimenten las células.
   9. Lentamente Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Coloque el balín en el hielo.
   10. Con una espátula estéril, raspar el precipitado de células de la botella de centrífuga y transferirlo a un tubo cónico de 50 mL frío.
   11. Añadir 30 mL del tampón frío de la S30 con el tubo cónico y resuspender el precipitado de células con un vórtex con ráfagas cortas (20-30 s) y períodos de descanso (1 min) en el hielo hasta que completamente se resuspendió con no trozos.
   12. Una vez que el pellet se resuspendió completamente, utilizar otro tubo cónico de 50 mL con agua como un equilibrio y centrifugar durante 10 min a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
       Nota: Esto completa la 1^st de 3 lavados requerido cuando la recolección de las células.
   13. Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Resuspender el precipitado con 20-25 mL de frío S30 tampón y centrifugar durante 10 minutos a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
       Nota: Esto completa la 2^nd de 3 lavados.
   14. De nuevo, vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Añadir exactamente 30 mL de tampón de S30 y de vortex para Resuspender el precipitado.
   15. Utilizando los 3 tubos cónicos de 50 mL previamente pesado, frío y un llenador de la pipeta serológica con una pipeta estéril, alícuota 10 mL de sedimento resuspendido/S30 buffer mezcla en cada uno de los 3 tubos cónicos.
       Nota: Dividir las células en 3 tubos no es necesario, pero este paso produce pellets celulares más pequeños (~ 1 g) para mayor comodidad en pasos posteriores.
   16. Centrifugue todos los tubos, utilizando Balanzas apropiadas según sea necesario, durante 10 minutos a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
       Nota: En esta forma concluye la etapa de lavado final.
   17. Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Quitar el exceso de tampón S30 limpiando cuidadosamente el interior del tubo cónico y tapa con un paño limpio; Evite tocar el sedimento.
   18. Repesar los tubos con una balanza analítica y registre el peso del pellet final en cada tubo.
       Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto. Los pellets pueden ser flashes congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C por hasta un año hasta que se necesite para la preparación del extracto.

2. preparación de extracto celular crudo - día 4

1. Para la preparación del extracto, mantener las células frías sobre hielo durante cada paso. Añadir 1 mL de tampón de S30 frío por 1 g de masa de la célula de la pelotilla. Asegúrese de que dithiothreitol (DTT) se ha complementado en el búfer de S30 a una concentración final de 2 mM.
   Nota: Enfriar la microcentrífuga a 4 ° C durante este tiempo.
2. Resuspender el precipitado de células con un vórtex con ráfagas cortas (20-30 s) y períodos de descanso (1 min) en el hielo hasta que completamente suspendidas. Si la resuspensión es difícil, deje las pastillas en hielo durante 30 minutos descongelar.
3. Transferir 1,4 mL de células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
4. Coloque un tubo de 1,5 mL que contiene 1,4 mL de células resuspendidas en un baño de agua helada en un vaso de precipitados. Someter a ultrasonidos para 45 s en seguida 59 s apagado para los 3 ciclos total, con una amplitud fija en 50%. Cerrar e invertir los tubos suavemente la mezcla durante los periodos de inactividad. En total, entregar 900 800 J de energía a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 1,4 mL de células resuspendidas (Figura 3A y 3B).
   Nota: Este paso es sensible al tipo de sonicador y modelo utilizado y debe ser optimizado si el equipo es diferente al que aparece para este procedimiento. Dos enfoques complementarios se pueden utilizar para ampliar la cantidad de extracto preparado durante este paso: tubos de microcentrífuga de 1.5 mL 1) múltiples pueden ser sonicados en paralelo, o 2) mayores volúmenes pueden ser sonicados en tubos cónicos (hasta 15 mL de resuspensión de células por el tubo) , ampliar la cantidad de energía entregada como describió anteriormente ^29,45.
5. Inmediatamente después de sonicación es completa, agregar 4.5 μl de TDT (que complementa un TDT adicional de 2 mM) de 1 M en el 1,4 mL de lisado e invertir varias veces para mezclar. Coloque el tubo en hielo. Repita los pasos del 2.4 y 2.5 para cualquier tubo adicional de células resuspendidas antes de proceder a centrifugación.
6. Muestras de microcentrífuga en 18.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos (figura 3).
7. Pipetear el sobrenadante en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. No molestar el sedimento; es preferible dejar algunos sobrenadante para mantener la pureza de to interrumpir el sedimento en los esfuerzos para maximizar el rendimiento.
8. Incubar el sobrenadante del paso anterior en 250 rpm y 37 ° C durante 60 min con cinta adhesiva los tubos a la plataforma de agitación de la incubadora (ésta es la reacción de escurrimiento).
9. Muestras de microcentrífuga a 10.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos.
10. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet y transferirlo a un tubo nuevo. Crear muchas partes alícuotas de 100 μl del extracto para el almacenamiento de.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y el extracto puede ser flash congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C por hasta un año hasta que se necesite para las reacciones de PFC. Al menos 5 ciclos de congelación y descongelación pueden experimentados sin detrimento para extraer productividad (figura 4).

3. sin células proteína síntesis lote formato reacciones

1. Descongelar las soluciones A y B, DNA plantilla, BL21(DE3) extracto (si es congelado), T7RNAP y una alícuota de agua grado molecular.
   Nota: La plantilla de reacción PFC puede encontrarse en la Información complementaria. Recetas de soluciones A y B se encuentran en la Información complementaria y corresponden a concentraciones específicas para numerosos reactivos apoyar el sistema de energía basado PANOx-SP para PFC. El papel de cada reactivo y la variación aceptable en estas concentraciones de reactivo que puede apoyar PFC han sido determinado⁵⁰. Un protocolo de purificación de T7RNAP se puede encontrar en la información suplementaria de⁵¹. T7RNAP suplementario puede aumentar el rendimiento volumétrico, pero no es necesario si T7RNAP es inducida durante el crecimiento de la célula. Plantilla de la DNA del plásmido (pJL1-sfGFP) puede ser preparado con un kit de maxiprep de dos lavados con el tampón de lavado en el kit, seguido de una tratamiento posterior limpieza de ADN usando un kit de potabilización de PCR (figura 2B). Plantillas de la DNA lineares pueden utilizarse también en reacciones de PFC.
2. La etiqueta la cantidad necesaria de tubos del microfuge necesarios para reacciones de PFC.
   Nota: Las reacciones se pueden realizar en varios tamaños de vasos, pero un vaso más pequeño puede disminuir los rendimientos volumétricos de la proteína (figura 2). Escalado de una reacción en el mismo recipiente de tamaño también puede reducir los rendimientos volumétricos, en función de disminuir el intercambio de oxígeno, debido a una disminución en el área superficial al cociente del volumen. Al aumentar el volumen por encima de 100 μL de la reacción, se recomienda utilizar placas de pozos de fondo plano ^31,37,52.
3. Añadir 2,2 μl de la solución A, 2.1 μl de la solución B, 5 μl de BL21*(DE3) extracto, 0.24 μg de T7RNAP (16 μg/mL concentración final), 0,24 ng de DNA plantilla (concentración final de 16 ng/mL) y agua para hacer el volumen final de 15 μl.
   Nota: Vórtice soluciones A y B con frecuencia durante la instalación de reacción para evitar la sedimentación de los componentes y asegurarse de que cada reacción recibe una parte alícuota de cada solución una homogénea. Evitar Vortex el extracto, en lugar de ello invertir el tubo para mezclar.
4. Después de todos los reactivos se han agregado a la reacción, mezclar cada tubo pipetear arriba y abajo o suavemente Vortex asegurándose que la mezcla de reacción final se combina en una sola tira de 15 μl en la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
5. Coloque cada reacción en la incubadora de 37 ° C sin agitación durante 4 horas, o 30 ° C durante la noche.
   Nota: Reacciones exitosas pueden ser cualitativamente evaluadas visualmente basado en el color verde del producto sfGFP dentro de la mezcla de reacción de PFC (figura 3D). Expresión de la proteína de interés se puede confirmar también por SDS-PAGE (suplementario Figura 2).

4. cuantificación de la proteína reportera, [sfGFP]

1. Carga 48 μl de 0,05 M HEPES, pH 8, en cada bien es necesario para la cuantificación (generalmente realizada por triplicado por el tubo de reacción).
2. Retire las reacciones de la incubadora. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para cada reacción de la mezcla, luego transferir 2 μl de la reacción a las 48 μl de 0,05 M HEPES, pH 8. Pipeta hacia arriba y hacia abajo otra vez en el pozo para mezclar.
3. Una vez que todas las reacciones son cargadas y mezcladas, coloque la placa de la pozo 96 en el fluorómetro y medir la fluorescencia de extremo de sfGFP.
   Nota: Longitudes de onda de excitación y emisión para la cuantificación de la fluorescencia de sfGFP son 485 nm y 510 nm, respectivamente.
4. Usando una curva estándar previamente generada, determinar [sfGFP] de las lecturas obtenidas de la fluorescencia.
   Nota: Instrucciones para generar una curva estándar de concentración de sfGFP versus intensidad de fluorescencia se encuentran en información adicional (suplementario Figura 3). Los usuarios tendrán que establecer una curva estándar para su instrumento, ya que puede variar la sensibilidad del instrumento.

Hemos presentado una sonicación basado en e. coli extracto protocolo de preparación que puede completarse en un lapso de cuatro días, con la figura 1 demuestra la ruptura procesal más cada día. Hay maleabilidad a los pasos que se pueden realizar en cada día con varios puntos de pausa, pero hemos encontrado este flujo de trabajo para ser el más eficaz ejecutar. Además, los gránulos de la célula (paso 1.3.18) y extracto completamente preparado (paso 2.10) son estables a-80 ° C durante al menos un año, permitiendo al usuario crear poblaciones más grandes de cada uno para guardar para su uso en un más adelante del tiempo¹⁷. No sólo es el extracto estable durante largos períodos de tiempo, pero el extracto también puede someterse a congelación al menos cinco ciclos de descongelación sin pérdida significativa de la productividad (figura 4). Esto permite mayores alícuotas del extracto de almacenarse para usos múltiples, si el espacio de almacenamiento congelador es limitado. Sin embargo, recomendamos múltiples alícuotas más pequeñas (~ 100 μL) del extracto siempre que sea posible.

Con cada nueva preparación del extracto, se recomienda que el usuario realiza una valoración del magnesio con el fin de determinar la cantidad óptima de magnesio para ese lote de extracto. Los usuarios pueden cuantificar la variabilidad lote a lote en concentración de proteína del extracto celular por el análisis de Bradford. Para mayor rendimiento extractos, vemos típicamente las concentraciones de proteínas totales de 30-50 mg/mL, y dentro de esta gama no existe correlación entre las concentraciones de proteínas totales y el rendimiento de extracto celular obvio. Por lo tanto, recomendamos que los usuarios sintonizar concentración de magnesio en consecuencia para asegurar que se maximizan funcionalidad de ácido nucleico y proteína para cada lote de extracto. Los niveles de magnesio son importantes para la correcta replicación del ADN, transcripción y traducción, pero niveles excesivos pueden ser perjudiciales para estos procesos⁵³. Para demostrar esta dependencia, han realizado una valoración conjunta de magnesio y extracto de volumen para determinar la combinación óptima que minimiza la cantidad de extracto necesario, manteniendo una reacción productiva (figura 5). De este experimento, se recomienda utilizar 5 μl del extracto y 10 mM Mg^{2 +} para el extracto con un contenido de proteína total de 30 mg/mL, con el fin de obtener más de 1.000 μg/mL de sfGFP.

Nuestra experiencia con el PFC también nos ha permitido determinar los pasos en el protocolo que puede ser variado sin detrimento de la productividad general del sistema y otros que son parte integrales para un alto rendimiento sistema de PFC. En particular, el OD final₆₀₀ de células no afecta significativamente el resultado final de la reacción de PFC y células viable pueden ser cosechadas en cualquier lugar de 2.7-4.0 OD₆₀₀. Esto representa la primera fase exponencial de crecimiento donde la concentración de ribosomas por célula es el más alto y la maquinaria traduccional es el más activo para apoyar el rápido crecimiento. Esta observación permite a los usuarios flexibilidad para optimizar sus propios procedimientos. Se recomienda cosechar a aproximadamente 3.0 OD₆₀₀ para capturar las células a un OD₆₀₀ más 3.3 por la vendimia es completa (figura 2A). Variables que afectan el rendimientos de PFC incluyen plantilla ADN calidad, tamaño del vaso de reacción y las cantidades relativas de extracto y magnesio ion de células presente en la reacción. Hemos encontrado calidad de ADN que notable variación de lote a lote. Para resolver esto, se recomienda que los usuarios purifican DNA mediante una preparación midi o maxi, seguido por un paso de limpieza de ADN adicional en la columna de purificación de ADN utilizado en el maxiprep y posterior purificación con un kit de limpieza adicional de ADN. Esto mejora la reproducibilidad en la calidad del ADN para reacciones de PFC y resultados en la producción de la proteína más robusta (figura 2B). El recipiente de la reacción también afecta los rendimientos volumétricos, tal que la producción de proteína de configuraciones de reacción idéntica en diferentes volúmenes del recipiente puede variar hasta un 40%. Se ha teorizado que el aumento en rendimiento volumétrico observado en recipientes más grandes es debido a una mayor superficie de la mezcla de reacción, lo que permite mejor intercambio de oxígeno (figura 2), y otros más han impulsado los rendimientos volumétricos mediante la ejecución de Reacciones de PFC en grandes placas de fondo plano, que recomendamos para reacciones a 100 μl^17,31,37,52.

Figura 1 : Línea de tiempo para el crecimiento de la cultura, la producción de extracto celular, configuración y cuantificación de reacciones PFC. El usuario puede implementar la plataforma de PFC para sus aplicaciones de la investigación a través de este flujo de trabajo de cuatro días. Preparación del reactivo representa la principal de la hora y el costo de inversión para la primera ronda de este experimento y disminuye sustancialmente después de que se establezcan las existencias de reactivos. Además, gránulos de la célula y extracto celular preparado pueden guardarse para más de un año a-80 ° C, que permite al usuario iniciar la línea de tiempo en varios pasos para obtener resultados más rápidos. El usuario también puede hacer una pausa en varios pasos para modificar la línea de tiempo de este flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Condiciones modificables para PFC y los efectos sobre los rendimientos de la reacción volumétrica. Comparación de A. Extracto de productividad basado en la recolección de las células BL21(DE3) en diversas lecturas de₆₀₀ OD. Basado en este terreno, se recomienda cosechar a un OD₆₀₀ de 3.3 para producir al menos 1000 μg/mL de proteína diana. Las reacciones se realizaron a escala 15 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. B. comparación de protocolos de lavado de maxiprep de dos ADN con y sin posterior purificación DNA-limpiezas. pJL1-sfGFP plásmidos experimentaron un maxiprep con uno o dos lavados seguidos por una purificación posterior limpieza kit de purificación de PCR. Para lograr ~ 900 μg/mL de expresión de la proteína, se sugiere realizar una limpieza de ADN purificación después independientemente del número de lavados maxiprep. Las reacciones se realizaron a escala 15 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. C. reacciones de PFC de 15 μl realizan en varios vasos desde 2 mL hasta los tubos del microfuge 0.6 mL. "Neg" representa un control negativo donde ninguna plantilla de la DNA fue agregada a la reacción. Todas las barras de error representan 1 desviación estándar de tres reacciones independientes para cada condición, cada uno de los cuales se cuantificó por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 3 : Extracción de clave procesales configuraciones y resultados para la creación productiva. A. configuración adecuada del baño de agua helada de sonicación para asegurar un enfriamiento de la muestra mientras que el calor se genera durante la sonicación. Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de B. que contiene células resuspendidos pellet pre (izquierda) y sonicación post (derecha). El lisado resultante debe mostrar un tono más oscuro en comparación con el sedimento resuspendido de celulares. C. adecuada separación del sobrenadante y pellet de lisado después 18.000 x centrifugación de g de la célula. D. reacciones de PFC después de 4 h de incubación a 37 ° C. tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a la derecha (reacción exitosa) muestra visible fluorescencia de la proteína de reportero sfGFP ~ 900 μg/ml. El tubo de control negativo a la izquierda, carentes de DNA de la plantilla y que simula una reacción fracasada, muestra una clara solución con ninguna fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 4 : Extracto de cambio en la expresión de la proteína en 5 ciclos de congelación y descongelación para PFC. Extracto preparado a partir del mismo crecimiento experimentó cinco congelación flash congelación seguida por deshielo en hielo ciclos de descongelación por medio de nitrógeno líquido. Cambios significativos en la productividad de extracto para expresar sfGFP no fueron vistos en los cinco ciclos de hielo-deshielo. Las reacciones se realizaron a escala 15 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. "Neg" representa un control negativo donde ninguna plantilla de la DNA fue agregada a la reacción. Todas las barras de error representan 1 desviación estándar de tres reacciones independientes para cada condición, cada uno de los cuales se cuantificó por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : PFC para reacciones con diversos [Mg²⁺] y extraer volúmenes versus [sfGFP]. [Mg^{2 +}] varió de 8 mM a 14 mM con incrementos de 2 mM y extraer volúmenes variaron de 3 μl a 7 μl con incrementos de μL 1. La representa código del color [sfGFP] producido de alta (rojo) a bajo (morado). Para maximizar la eficiencia de reactivos manteniendo la producción de alto valor proteico, se recomienda utilizar 5 μl del extracto y 10 mM de Mg²⁺ para los extractos que tengan un contenido de proteína total de ~ 30 mg/mL, según lo determinado por el análisis de Bradford. Puntos de origen para generar la trama de contorno se basa en fluorescencia extremo de tres reacciones independientes para cada condición, cada uno de los cuales se midió por triplicado. Las reacciones se realizaron a escala 15 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Complementarios figura 1: costo por microgramos de proteína producida y por microlitro de reacción a través de seis plataformas de síntesis de proteína celular gratis. Nuestra plataforma es comparada con cinco diferentes de la célula proteína libre síntesis kits y plataformas con diferentes productividad y precios. Nuestra plataforma de sonicación basado PFC es más rentable en ambos $/ μg de proteína y $/ μl de reacción comercial más kits y proporciona la facilidad de un kit para la configuración de la reacción, mientras que el costo restante comparable a otras plataformas académicas de PFC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Complementarios figura 2: SDS-PAGE de la expresión sfGFP en PFC. Acelulares, las reacciones de síntesis de proteína con el (+ ADN) y sin (-ADN) plantilla de la DNA de sfGFP se ejecuta en un 12% gel SDSPAGE para demostrar la expresión de sfGFP que en 27 kDa (flecha negra). Se utilizaron técnicas tradicionales de SDS-PAGE. Cada muestra a cargar en el gel de extracto incluido 18 μg de la proteína total basada en la cuantificación del análisis de Bradford de la proteína total en la célula. Basado en mediciones de intensidad de fluorescencia y la curva estándar, estimamos que la "+ ADN" carril contiene 0.42 μg de sfGFP. Para obtener estas muestras, las reacciones de PFC fueron funcionadas en una escala de 15 μl en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL produciendo rendimientos volumétricos constantes con figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario figura 3: curva estándar para sfGFP en Cytation 5. Esta curva se determinó utilizando los métodos mencionados anteriormente. Todos los datos recogidos para este manuscrito fue convertido de lecturas de punto final de la fluorescencia a [sfGFP] en μg/mL usando esta curva estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Síntesis de proteínas libres de células se ha convertido en una tecnología potente y propicia para una gran variedad de aplicaciones que van desde comercializa para prototipado rápido de sistemas bioquímicos. La amplitud de aplicaciones es compatible con la capacidad para controlar, manipular y aumentar la maquinaria celular en tiempo real. A pesar del creciente impacto de esta tecnología de plataforma, adaptación amplia ha sido lento debido a matices técnicos en la aplicación de los métodos. A través de este esfuerzo, nuestro objetivo es proporcionar simplicidad y claridad para el establecimiento de esta tecnología en nuevos laboratorios. Con este fin, nuestro protocolo para una e. coli-plataforma de síntesis de proteína sin células base puede lograrse dentro de un tiempo de inicio de cuatro días no-laboratorio capacitado de expertos, como estudiantes de licenciatura (figura 1). Además, una vez que se produce un stock de reactivos y extracto, posterior PFC lote reacciones pueden ser establecidas, incubadas y cuantificadas en apenas 5 h. Un único crecimiento 1 L de las células puede resultar en suficiente extracto para reacciones de PFC 400 15 μl, mientras que preparaciones solo lote de los otros reactivos libres de células pueden soportar miles de reacciones. Preparaciones del reactivo pueden también ampliarse si es necesario una acción aún más grande. Las reacciones de PFC se puede configurar en un modo de alto rendimiento, mediante una placa de 96 pocillos o tubos PCR para la prueba de una variedad de condiciones en paralelo. Rendimientos volumétricos disminuye al utilizar recipientes más pequeños como se ve en la figura 2. Reacciones de PFC pueden también ampliarse de microlitros a decenas de mililitros de volumen de reacción total para aumentar la producción de proteína total para una única condición. Cuando escala por volumen, la consideración primordial es que reacción volumétrica rendimientos disminuyen a medida que la relación superficie a volumen superficial de la reacción disminuye^37,52. Para escalar manteniendo similares rendimientos volumétricos de expresión de la proteína, los usuarios deben dividir el volumen de reacción en los recipientes de reacción o aumentar el tamaño del vaso. Reacción en escalas que van desde 15 μl - 100 μL en el volumen, se recomiendan numerosas reacciones μl 15 en paralelo. Para reacciones superiores a 100 μL en el volumen, se recomiendan las placas de 24 pocillos de fondo plano y placas de 12 pocillos se recomiendan para volúmenes de reacción superior a 600 μl. Tales emparejamientos de los volúmenes de reacción y vasos proporcionan consistencia en los rendimientos de la reacción volumétrica a escala^17,31,37,52. Escalar más allá de estos volúmenes se puede lograr mediante la utilización de múltiples pocillos de la placa en paralelo. Utilizando este formato, la reacción puede ampliarse a más de 10 mL de volumen total. Optimización de la combinación de la reacción reacción volumen recipiente puede soportar aplicaciones de biomanufactura sin sacrificar la productividad de la reacción.

Cuando se realiza este protocolo, hay algunas consideraciones claves que afectan el rendimiento de la reacción volumétrica como indicadores asociados con bajo rendimiento de extracto. Para asegurar la lisis adecuada y para evitar la desnaturalización de la maquinaria de transcripción y traducción funcional, es importante mitigar el calor producido durante la lisis. Sumerja la resuspensión de células en un baño de agua helada durante la sonicación para disipar rápidamente el calor durante la sonicación (Figura 3A). Un indicador de lisis celular eficaz es la aparición de un aspecto más oscuro de la célula lisado en comparación con muestras pre-sonicada (figura 3B). Flexibilidad de usuario, el sonicador y la sonda se muestra en la Figura 3A es adaptable a una gama de volúmenes de 100 μl a 15 mL de células resuspendidas. Para lograr esto, el usuario puede ajustar el número de julios que entrega para la lisis del volumen de las células. Además, mayores volúmenes de extracto pueden ser preparados a través de dos enfoques complementarios. Los usuarios pueden someter a ultrasonidos varios tubos en paralelo, o someter a ultrasonidos mayores volúmenes de resuspensión de células, ampliar la cantidad de energía proporcional con el volumen como la descrita^29,45. Otro paso que indica la calidad del extracto es el paso de centrifugación después de lisis celular. Post de lisis celular, recomendamos centrifugación a 18.000 x g para proporcionar una clara división entre el sobrenadante (maquinaria de transcripción y traducción, ADN genómico fragmentado que ya no funciona para la plantilla de transcripción y traducción) y el pellet ( no deseados componentes celulares como la membrana de la célula y las proteínas precipitadas) (figura 3). Hemos encontrado esa centrifugación en 18.000 x g mejora la separación, dando por resultado mayor reproducibilidad en comparación con giros a velocidades más bajas como 12.000 x g. Para mayor comodidad, se recomienda utilizar una centrífuga refrigerada de mesa, capaz de alcanzar un mínimo de 12.000 x g. Este paso se realiza comúnmente a 30.000 x g, que se debe considerar si el equipo apropiado disponible^{54,55,56,57,58, 59 , 60}. Extracto de rendimiento no es afectado por velocidades de centrifugación en este paso ya que se obtiene la separacion adecuada. Al retirar el sobrenadante deseado, es mejor evitar cualquier nublados materiales que existen en el límite entre el sobrenadante y el pellet ya que esta contaminación reducirá la productividad del extracto. Con el objetivo de pureza del sobrenadante resulta en extractos más productivos y vale la pena la menor cantidad de extracto obtenido para los nuevos usuarios.

Es importante que tenga en cuenta que mientras que los métodos que hemos presentado son reproducibles y pueden ser ejecutados por los científicos con conocimientos mínimos, puede ser lote a lote y la variación de la reacción a la reacción. Esto puede atribuirse a la variación en la composición de Proteómica del lisado post-sonicación⁶¹. Generalmente se disminuye la variabilidad lote a lote que hemos observado sobre la suplementación con T7RNAP y optimización de las concentraciones de magnesio. Adición exógena de T7RNAP es común entre reacciones de PFC para apoyar la expresión de proteína óptima, y encontramos que tiene dos fuentes de T7RNAP - expresión endógena en BL21*(DE3) y el T7RNAP suplementario a una concentración final de 16 μg/mL - mejora reproducibilidad lote a lote para nuevos usuarios^45,46. Con experiencia, los usuarios pueden modificar sus experimentos para utilizar sólo una fuente de T7RNAP si lo desea. Cuantificación del contenido de proteína total de un nuevo lote de extracto y ajuste de concentración de Mg^{2 +} también puede ayudar a disminuir la variación de lote a lote en rendimientos de expresión volumétrica de la proteína. Variaciones en la expresión de la proteína también pueden ser debido a diferencias en el tamaño y la estructura de la proteína de interés, la utilización de codones del gen y su correspondiente sitio de unión del ribosoma del gen de interés, así como el tipo de vector de expresión utilizado^{62 ,63}. Por estas razones, algunas proteínas pueden no expresar así como de la sfGFP modelo de proteína, resultando en rendimientos volumétricos reducidos de reacciones de PFC.

Limitaciones de la técnica de PFC presentada son que pueden no ser directamente apto para todas las aplicaciones de celular, por ejemplo de ingeniería metabólica y regulación de las condiciones de expresión, sin modificaciones a los protocolos. Sin embargo, creemos que este Protocolo será proveen una base para el establecimiento de la plataforma de PFC en nuevos laboratorios y proporcionar la capacidad para poner en práctica introductoria sin células reacciones en sus laboratorios no expertos. Después de la implementación inicial, los investigadores pueden experimentar con la plataforma para hacer sus propias modificaciones para aplicaciones más específicas basadas en otras publicaciones en el campo.

La proteína PFC plataforma costo $ 0,021/μg (excluyendo el costo de mano de obra y equipo), haciendo que nuestro sistema tiene un precio competitivo con kits comerciales sin comprometer la facilidad de configuración de la reacción. Evaluaciones de los costos comparativos por μl de reacción muestran tendencias similares (suplementales figura 1). Calculamos los costos de inicio para ser ~ $4.500 para los reactivos y un adicional de $3.200 para equipo especializado, como un sonicador. Horas para completar este procedimiento se estiman que h ~ 26 para todos preparación reactivo de la tierra para arriba. Sin embargo, una vez que se han preparado grandes existencias de reactivos, demandas de mano de obra disminuyen sustancialmente. Además, como se gana experiencia con la plataforma, recomendamos ampliar el tamaño del crecimiento celular, extracto de preparación y preparación de los reactivos para maximizar la eficiencia de tiempo. Dados los costos de inicio, se recomienda la plataforma de PFC para aplicaciones en biología sintética, esfuerzos de alto rendimiento, y las condiciones de expresión de proteínas que son incompatibles con plataformas de expresión de la proteína tradicional debido al conflicto con la célula limitaciones de la bioquímica y la viabilidad. En estos casos especializados donde la técnica deseada está habilitada por la plataforma de PFC, se justifica el mayor costo de PFC sobre expresión en vivo .

Desarrollo continuo de la plataforma de PFC es probable que proporcionar mayor utilidad a los esfuerzos de la biotecnología como la ingeniería metabólica de vías enzimáticas, la producción y caracterización de proteínas tradicionalmente insuperables, aminoácidos no estándar incorporación y expresión de la proteína natural, fabricación de la medicina estratificada y expandiendo más allá del laboratorio en el aula para madre educación^64,65,66. Estos esfuerzos se verán respaldados además por los esfuerzos en curso para la caracterización detallada de la plataforma de PFC. Una mejor comprensión de la composición del extracto celular conduce a continuo refinamiento hacia rendimientos de reacción mejorado y flexibilidad en las condiciones de reacción^61,de^67,68.

Los autores declaran que tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Autores desean reconocer la Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher y Tony Turretto para soporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams y Christopher Hight para discusiones útiles. Autores también reconocen apoyo de la Bill y Linda helada fondo, centro para aplicaciones en biotecnología Chevron Biotecnología aplicada investigación dotación beca investigación de Cal Poly, estudiante y programa de actividades creativas (RSCA 2017), la financiación y la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconoce la subvención graduado del Universidad del estado de California. MCJ reconoce el ejército investigación oficina W911NF-16-1-0372, National Science Foundation otorga MCB-1413563 y MCB-1716766, la fuerza aérea de investigación laboratorio de centro de excelencia Grant FA8650-15-2-5518, la concesión de la Agencia de defensa amenaza reducción HDTRA1-15-10052/P00001, el David y Lucile Packard Foundation, el programa del erudito profesor Camille Dreyfus, el Departamento de energía BER Grant DE-SC0018249, el programa científico de fronteras humanas (RGP0015/2017), la concesión ETOP DOE Instituto genoma, y el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en Chicago Community Trust para apoyo.