Липидного бислоя эксперименты с контактной пузырь бислоев для патч фиксаторы

Здесь мы представляем протокол для формирования липидных бислоев с помощью метода бислой контакт пузырь. Воду пузырь выдувается в среде органического растворителя, whereby монослоя образуется в интерфейсе вода масло. Два пипетки манипулируют для закрепления пузыри, чтобы сформировать бислоя.

Липидных бислоев обеспечивают уникальный экспериментальной платформы для функциональных исследований ионных каналов, позволяя изучение взаимодействия канала мембраны под различные мембраны липидной композиции. Среди них капелька интерфейс бислой приобрел популярность; Однако размер большой мембрана препятствует запись низкой электрической фоновый шум. Мы создали контактную пузырь бислой (НБР) метод, который сочетает в себе преимущества планарных липидного бислоя и патч зажим методы, такие как способность варьировать состав липидов и манипулировать бислой механика, соответственно. С помощью установки для обычных патч зажим экспериментов, CBB-основе может быть легко эксперименты. Вкратце раствор электролита в стеклянной пипетки выдувается в органических растворителей фазу (гексадекан), и пипетки давление поддерживается для получения размер стабильным пузырька. Пузыря выстлана спонтанно липидов монослоя (чистый липидов или смешанной липидов), которая предоставляется от липосомы в пузырьки. Далее двух картонных монослоя пузыри (~ 50 мкм в диаметре) на кончике стеклянной пипетки прикрепляются для формирования бислоя. Введение восстановленный канал липосомы в пузырь приводит к включению каналов в бислой, позволяя для текущей записи Одноканальный с соотношением сигнал шум сравнима с патч зажим записей. Легко образуются общеиспользуемые с асимметричной липидный состав. CBB неоднократно обновляется путем выдува предыдущих пузыри и формирования новых. Различные химические и физические возмущения (например, мембраны перфузии и бислой напряженности) может быть наложен на общеиспользуемые. здесь, мы представляем основные процедуры для формирования CBB.

Для ионных каналов клеточной мембраны является не просто вспомогательные материалы, но партнером для создания потока ионов. Функционально мембрана является электрических изоляторов, в которых ион внедряются каналы, и установленные с отдыха мембранного потенциала всех клеточных мембран. Условно произвольные мембранного потенциала был введен с внешней цепи, в которой была измерена электрического тока через каналы. Эта количественная оценка ионного потока на различных мембранных потенциалов выявлены молекулярные свойства этих каналов, таких как их ионоселективного проникновение и шлюзовые функций^1,2. Мембрана платформа для функциональных исследований ионных каналов является клеточной мембраны или липидного бислоя мембраны. Исторически одноканальный электрические текущей записи были впервые исполнена в липидных бислоев^3,4, и соответствующие методы были разработаны для клеточных мембран, например метод патч зажим (рис. 1A )^5,6. С тех пор эти две технологии развивались отдельно для разных целей (рис. 1)^7,8.

Бислоя мембран и мембранных липидов в настоящее время находятся в центре внимания исследований для их роли в поддержке структуры и функции белков канала. Таким образом доступность методов варьировать состав липидов в бислоев пользуется большим спросом. Липидного бислоя формирования методы, такие как Вселенский липидного бислоя (ПРБ)^8,9,10,11, капельки воды в нефти бислой¹²и капелька интерфейс бислой (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 ,} общий выбор, обеспечивая возможность для изучения каналов при различных липидной композиции^{20 19} методов (рис. 1). Хотя технически гораздо легче, чем обычные PLB DIB, большой размер DIB создала дестимулирующее воздействие на патч фиксаторы применить его для изучения текущей записи Одноканальный с обычного размера проводимости (< 100 Л.с.).

Чтобы обойти фоновый шум, области бислой должны быть минимизированы. Этот вопрос напоминает повторения истории в разработке электрофизиологических методов липидных бислоев (рис. 1). В первые дни малогабаритные бислой (1-30 мкм в диаметре) был сформирован в наконечник пипетки (Подсказка цинкования метод; Рисунок 1 C) ^{21 , 22 , 23}, а не с помощью свободностоящая бислой (~ 100 мкм в диаметре) на гидрофобной перегородки в камере (рис. 1Б). Подсказка цинкования метод для электрических измерений с гораздо ниже фонового шума²⁴. Наш опыт с^25,26ПРБ, подсказка цинкования^22,,2327и патч зажим^{28,29,30, 31} методы привели нас к роман идея формирования липидных бислоев, используя принципы бислой воды в нефти. Мы говорили это как контакт пузырь бислой (НБР) метод^20,32. В этом методе, а не висит капли воды в масляной фазы (рис. 1D), воду пузырь выдувается из стеклянной пипетки (с наконечник диаметром около 30 мкм) в масляной фазы (Рисунок 1E и 2), где пузырь поддерживается постоянное давление. Однослойная формы самостоятельно в интерфейсе вода масло на поверхности пузыря. Затем два пузыри закреплены посредством манипулирования две стеклянные пипетки и бислой образуется два монослои приближаемся друг друга, давая площадью бислой равновесия. Размер пузыря контролируется интра пузырь давления (холдинг давления), а также размер бислоя. Часто используется средний диаметр 50 мкм. Хотя объем пузырь мал (< 100 pL), он подключен к больший объем пипетки решения, которое находится в диапазоне микролитр, составляющие основная фаза электролита.

Есть много преимуществ для использования метода CBB (Таблица 1). Как метод формирования бислой липидов мембраны различных липидной композиции могут быть изготовлены, и асимметричной мембраны являются более легко сформированные³² , чем обычные складные метод³³. Бислоя могут управляться механически, в отличие от обычных ПРБ, который только может быть изогнут с гидростатического давления разница^34,35. Изменяя давление Холдинг, пузырьки расширить или сжать, приводит к увеличению или уменьшению мембраны напряженности³². Бислой механически съемный в монослои, похож на замораживание перелом техника^36,37 мембран в морфологических исследований, но с CBB, маневр позволяет для многократного отсоединения и присоединения циклов³² . Небольшой объем раствора электролита внутри пузыря позволяет эффективное слияние в бислой восстановленный канал липосом, и вероятность получения канала записи намного выше, чем с обычными PLB техникой. Объем маленький пузырь также позволяет быстрое перфузии (в ~ 20 мс) раз еще инъекцию пипеткой вставляется в любой из пузырьков. В отличие от метода патча зажим после сломанной, CBB мембрана вновь формируется сразу и неоднократно, и пипетки может использоваться несколько раз в день. Объединяя преимущества патч зажим и ПРБ методов, CBB обеспечивает универсальная платформа для физико-химических условий мембраны, учитывая беспрецедентный исследования взаимодействий канала мембраны.

Прежде чем представить подробный протокол процесса формирования CBB, физико-химический фон бислой формирования представлена первая, которая будет полезна для патч фиксаторы для разрешения экспериментальной трудности, связанные с формирования мембраны которые встречаются.

CBB эксперименты распространять уроки химии поверхности науки³⁸. CBB похож на мыльный пузырь ветром из соломы в воздух, где аналогичным образом, воду пузырь выдувается в органическом растворителе. Один будет заметить, что воду пузырь надувается вряд ли когда липиды мембран не включаются в пузырь воде или органических растворителях. В отсутствие амфифильными липиды поверхностное натяжение в водно нефтяных интерфейс высок, и давление внутри пузырь для дуть пузырь будет высоким. Это реализация уравнения Лапласа (ΔP = 2 γ/R, где ΔP давление внутри пузырь, γ-это поверхностное натяжение, и R-радиус пузырь). При высокой концентрации липидов в органические фазы или раствор электролита плотность липидов в монослое увеличивается, как продиктовано изотермы адсорбции Гиббс (-dγ = Γ_я dµ_я, где это Γ,_я поверхности избыток соединения и µ,_я это химический потенциал компонента i)³⁹, ведущего к нижней поверхностное натяжение и легкость формирования пузыря. CBB бислоя могут наблюдаться от тангенциальный угол (рис. 2), в угол контакта между монослоя и бислой поддается измерению. Этот угол представляет равновесие между surface tensions монослоя и бислой (молодые уравнение: γ_bi = γ cos(θ)_МО , где γ_Би бислой напряженность, γ_МО -это однослойная напряженность, и θ угол контакта). Изменения в угол контакта указывают изменения в бислой напряженности, учитывая, что напряженность монослоя оценивается от изменений в угол контакта как функция мембранного потенциала (молодые-Lippmann уравнение: γ_mo = C_m V² /4 (cos (₀θ) - cos (θ_v)), где C_m является емкость мембраны, V мембранного потенциала, и θ₀ и θ_v — контактные углы на 0 и В МВ, соответственно)^{40,41 ,42}. Когда два пузырьки являются достаточно близко, они подходят друг другу спонтанно. Это объясняется ван дер Ваальса силы, и мы можем визуально наблюдать этот динамичный процесс в формировании CBB.

CBB система состоит из отдельных этапов: а именно, массовых масляной фазы, вода пузыри, покрытые монослоя и контактирующих бислой (рис. 3). Они напоминают несколько фаз, наблюдаемые в Ипр, например вокруг этапа бислоя и тонких органических фазы, зажатая двумя монослои^43,44Тора, содержащих растворители. В CBB фазы монослоя непрерывный с бислой листовку, и липидные молекулы легко распространять между монослоя и листовки. Фазы монослоя охватывает большую часть поверхности пузыря, составляющих важный этап, который служит водохранилище липидов. Потому что гидрофобные хвост липидов в монослое распространяется наружу масляной фазы массового, бислой интерьер или гидрофобные core открывает масляной фазы массового. Таким образом гидрофобное вещество вводят в масляной фазы рядом бислой возможность легко получить доступ к бислой интерьер. Это техника перфузии мембраны, мы разработали недавно⁴⁵, в которой состав липидов в бислой меняется быстро (в секунду) в один канал текущей записи. Мы обнаружили, что содержание холестерина в бислой может контролироваться обратимо путем переключения холестерина перфузии и выключать⁴⁵. В том случае, если концентрации соответствующего вещества в монослое и бислой отличается, градиент концентрации соответствующего вещества немедленно расторгается путем диффузии, который известен как эффект Марангони^{46, 47}. с другой стороны, Вьетнамки через монослои являются медленными^48,,4950.

С помощью метода CBB, бислой формируется под универсальный физико-химических условий, таких как электролит рН, как низко как 1 ⁵¹, концентрация соли (⁺K, Na⁺, и т.д.) до 3 М, мембранный потенциал как высокий как ±400 МВ и системы температуре до 60 ° C.

Есть несколько вариантов для формирования CBB и включения канала молекул нем. Для формирования монослоя на интерфейсе вода масло липиды добавляются либо в среде органического растворителя (липидов out метода; Рисунок 4 A, 4 C) или в пузырь как липосомы (липидов в метод; Рисунок 4 B, 4 D). В частности липидов в метод позволяет для формирования асимметричной мембраны^15,32. Канал молекул растворим в растворе (например, канал формирование пептиды) напрямую добавляются в пузырь (рис. 4A, B)^52,53, тогда как источник белков воссоздана в липосомы, которые затем добавляются в пузырь (рис. 4C, D). Здесь формирование общеиспользуемые методом липидов в для любой канал пептида (polytheonamide B (ПТБ); Рисунок 4 A) или показано белок (КГГА калия канал, рис. 4C).

1. Подготовьте липосом

1. Разогнать фосфолипидов (например, 10 мг в порошок) в хлороформе в нужной концентрации (например, 10 мг/мл).
2. Испарится хлороформ.
   1. Место решение фосфолипидов в раунд нижней колбе и установить его на роторный испаритель (см. Таблицу материалы) подключены к N₂ баллона. Вращайте колбу под N₂ потока при комнатной температуре до тех пор, пока фильм тонкие фосфолипидного появляется (после ~ 30 мин).
   2. Поместите открыть колбу в эксикатор, который подключен к вакуумного насоса. С помощью вакуумного насоса, аспирационная внутри эксикатора на несколько часов тщательно удалить хлороформ.
3. Добавить соответствующий объем раствора электролита в колбу и приостановить фосфолипидов для получения фосфолипидов подвеска 2 мг/мл.
4. Sonicate подвеска для нескольких десятков секунд, с использованием sonicator ванна (см. Таблицу материалы), для получения многослойных везикул (МЛВ) подвеска.
5. Для приготовления proteoliposomes, которые содержат ионного канала белки, добавить раствор белка (с белками, солюбилизирован, с использованием соответствующих моющих средств; 2% по объему-это максимум) к MLV подвеска и sonicate на несколько секунд, с использованием sonicator ванна.

2. подготовить большой диаметр стеклянной пипетки

1. Установите стакан капиллярные пипетки съемник и изготовить micropipettes с тонкой конических отзыв через двухступенчатый потянув.
2. Установите микропипеткой на microforge и контакт кончика микропипеткой в платиновой нити на конической части с диаметром от 30 до 50 мкм.
3. Тепло накаливания кратко (5 s) и немедленно выключите его.
   Примечание: Эта манипуляция формы трещины на нагрев точка, которой является отрезать кончик микропипеткой, оставляя широкие отверстия с диаметром от 30 до 50 мкм.

3. Обработайте поверхность стекла слайд с мелкой вогнутый колодец (Siliconization для водоотталкивающей отделкой)

1. Очистите поверхность стекла слайда с мелкой хорошо с дистиллированной воды и этанола.
2. Применить соответствующий объем (например, 100 мкл) siliconizing реагента (водоотталкивающим) на стекло слайд отверстие.
3. Сухого реагента полностью в воздухе.
4. Место стеклянное скольжение на сцене инвертированным микроскопом.

4. форма CBB и электрофизиологические измерения

1. 100 мкл гексадекан, в мелкой хорошо стекла слайд силицированного отверстие.
   Примечание: Для метода липидов из фосфолипидов разметаны в гексадекан (20 мг/мл) заранее.
2. Заполните половину длины микропипеткой, используя шприц туберкулиновые раствор электролита.
3. Установите микропипеткой на микропипеткой держатель с портом давления, позволяя Ag/AgCl проволока электрода для Замочите в растворе электролита пипеткой.
4. Подключите один из владельцев микропипеткой главный этап патч зажим усилителя и другое одно к электросети местах.
5. Подключите microinjector к порту давления микропипеткой держателя.
6. Установите микропипеткой для соответствующей позиции над сценой инвертированным микроскопом, манипулируя микроманипулятор.
7. Отрегулируйте смещение электрода потенциал.
   1. Место 1 мкл же раствор электролита используется для заполнения микропипеткой на плоской поверхности вокруг мелкой хорошо отверстие слайд стекла, создавая куполом электролита.
   2. Замочите кончик обоих micropipettes в электролит купол, манипулируя микроманипулятор.
   3. Отрегулируйте смещение потенциал электрода патч зажим усилителя.
   4. Подтверждение правильного смещения в конце экспериментов, нарушая CBB через применение высоких мембранного потенциала (электрического пробоя; использование зап на усилитель), вызывая два пузырьки будут слиты в один (пузырь фьюжн).
   5. Исправьте жидкого соединения потенциальных⁵⁴ в тех случаях, когда используются асимметричные электролит решения, таким образом, что вычисленное значение добавляется к прикладной потенциал для истинный потенциал мембраны мембраны.
      Примечание: Перекрестка жидкого потенциальных рассчитывается с помощью программы JPCalc⁵⁵.
8. Нарисуйте липосом решение от кончика.
   Примечание: Когда водорастворимый каналы рассматриваются с помощью метода липидов out, отсасывание липосом решения не является необходимым.
   1. Место 1 мкл раствора липосом на плоской поверхности вокруг неглубокие скважины отверстие слайд стекла (липосомы содержащих купол).
   2. Манипулировать микроманипулятор и вставьте наконечник микропипеткой в липосомы содержащих купол.
   3. Аспирационная липосомы содержащих решения путем снижения давления внутри держателя микропипеткой, используя microinjector.
   4. Повторите эту процедуру для других пипеткой.
9. Манипулировать микроманипулятор и погрузите кончик микропипеткой в гексадекан в неглубокие скважины.
10. Удар пузырь вода медленно увеличивая давление до тех пор, пока пузырь достигает нужного размера (например, 50 мкм в диаметре) и в дальнейшем поддерживать такое же давление.
11. Отбросить пузыри, передав кончик через интерфейс масло воздух, если это трудно держать конюшню размер пузырьков.
12. Повторите шаги 4,8-4,9 стабильной пузырьки образуются.
13. Манипулировать пузыри, чтобы позволить контакта между ними (рис. 5).
    Примечание: Иногда, пузырьки подход друг друга самостоятельно сформировать CBB. В других случаях пузырьки близки, но не связаться друг с другом. В этом случае нажмите пузыри друг к другу механически.
14. Отрегулировать давление, чтобы сохранить размер пузырьков, потому что размер может постепенно меняться даже при давлении постоянной интра пузырь.
15. Установите мембрану потенциальных соответствующее значение с использованием патч зажим усилителя и ждать для канала текущего появляться (рис. 6).

5. измерить емкость бислоя

1. Измерьте бислой электрической емкости (_elC), применяя рамп потенциал.
   Примечание: Когда скорость изменения напряжения в команде рамп 10 мВ/10 мс (или 1 V/s), следуют-10 мВ/10 мс, амплитуда текущего перехода после изменения на склоне соответствует чтения membrane'scapacitance значения (например 100 Па → 100 ПФ).
2. Оценить области бислой двух пузыри накладываются один на другой и сосредоточиться Микроскоп на уровне бислой для просмотра края бислой (рис. 6).
   Примечание: Бислой имеет главным образом круглую форму, и площадь вычисляется от радиуса.
3. Рассчитать емкость конкретных мембраны (C_sp) путем деления электрической емкости по области бислой (C_sp =_ЭльC/a).
4. Рассчитать толщину бислой (толщина гидрофобного ядра) с помощью_c D = (ε_rε₀) / c_sp (где ε_r и ε₀ представляют диэлектрической проницаемости гидрофобные региона бислоя и диэлектрическая проницаемость вакуума, соответственно).

Типичная CBB диаметром 50 микрон (рис. 56) и конкретные мембраны емкость в гексадекан 0,65 МКФ/см². Размер пузырька произвольно контролируется давление внутри пузырь. Когда маленькие пузырьки необходимы для записи низким уровнем шума, диаметра кончика должен быть соответственно небольшим. Например для пузырь размером 50 микрон в диаметре, диаметра кончика должно быть 30 мкм.

После того, как сформирован CBB, канал молекул в водном растворе или в липосомы спонтанно были вставлены в бислой в течение нескольких десятков минут. Включение каналов была подтверждена поэтапное увеличение амплитуда тока (рис. 7) под прикладной мембранного потенциала. Меньшую площадь мембраны (< 1000 мкм²) по сравнению с обычными PLB и DIB систем значительно улучшены электрические соотношение сигнал шум.

Текущие записи может быть продолжена до тех пор, пока был сорван мембраны и объединены два пузыри. Новые пузыри были взорваны и CBB формируется сразу и неоднократно. Дозатор может использоваться многократно в течение дня.

Долг цикл присоединения и отсоединения. Бислой, сформированные методом CBB может распался на два монослои. Отсоединить прикрепить CBB может повторяться, манипулируя два пузыри (нагрузка detach-attach). Этот процесс контролируется внешнего вида текущего канала ПТБ, пептид канала от морской губкой, как оно было легко вставляется в липидный бислой сформировать моновалентной катион селективный поры^52,56. Текущий канал ПТБ появились сразу после присоединения двух монослои, и текущий стало больше, как площадь контакта увеличено (рис. 8). Амплитуда тока был синхронизирован с отсоединения-приложите манипуляции CBB.

Один канал измерения КГГА канала. КГГА канала калия — pH чувствительных, активируемая кислой внутриклеточной рН⁵⁷. Таким образом чтобы быть асимметричной^58,,5960был установлен раствор электролита. В шаге 4.2 CBB формирования пипеткой раствора левой стороны был установлен при pH 4, тогда как, с правой стороны был установлен на уровне pH 7.5²⁵. В шаге 4.7.1 proteoliposome подвеска, вместо суспензии липосом, была помещена на слайд стекло для аспирации в левой пипеткой. Соответственно КГГА канал был ориентирован в мембрану с его цитоплазматических доменов, стоящих перед левой пузырь. Липосомы с белка: липидного веса соотношение 1: 2000 подходят для одноканальных текущей записи и те, с 1:10 соотношение для макроскопической текущей записи.

Асимметричная мембраны. Асимметричная липидного бислоя могут быть сформированы с помощью различных липосом суспензий для каждого пузыря (липид в)^15,32. Ориентация в КГГА канал мембраны регулируется, установив асимметричной раствор pH (pH 4_вгипертермальная 7_вне), приводит к их цитоплазматических сторона к левой стороне. Соответственно левой стороне был назначен в качестве «в», тогда как с правой стороны был назначен в качестве «вне.» Для изучения зависимости липидов стробирования КГГА канала, были использованы четыре типа CBB (в том числе асимметричной CBB); а именно, PG_в/PG_из, PG_внастройки_из, PC_в/PGи PC_внастройки_, (PG: фосфатидилглицерина) (Рисунок 9). КГГА канал выставлены вероятность открытой (> 90%) только в PG_в/PG и PG_внастройки_из мембраны. КГГА канал требует наличия анионные фосфолипидов на талоне внутренней мембраны для открытых вероятность²⁶.

Рисунок 1 : Методы липидного бислоя и патч зажим. Различные методы были разработаны для формирования липидного бислоя. (A) патч зажим метод. (B) обычной планарной липидного бислоя метод, который обеспечивает свободностоящая, основном вертикальные, бислой на небольшое отверстие. (C) Tip-методом. Однослойная на воздух вода интерфейс позиционируется на кончике Стеклянный электрод. Были разработаны различные модификации. (D) капли интерфейса бислой метод. (E) контакт пузырь бислой метод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 2 : Контакт формирования пузыря бислой. Как пузырь выдувается в масляной фазы, молекул липидов передачи спонтанно к интерфейсу вода масло. Различные типы липидов, липосомы, включены в каждый пузырь (липидов в), и монослои исключительно формируются соответствующие липиды. Стыковка двух монослои создает асимметричный бислоя мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 3 : Ключевое слово Distinct фаз в бислой контакт пузырь и динамика липидов нем. Липиды, вагонка пузырь составляют этап, где они принадлежат к монослоя или бислоя. Flip-Flop через бислой липидов нечасто, и асимметричной мембраны сохраняется на долгое время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 4 : Доставку липидов с методом липидов out или липидов в. Липиды добавляются либо в среде органического растворителя (липид out; A и C) или в водном растворе как липосомы (липид в; B и D). В методе липидов в формируется асимметричной мембраны. Канал формирование вещества, которые растворяются в водном растворе (синий), такие как пептиды, добавляются в одну из пузырьков и спонтанно вставляется в бислой. В методе липидов в часть каналов вставляется в липосомах, которые затем сливаются в бислой. Восстановленный канал белков (красный) в липосомы в липидов out или липидов в методе, который затем добавлены в один из пузырьков и спонтанно сливается с бислоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 5 : Формирования и микроскопических изображений контакта пузырь бислой. Бислой наблюдается с тангенциальным направления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 6 : Наблюдения бислоя для измерения области бислой. Два пузыри укладываются один на другой через пипетку манипуляции, и Микроскоп ориентирован на уровне контактов пузырь бислоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 7 : Ступенчатой вставки КГГА канала в контакт пузырь бислоя мембраны. E71A мутант КГГА канала был использован для Показать немедленного обнаружения вставленной каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 8 : Отсоединения присоединения монослои и ответы каналов. Канал с пептида, polytheonamide B, была добавлена в одну из пузырьков, которые затем спонтанно частью мембрана. При отсоединении каналы в мембране снял, но были сохранены на мембраны буклет со стороны канала Добавлено. После вложения каналы были вставлены в мембрану. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 9 : Формирование асимметричного мембраны и канала активности зависит от состава листовки. КГГА канал регулируется кислой липиды, таких как PG, в листовке внутренней мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Таблица 1: Характеристики различных липидного бислоя мембран.

CBB метод формирования липидного бислоя основан на принципе капельку воды в нефти, облицованная монослоя²⁰. Технически процедуры для формирования общеиспользуемые легко, особенно для фиксации исследователей, которые владеют в манипулировании стекла micropipettes. Электрофизиологические установки для фиксации легко используется в CBB, когда два манипулятора пипетку с microinjectors доступны. С другой стороны, потому что CBB является преемником обычных ПРБ, который был большой объем физико-химических знаний, накопленных⁸, этот фона, а также знание химии поверхности³⁸ полезно для эксплуатации и манипулируя общеиспользуемые. CBB служит универсальная платформа для изучения взаимодействия канала мембраны с возможностью изменения химического состава и физического состояния⁶¹. В CBB, липиды, вагонка пузырь может свободно диффузного через границу фазы монослоя и листовка бислоя, и у нас есть разработанные методики, такие как бислой прикрепить отделить и мембраны перфузии методы⁴⁵. Мы продлили общеиспользуемые в vitro канал синтеза белка, где синтез канала была исполнена в пузырь, и недавно синтезированных канал белки были подвергнуты спонтанное передаче бислой под применение мембранного потенциала где функции зарождающейся каналов КГГА канала была прослежена с момента инициирования транскрипция/перевод КГГА ДНК⁶².

Среди шагов, протокола поддержание размер пузырька имеет решающее значение. Пузыри могут медленно набухают или сжать спонтанно потому что липидов передача интерфейса является медленным и напряженность монослоя подвержен изменения. В частности первый пузырь, завышенные сразу после всасывания липосом раствора (шаги 4.8.3 и 4.10) трудно поддерживать, потому что напряжение монослоя снижен липосомы накопленных на кончике пипеткой. Отбрасывая первоначальный пузыри и последующее формирование пузырьков обеспечивают стабильное CBB. Визуального отслеживания размер пузырьков и тонкой настройки давления являются необходимыми.

Есть экспериментальные ограничения метода CBB. Хотя CBB предназначен для электрофизиологические измерения, электрическое сопротивление бислоя для некоторых липидной композиции не может быть достаточно высоко (например, 100 GΩ) для одноканальной записи. К примеру dioleoyl фосфатидилхолина часто используется для липосомы, но она образует электрически Дырявый общеиспользуемые при 25 ° C⁶³. Общеиспользуемые даже не могут быть сформированы с липидов видов которых температура стеклования фазы находится выше запись температуры. Действительно CBB формирования было трудно с dipalmitoyl фосфатидилхолинов при комнатной температуре, но повышение температуры выше T_m обойти проблемы⁶⁴. В этих экспериментах, температура контролировалась с помощью прозрачной калильная пластина (см. Таблицу материалы) под слайдом стекла⁶². Температура стеклования фаза часто используемых липидов diphytanoyl фосфатидилхолина ниже 0 ° C ⁶⁵, и общеиспользуемые легко сформированные^32,45,51 в широком диапазоне температур.

Фосфолипиды водно нефтяных интерфейса предоставляются либо липидов или липидов out метода, где скорость передачи сравнительно медленнее в липидов out чем в метод липидов в⁶³. Кроме того по неизвестным причинам, электрическое сопротивление бислоя мембраны относительно меньше с методом липидов out чем с методом липидов.

В протоколе (шаг 4,8), раствор липосомы и восстановленный канал липосомы (1 мкл) загружается из кончика пипетки (шаги 4.9 и 4.10), и остальная часть пипетки содержит решение ранее заполненные электролитом. Это просто для сохранения материалов, таких как липиды и канал молекул. Следовательно липосомы диффузного постепенно к верхней пипеткой раствор, и через некоторое время, концентрации липидов на кончике пипеткой становится недостаточным для формы липидного монослои. В этом случае свежие липосом решение должно быть придыхательным от кончика (шаг 4.8). Это изменение временной концентрации можно обойти, когда весь пипеткой заполняется с раствор, содержащий липиды и канал молекул, тогда как липосомы постепенно поселиться в пузырьки. В этом случае возобновляются пузыри.

Electrophysiologically CBB размер больше, чем патч зажима, таким образом давая больше емкость мембраны. Однако, серия сопротивление (электрическое сопротивление в серии мембраны сопротивления) намного ниже (~ 100 kΩ), чем для фиксации (Пипетка сопротивление > 1 MΩ), который ускоряет скорость мембраной и ослабляет фоновый шум и серия сопротивление ошибки в зажат напряжение мембраны потенциалов^66,67,68. Фоновый шум является функцией емкости мембраны и сопротивления серии, где сопротивление низким серия дополняет емкость высокий мембраны, что приводит к низкой фоновой шум⁹.

Как правило липидного бислоя экспериментов моющие средства не должны использоваться для мытья посуды. Еще следовые количества моющего средства возмущает целостность бислоя. Органические растворители, такие как хлороформ/метанол и этанол следует использовать для таких целей очистки вместо.

В целом CBB объединяет преимущества фиксации (например, механические манипуляции мембраны) и ПРБ (например, возможность изменять состав липидной мембраны). Различные типы веществ, образуя канал и канал белки были изучены^52,53,69,70. Развитие этого метода является своевременным, поскольку все больше и больше исследователей сосредоточены на канал мембраны взаимодействие и CBB обеспечивает универсальная платформа для различных экспериментов. Далее ожидается экспериментальных разработок в методе CBB.

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Авторы хотели бы поблагодарить Марико Yamatake и Масако Такасима для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана в части, KAKENHI Грант насчитывает 16H, 00759 и 17 H 04017 (так).