Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Lipidici forniscono un'unica piattaforma sperimentale per studi funzionali dei canali ionici, che consente l'esame delle interazioni di canale-membrana sotto membrana varie composizioni lipidiche. Tra loro, il bilayer interfaccia gocciolina ha guadagnato popolarità; Tuttavia, la dimensione grande membrana ostacola la registrazione del rumore di fondo elettrico basso. Abbiamo stabilito un metodo di contatto bolla doppio strato (CBB) che combina i vantaggi del doppio strato lipidico planare e metodi di patch-clamp, ad esempio la possibilità di variare la composizione lipidica e di manipolare la meccanica a doppio strato, rispettivamente. Utilizzando il programma di installazione per esperimenti di patch-clamp convenzionali, esperimenti basati su gancio di traino possono essere eseguiti facilmente. In breve, una soluzione elettrolitica in una pipetta di vetro è soffiata in una fase di solvente organica (esadecano), e la pressione di pipetta viene mantenuta per ottenere una dimensione di bolla stabile. La bolla spontaneamente è fiancheggiata da un monostrato lipidico (lipidi puri o misto di lipidi), che è fornito da liposomi nelle bolle. Successivamente, le due monostrato-foderato bolle (~ 50 µm di diametro) sulla punta delle pipette di vetro vengono ancorate per formazione di doppio strato. Introduzione di liposomi ricostituiti canale nella bolla conduce all'incorporazione di canali in doppio strato, consentendo per la registrazione corrente di singolo canale con un rapporto segnale-rumore paragonabile a quella delle registrazioni di patch-clamp. CBB con una composizione asimmetrica del lipido sono prontamente formate. Il gancio di traino è rinnovato ripetutamente che soffia le bolle precedenti e formando nuovi. Varie perturbazioni fisiche e chimiche (ad es., aspersione di membrana e doppio strato tensione) possono essere imposto il CBB. qui, vi presentiamo la procedura di base per la formazione di CBB.

Per i canali ionici, la membrana cellulare non è semplicemente un materiale di supporto, ma un partner per generare il flusso di ioni. Funzionalmente, la membrana è un isolante elettrico in cui ioni canali vengono incorporati, e tutte le membrane cellulari sono impartite con un potenziale di membrana di riposo. Convenzionalmente, un potenziale di membrana arbitrario è stato imposto da un circuito esterno mediante il quale è stata misurata la corrente elettrica attraverso i canali. Questa valutazione quantitativa del flusso ionico a potenziali di membrana differenti hanno rivelato le proprietà molecolari di questi canali, come loro permeazione iono-selettivi e gating funzioni^1,2. La piattaforma di membrana per studi funzionali dei canali ionici è la membrana delle cellule o la membrana lipidica a doppio strato. Storicamente, monocanale elettriche corrente registrazioni vennero eseguiti per la prima volta nel bilayer del lipido^3,4, e le relative tecniche sono state sviluppate per le membrane cellulari, ad esempio il metodo di patch-clamp (Figura 1A )^5,6. Da allora, queste due tecniche si sono evolute separatamente per scopi diversi (Figura 1)^7,8.

I lipidi della membrana e membrane doppio strato sono attualmente al centro di ricerca per il loro ruolo nel sostenere la struttura e la funzione delle proteine canale. Pertanto, la disponibilità di metodi per variare la composizione lipidica in strati lipidici è in forte domanda. Metodi di formazione bilayer del lipido come il planare del lipido doppio strato (PLB)^8,9,10,11, gocciolina di acqua in olio doppio strato¹²e gocciolina interfaccia doppio strato (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} tecniche (Figura 1) sono scelte comuni, fornendo un'opportunità per esaminare la funzione di canale in variabili del lipido composizioni²⁰. Anche se il DIB è tecnicamente molto più facile da produrre rispetto il PLB convenzionale, le grandi dimensioni della DIB ha creato un disincentivo per patch-affrancate per applicarlo per studiare monocanale registrazioni corrente con usuali dimensioni conduttanza (< 100 pS).

Per aggirare il rumore di fondo, la zona di doppio strato deve essere minimizzata. Questo problema ricorda le ripetizioni di storia nello sviluppo di tecniche elettrofisiologiche per lipidici (Figura 1). Nei primi giorni, un doppio strato di piccole dimensioni (1-30 µm di diametro) è stato formato sulla punta di una pipetta (metodo punta-dip; Figura 1 C) ^{21 , 22 , 23}, anziché utilizzare un bilayer autoportante (~ 100 µm di diametro) su un setto idrofobo in una camera (Figura 1B). Il metodo di punta-dip ammessi per misure elettriche con molto più basso di rumore di sfondo²⁴. Le nostre esperienze con il PLB^25,26, punta-tuffo^22,23,27e patch-clamp^{28,29,30, 31} metodi ci ha portato a una nuova idea di formare lipidici utilizzando i principi del bilayer acqua in olio. Noi abbiamo fatto riferimento a questo come il contatto bolla doppio strato (CBB) metodo^20,32. In questo metodo, piuttosto che appendere le goccioline d'acqua in una fase di olio (Figura 1D), una bolla di acqua è saltata da una pipetta di vetro (con diametro di punta di circa 30 µm) nella fase oleosa (Figura 1E e 2), dove il bolla è mantenuta applicando una pressione costante. Forma un monostrato spontaneamente all'interfaccia acqua-olio sulla superficie della bolla. Quindi, due bolle sono ancorate attraverso la manipolazione di due pipette in vetro e il bilayer è formato come i due strati monomolecolari si avvicinano, producendo un'area di doppio strato di equilibrio. La dimensione della bolla è controllata la pressione intra-bolla (tenendo la pressione), e allo stesso modo la dimensione di doppio strato. Diametro medio di 50 µm è usato frequentemente. Anche se il volume della bolla è piccolo (< 100 pL), è collegato al più grande volume della soluzione pipetta che è nella gamma microlitro, che costituisce la fase di massa dell'elettrolito.

Ci sono molti vantaggi di utilizzare il metodo CBB (tabella 1). Come una tecnica di formazione del doppio strato lipidico, membrane di varie composizioni lipidiche possono essere prodotte e membrane asimmetriche sono più facilmente formato³² rispetto sono quelli tramite il metodo pieghevole convenzionale³³. Il doppio strato possa essere manipolato meccanicamente, a differenza del PLB convenzionale che può solo essere piegato con una differenza di pressione idrostatica^34,35. Modificando la pressione della holding, le bolle o espandere o ridurre, che conduce a membrana aumentata o diminuita tensione³². Il doppio strato è meccanicamente staccabile in strati monomolecolari, simili a di^36,di tecnica³⁷ freeze-frattura delle membrane in studi morfologici, ma con il gancio di traino, una manovra permette per ripetuti cicli³² di collegamento e scollegamento . Il piccolo volume della soluzione dell'elettrolito all'interno della bolla permette efficiente fusione dei liposomi ricostituiti canale in doppio strato, e la probabilità di ottenere registrazioni di canale è molto superiore con la tecnica convenzionale di PLB. Il volume di piccola bolla consente inoltre rapido aspersione (all'interno di ~ 20 ms) una volta un'altra iniezione pipetta viene inserito in una delle bolle. A differenza del metodo di patch-clamp, una volta rotto, una membrana CBB è ri-formata immediatamente e ripetutamente e pipette possono essere utilizzati più volte al giorno. Integrando i benefici del patch-clamp e metodi PLB, il gancio di traino fornisce una piattaforma versatile per variare le condizioni fisico-chimiche della membrana, permettendo senza precedenti studi di interazioni canale-membrana.

Prima di presentare un protocollo dettagliato del processo di formazione di CBB, background fisico-chimiche della formazione del doppio strato viene presentato il primo, che sarà utile per patch-affrancate risolvere difficoltà sperimentali relativi alla formazione della membrana che vengono rilevati.

Esperimenti CBB impartire lezioni di chimica di superficie scienza³⁸. Il gancio di traino è simile a una bolla di sapone soffiata da una cannuccia in aria, dove allo stesso modo, una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico. Si noterà che una bolla d'acqua difficilmente viene gonfiata quando i lipidi della membrana non sono incluse nella bolla d'acqua o il solvente organico. In assenza di amphipathic lipidi, la tensione superficiale a un'interfaccia acqua-olio è elevata e la pressione intra-bolla per soffiare una bolla sarà alta. Si tratta di una realizzazione dell'equazione di Laplace (ΔP = 2 γ/R, dove ΔP è la pressione intra-bolla, γ è la tensione superficiale e R è il raggio della bolla). Quando la concentrazione dei lipidi in fase organica o la soluzione elettrolitica è elevata, aumenta la densità dei lipidi nello strato monomolecolare del, come dettato dalla isoterma di adsorbimento di Gibbs (-dγ = Γ_ho dµ_io, dove Γ è l'eccesso di superficie del composto i e µ_io è il potenziale chimico del componente i)³⁹, che conduce ad una bassa tensione superficiale e la facilità di formazione di bolle. Il gancio di traino, il doppio strato può essere osservato da un angolo tangenziale (Figura 2), nell'angolo di contatto tra il monostrato e doppio strato è misurabile. Questo angolo rappresenta un equilibrio tra il surface tensions del monostrato e doppio strato (equazione giovane: γ_bi = γ_mo cos(θ), dove γ_bi è il tensionamento di doppio strato, γ_mo è la tensione dello strato monomolecolare e θ è l'angolo di contatto). Le modifiche nell'angolo di contatto indicano cambiamenti nella tensione doppio strato, dato che la tensione di monostrato è valutata dalla variazione dell'angolo di contatto in funzione del potenziale di membrana (equazione di Young-Lippmann: γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) - cos (θ_v)), dove C_m è la capacità di membrana, V è il potenziale di membrana, e θ₀ e θ_v sono gli angoli di contatto a 0 e mV V, rispettivamente)^{40,41 ,42}. Quando due bolle sono abbastanza vicini, si avvicinano spontaneamente. Ciò è dovuto la forza di van der Waals, e possiamo osservare visivamente questo processo dinamico nella formazione di CBB.

Un sistema CBB è composto da fasi distinte: vale a dire, una fase di olio sfuso, acqua bolle rivestite con uno strato monomolecolare e un doppio strato di contatto (Figura 3). Queste sono le ricorda le fasi più osservate in un PLB, come un toro contenenti solventi intorno il doppio strato e una fase organica sottile intramezzato da due strati monomolecolari^43,44. Il gancio di traino, la fase di monostrato è in continuità con l'opuscolo di doppio strato, in molecole lipidiche prontamente diffondono tra il monostrato e il foglio illustrativo. La fase dello strato monomolecolare copre la maggior parte della superficie della bolla, che costituiscono la fase principale che funge da serbatoio del lipido. Perché la coda idrofobica dei lipidi nello strato monomolecolare del si estende verso l'esterno per la fase di olio sfuso, all'interno del doppio strato o il nucleo idrofobo viene aperta la fase di olio sfuso. Così, una sostanza idrofoba iniettata nella fase oleosa vicino a doppio strato è in grado di accedere facilmente all'interno del doppio strato. Questa è la tecnica di aspersione di membrana che avevamo sviluppato recentemente⁴⁵, di cui la composizione lipidica a doppio strato è cambiata rapidamente (entro un secondo) durante le registrazioni di corrente di singolo canale. Abbiamo trovato che il contenuto di colesterolo in doppio strato potrebbe essere controllato reversibilmente di accensione/spegnimento⁴⁵la perfusione di colesterolo. Nel caso in cui la concentrazione della sostanza in monostrato e doppio strato è diverso, il gradiente di concentrazione della sostanza in questione è dissolto immediatamente attraverso la diffusione, che è noto come l' effetto Marangoni^{46, 47}. d'altra parte, infradito attraverso gli strati monomolecolari sono lento^48,49,50.

Utilizzando il metodo CBB, il doppio strato è formato in versatile condizioni fisico-chimiche, ad esempio un pH di elettrolito basso quanto 1 ⁵¹, una concentrazione di sale (K⁺, Na⁺, ecc.) fino a 3 M, un potenziale di membrana alto come mV ± 400 e un sistema temperatura fino a 60 ° c.

Ci sono diverse opzioni per la formazione del gancio di traino e l'incorporazione di molecole di canale in esso. Per la formazione di strato monomolecolare all'interfaccia acqua-olio, lipidi vengono aggiunti in un solvente organico (metodo del lipido-out; Figura 4 A, 4 C) o in una bolla come liposomi (metodo del lipido-in; Figura 4 B, 4D). In particolare, il metodo del lipido-in permette la formazione di membrane asimmetriche^15,32. Molecole di canale solubile in soluzione acquosa (ad es., formare canali peptidi) vengono aggiunti direttamente nella bolla (Figura 4A, B)^52,53, considerando che le proteine canale sono ricostituiti nell' liposomi, che vengono quindi aggiunti nella bolla (Figura 4C, D). Nel presente documento, la formazione di CBB dal metodo del lipido-in per un peptide di canale (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteina (KcsA canale del potassio, Figura 4C) è indicata.

1. preparare liposomi

1. Disperdere i fosfolipidi (ad esempio, 10 mg in polvere) in cloroformio a una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mg/mL).
2. Evaporare il cloroformio.
   1. Posto la soluzione del fosfolipide in un pallone e impostare su un evaporatore rotante (Vedi Tabella materiali) collegato a una bombola del gas₂ N. Ruotare il pallone sotto flusso di₂ N a temperatura ambiente fino a quando appare una pellicola sottile del fosfolipide (dopo circa 30 min).
   2. Luogo apra la boccetta in un essiccatore che è collegato a una pompa a vuoto. Usando la pompa del vuoto, aspirare all'interno di un essiccatore per diverse ore per rimuovere accuratamente il cloroformio.
3. Aggiungere un volume adeguato di una soluzione elettrolitica al pallone e sospendere il fosfolipide per ottenere un 2 mg/mL sospensione del fosfolipide.
4. Sonicare la sospensione per diverse decine di secondi usando un sonicatore vasca (Vedi Tabella materiali) per ottenere una sospensione di vescicola multistrato (MLV).
5. Per la preparazione dei proteoliposomi contenenti proteine canale ionico, aggiungere una soluzione proteica (con le proteine solubilizzate con appropriati detergenti; volume 2% è il massimo) per la sospensione MLV e Sonicare per alcuni secondi utilizzando il sonicatore vasca.

2. preparare pipette in vetro di grosso calibro

1. Impostare un vetro capillare di un estrattore di pipetta e fabbricare Micropipette con punta rastremata bene attraverso tirando in due fasi.
2. Impostare la micropipetta su un microforge e contattare la punta della micropipetta a un filamento di platino alla parte conica con un diametro di 30-50 µm.
3. Riscaldare brevemente il filamento (5 s) e spegnere immediatamente.
   Nota: Questa manipolazione forme punto una crepa al riscaldamento, per cui la punta della micropipetta è tagliata fuori, lasciando un ampio foro con un diametro di 30-50 µm.

3. trattare la superficie del vetrino con un pozzo superficiale concavo (siliconizzazione per una finitura idrorepellente)

1. Pulire la superficie del vetrino con un pozzo superficiale con acqua distillata ed etanolo.
2. Applicare un volume appropriato (ad esempio, 100 µ l) di un reagente siliconatura (idrorepellente) sul vetro foro diapositiva.
3. Asciugare il reagente completamente in aria.
4. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio invertito.

4. formare il gancio di traino ed eseguire misurazioni elettrofisiologiche

1. Aggiungere 100 µ l di esadecano nel pozzo superficiale del vetro siliconato foro diapositiva.
   Nota: Per il metodo del lipido-out, i fosfolipidi sono dispersi in esadecano (20 mg/mL) in anticipo.
2. Riempire la soluzione elettrolitica fino a metà della lunghezza della micropipetta, usando una siringa per tubercolina.
3. Impostare la micropipetta sul supporto micropipetta con una presa di pressione, permettendo filo-elettrodo Ag/AgCl in ammollo nella soluzione dell'elettrolito pipetta.
4. Collegare uno dei titolari della micropipetta alla fase testa di un amplificatore di patch-clamp e l'altro per la messa a terra elettrica.
5. Collegare un microinjector alla porta pressione del titolare micropipetta.
6. Impostare la micropipetta su una posizione adeguata sopra il palco di un microscopio invertito manipolando il micromanipolatore.
7. Regolare l'offset di elettrodo potenziale.
   1. Posto 1 µ l della soluzione dell'elettrolito stesso utilizzata per riempire la micropipetta su una superficie piatta intorno al pozzo superficiale del vetro foro diapositiva, creando una cupola dell'elettrolito.
   2. Immergere la punta di entrambi Micropipette nella cupola dell'elettrolito manipolando il micromanipolatore.
   3. Regolare il potenziale di elettrodo offset dell'amplificatore patch clamp.
   4. Confermare il corretto offset alla fine degli esperimenti rompendo il gancio di traino attraverso l'applicazione di un elevato potenziale di membrana (ripartizione elettrica; using Zap dell'amplificatore), causando i due bolle per essere fusi in un (fusione di bolla).
   5. Correggere la giunzione liquida potenziali⁵⁴ nei casi in cui vengono utilizzate soluzioni di elettroliti asimmetrica, tale che il valore calcolato è aggiunto alla membrana applicata potenziale per il vero potenziale di membrana.
      Nota: La giunzione liquida potenziale viene calcolata utilizzando il programma JPCalc⁵⁵.
8. Aspirare la soluzione di liposomi dalla punta.
   Nota: Quando canali solubili in acqua vengono esaminati utilizzando il metodo del lipido-out, l'opzione l'aspirazione della soluzione liposoma non è necessario.
   1. Posto 1 µ l di soluzione di liposomi sulla superficie piana intorno al pozzo superficiale del vetro foro diapositiva (liposomi contenenti cupola).
   2. Manipolare il micromanipolatore e inserire la punta della micropipetta nella cupola liposoma-contenente.
   3. Aspirare la soluzione di liposomi contenenti abbassando la pressione all'interno del supporto di una micropipetta utilizzando il microinjector.
   4. Ripetere la procedura per l'altra pipetta.
9. Manipolare il micromanipolatore e immergere la punta della micropipetta in esadecano nel pozzo poco profondo.
10. Soffiare una bolla di acqua lentamente aumentando la pressione fino a quando la bolla raggiunge la dimensione desiderata (ad es., 50 µm di diametro) e mantenere la stessa pressione da allora in poi.
11. Eliminare le bolle passando la punta attraverso l'interfaccia aria-olio, se è difficile mantenere stabile la dimensione delle bolle.
12. Ripetere i passaggi 4.8-4.9 si formano bolle stabili.
13. Manipolare le bolle per consentire il contatto tra di loro (Figura 5).
    Nota: A volte, le bolle si avvicinano spontaneamente per formare il gancio di traino. In altri casi, le bolle sono vicini ma non a contatto fra loro. In questo caso, spingere le bolle vicenda meccanicamente.
14. Regolare con precisione la pressione per mantenere la dimensione della bolla, perché le dimensioni cambiano gradualmente anche alla pressione costante intra-bolla.
15. Impostare la membrana potenziale con il valore appropriato utilizzando l'amplificatore di patch-clamp e attendere per il canale corrente ad emergere (Figura 6).

5. misurare capacità doppio strato

1. Misurare la capacitanza elettrica doppio strato (C_el) applicando una rampa potenziale.
   Nota: Quando il tasso di variazione di tensione nel comando rampa è 10 mV/10 ms (o 1 V/s) seguita da-10 mV/10 ms, l'ampiezza del salto corrente sull'osservazione dei cambiamenti nel pendio corrisponde alla lettura del valore membrane'scapacitance (ad es. 100 pA → 100 pF).
2. Valutare l'area di doppio strato di due bolle impilati uno su altro e concentrarsi al microscopio a livello di doppio strato per visualizzare il bordo del bilayer (Figura 6).
   Nota: La forma di doppio strato per lo più è circolare, e viene calcolata l'area dal raggio.
3. Calcolare la capacità specifiche della membrana (C_sp) dividendo la capacitanza elettrica dalla zona del doppio strato (C_sp = C_el/A).
4. Calcolare lo spessore del doppio strato (spessore del nucleo idrofobo) utilizzando D_c = (ε_rε₀) /C_sp (dove ε_r e ε₀ rappresentano la costante dielettrica della regione idrofobica del bilayer e la costante dielettrica di un vuoto, rispettivamente).

Un tipico CBB aveva un diametro di 50 µm (Figura 56) e la capacità di membrana specifici in esadecano era 0,65 µF/cm². La dimensione della bolla è stato arbitrariamente controllata dalla pressione intra-bolla. Quando piccole bolle sono necessari per le registrazioni di basso rumore, il diametro della punta deve essere corrispondentemente piccolo. Ad esempio, per una dimensione di bolla di 50 µm di diametro, il diametro della punta dovrebbe essere 30 µm.

Una volta che aveva formato il gancio di traino, le molecole di canale in soluzione acquosa o nel liposoma spontaneamente sono state inserite in doppio strato in un arco di poche decine di minuti. Inserimento dei canali è stata confermata tramite l'aumento graduale di ampiezza corrente (Figura 7) sotto il potenziale di membrana applicata. L'area più piccola di membrana (< 1.000 µm²) rispetto a quello in convenzionale PLB e DIB sistemi sostanzialmente migliorato il rapporto segnale-rumore elettrico.

Le registrazioni attuali potrebbero essere continuate fino a quando la membrana è stata interrotta e fuse le due bolle. Nuove bolle sono saltati in aria e il gancio di traino formata immediatamente e ripetutamente. La pipetta potrebbe essere utilizzata ripetutamente entro un giorno.

Duty cycle di attach e staccare. Un bilayer costituito mediante il metodo CBB può essere disintegrato in due strati monomolecolari. Staccare-attaccare del gancio di traino possono essere ripetuti manipolando le due bolle (duty cycle del detach-attach). Questo processo è stato monitorato dalla comparsa dell'attuale canale di pTB, un canale di peptide da una spugna marina, come è stato prontamente inserito nel bilayer del lipido per formare un poro selettivo catione monovalente^52,56. Il canale di pTB corrente emerse immediatamente dopo aver collegato i due strati monomolecolari, e la corrente è diventato più grande come l'area di contatto aumentato (Figura 8). L'ampiezza della corrente è stato sincronizzato con la disconnessione-allegare manipolazione del gancio di traino.

Singolo canale misurazioni del canale KcsA. Il canale del potassio KcsA è pH sensibile, attivando da acida pH intracellulare⁵⁷. Così, la soluzione elettrolitica è stata impostata per essere asimmetrica^58,59,60. Al punto 4.2 della formazione di CBB, la soluzione di pipetta del lato sinistro è stata impostata a pH 4, mentre quella di destra è stato fissato a pH 7.5²⁵. Nel passaggio 4.7.1, un proteoliposome sospensione, piuttosto che la sospensione dei liposomi, è stato disposto sul vetro diapositiva per aspirazione nella pipetta sinistra. Di conseguenza, il canale KcsA era orientato nella membrana con relativo dominio citoplasmico affrontando la bolla di sinistra. Liposomi con il rapporto di peso proteine: lipidi di 1: 2000 sono adatti per la registrazione corrente monocanale e quelli con un 01:10 ratio sono per la registrazione corrente macroscopica.

Membrana asimmetrica. Un doppio strato lipidico asimmetrica può essere formata utilizzando sospensioni di liposomi differenti per ogni bolla (lipido-a)^15,32. L'orientamento del canale KcsA nella membrana è stata regolata impostando un pH di soluzione asimmetrica (pH 4_apH 7_fuori), che conduce al suo lato citoplasmico essere verso il lato sinistro. Di conseguenza, il lato sinistro è stato assegnato come "in", mentre il lato destro è stato assegnato come "out". Per esaminare il gating del canale KcsA dipendenza dai lipidi, sono stati utilizzati quattro tipi di CBB (tra cui un CBB asimmetrica); vale a dire, PG_in/PG_fuori, PGin/PC_fuori, PC_in/PG_fuorie PCin/PC_fuori (PG: fosfatidilglicerolo) (Figura 9). Il canale KcsA esposte ad alta probabilità aperta (> 90%) solo nel PG_in/PG_fuori e PG/PC_su membrane_in. Il canale KcsA richiede l'esistenza di fosfolipidi anionici nell'opuscolo interno della membrana per un' alta probabilità aperta²⁶.

Figura 1 : Metodi di doppio strato e patch-clamp di lipido. Vari metodi sono stati sviluppati per formare il doppio strato lipidico. (A) metodo Patch-clamp. (B) metodo di doppio strato lipidico planare convenzionale, che fornisce un bilayer autoportante, prevalentemente verticale, su un piccolo foro. Metodo (C) punta-dip. Un monostrato all'interfaccia aria-acqua è posizionato sulla punta di un elettrodo di vetro. Sono state sviluppate varie modifiche. (D) metodo di doppio strato di goccia interfaccia. (E) bolla doppio strato metodo di contatto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2 : Contattare la formazione di bolle bilayer. Come una bolla è soffiata in una fase di olio, molecole lipidiche trasferire spontaneamente all'interfaccia acqua-olio. Diversi tipi di lipidi come liposomi sono inclusi in ciascuna bolla (lipido-in), e monostrati sono costituiti esclusivamente da lipidi pertinenti. Docking station per due strati monomolecolari genera una membrana a doppio strato asimmetrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3 : Distinct fasi nel bilayer del contatto bolla e la dinamica dei lipidi in esso. Lipidi fodera la bolla costituiscono una fase cui appartengono a un monostrato o un bilayer. Flip-flop dei lipidi attraverso il doppio strato è rara e la membrana asimmetrica viene mantenuta per lungo tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4 : Fornire lipidi con il metodo del lipido-out o del lipido in. I lipidi sono aggiunti in un solvente organico (lipido-fuori; A e C) o in soluzione acquosa come liposomi (lipido-in; B e D). Nel metodo del lipido-in, si forma una membrana asimmetrica. Canale-formare sostanze che sono solubili in soluzione acquosa (blu), come i peptidi, vengono aggiunti in una delle bolle e spontaneamente inserite nel doppio strato. Nel metodo del lipido-in, una parte dei canali è inserita nei liposomi, che si sono poi fuse a doppio strato. Proteine canale (rosso) vengono ricostituiti nei liposomi nel metodo del lipido-out o del lipido-in, che sono poi aggiunti in una delle bolle e spontaneamente fusa a doppio strato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 5 : Formazione e immagine microscopica del contatto bolla bilayer. Il doppio strato è osservato da una direzione tangenziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 6 : Osservazione del bilayer per misurare la superficie di bilayer. Due bolle sono impilate uno su altro attraverso la manipolazione di pipetta, e il microscopio si concentra a livello del bilayer contatto bolla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 7 : Inserimento graduale del canale KcsA nella membrana del doppio strato di contatto bolla. Il mutante E71A del canale KcsA fu utilizzato per dimostrare l'individuazione immediata dei canali inseriti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 8 : Collegamento scollegamento di monostrati e risposte dei canali. Un canale di peptide, polytheonamide B, è stato aggiunto in una delle bolle, che poi è stato spontaneamente incorporato nella membrana. Quando scollegato, canali nella membrana si è ritirato ma vennero mantenuti all'opuscolo membrana del lato canale-aggiunto. All'allegato, i canali sono stati inseriti nella membrana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 9 : Formazione di un'attività asimmetrica, membrana e canale, dipenda dalla composizione del foglio illustrativo. Il canale KcsA è regolato da lipidi acidi, come PG, l'opuscolo interno della membrana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Tabella 1: Caratteristiche delle varie membrane di bilayer del lipido.

Il metodo CBB di formazione bilayer del lipido è basato sul principio di una gocciolina di acqua in olio allineata da un monostrato²⁰. Tecnicamente, le procedure per la formazione di CBB sono facili, soprattutto per i ricercatori di patch-clamp, che sono esperti nella manipolazione delle micropipette di vetro. L'installazione elettrofisiologica per il morsetto di toppa prontamente viene utilizzato il gancio di traino quando due manipolatori di pipetta con microinjectors sono disponibili. D'altra parte, poiché il gancio di traino è un successore del PLB convenzionali, per cui una grande quantità di conoscenze chimico-fisico è stato accumulato⁸, questo sfondo così come la conoscenza della chimica delle superfici³⁸ è utile per il funzionamento e manipolazione di CBB. Il gancio di traino serve una piattaforma versatile per lo studio di canale-membrana interrelazioni con la sua capacità di modificare la composizione chimica e stato fisico⁶¹. Nel gancio di traino, lipidi fodera la bolla possono diffondere liberamente attraverso il confine della fase dello strato monomolecolare e illustrativo del bilayer, e abbiamo sviluppati tecniche come il bilayer scollegamento e la membrana aspersione metodi⁴⁵. Abbiamo esteso CBB per in vitro sintesi proteica di canale, dove sintesi del canale è stato effettuato nella bolla, e proteine canale recentemente sintetizzati sono stati sottoposti a trasferimento spontaneo a doppio strato sotto l'applicazione di un potenziale di membrana dove funzioni canale nascente del canale KcsA è stato tracciato dal momento di inizio della trascrizione/traduzione del DNA KcsA⁶².

Tra i passaggi del protocollo, mantenere la dimensione della bolla è fondamentale. Le bolle possono lentamente si gonfiano o ridurre spontaneamente perché il trasferimento del lipido all'interfaccia è lento e la tensione di monostrato è incline a cambiare. In particolare, la prima bolla gonfiata appena dopo l'aspirazione della soluzione liposoma (passaggi 4.8.3 e 4.10) è difficile da mantenere perché la tensione monostrato è abbassata da liposomi accumulata sulla punta della pipetta. Scartando le bolle iniziale e la successiva formazione delle bolle forniscono il gancio di traino stabile. L'analisi visiva delle dimensioni della bolla e la regolazione fine della pressione sono necessarie.

Non ci sono limiti sperimentali al metodo CBB. Sebbene il gancio di traino è stato progettato per misurazioni elettrofisiologiche, la resistenza elettrica del bilayer per alcune composizioni lipidiche potrebbe non essere abbastanza in alto (ad esempio, 100 GΩ) per le registrazioni monocanale. Ad esempio, dioleoyl fosfatidilcolina è usato frequentemente per liposomi, ma esso si forma CBB elettricamente che perde a 25 ° C⁶³. CBB non può essere formato anche con specie di lipidi cui temperatura di transizione di fase è di sopra della temperatura di registrazione. Infatti, CBB formazione era difficile con dipalmitoyl fosfatidilcolina a temperatura ambiente, ma alzando la temperatura sopra T_m aggirato il problema⁶⁴. In questi esperimenti, la temperatura era controllata utilizzando una piastra di calore trasparente (Vedi Tabella materiali) sotto la diapositiva vetro⁶². La temperatura di transizione di fase della fosfatidilcolina diphytanoyl frequente del lipido è inferiore a 0 ° C ⁶⁵e CBB sono prontamente formato^32,45,51 a un ampio intervallo di temperature.

Fosfolipidi dell'interfaccia acqua-olio sono forniti da entrambi il metodo del lipido-in o del lipido-out, dove la velocità di trasferimento è relativamente più lenta in lipido-out rispetto nel metodo del lipido-in⁶³. Inoltre, per ragioni sconosciute, la resistenza elettrica della membrana doppio strato è relativamente più piccola con il metodo del lipido-out anziché con il metodo del lipido-in.

Il protocollo (passo 4.8), una soluzione di liposomi e liposomi ricostituiti a canale (1 µ l) viene caricata dalla punta della pipetta (passaggi 4.9 e 4.10), e il resto della pipetta contiene la soluzione elettrolitica precedentemente riempito. Questo è solo per una buona conservazione di materiali, come i lipidi e molecole di canale. Di conseguenza, i liposomi si diffondono gradualmente verso la soluzione di pipetta superiore e dopo un po', la concentrazione di lipidi sulla punta della pipetta diventa insufficiente per strati monomolecolari del lipido di forma. In questo caso, soluzione liposoma fresco dovrebbe essere aspirato dalla punta (passo 4.8). Questo cambiamento di concentrazione temporale può essere aggirato quando la pipetta intera viene riempita con la soluzione contenente lipidi e molecole di canale, considerando che i liposomi gradualmente stabilirsi nelle bolle. In questo caso, le bolle vengono rinnovate.

Electrophysiologically, la dimensione CBB è più grande di quello del morsetto patch, producendo così una più grande capacità di membrana. Tuttavia, la resistenza in serie (la resistenza elettrica in una serie di resistenza di membrana) è molto inferiore (~ 100 kΩ) a quello per il morsetto di patch (pipetta resistenza > 1 MΩ), che accelera la velocità del morsetto tensione e attenua il rumore di fondo e gli errori di resistenza di serie la tensione-premuta membrana potenziali^66,67,68. Il rumore di fondo è una funzione della capacità di membrana e la resistenza in serie, dove una bassa resistenza serie integra una capacità di membrana alta, con conseguente rumore di fondo basso⁹.

Come regola di esperimenti di bilayer del lipido, detergenti non devono essere utilizzati per lavare i bicchieri. Ancora una quantità in tracce di detersivo perturba l'integrità del bilayer. Solventi organici quali cloroformio/metanolo ed etanolo devono essere utilizzati invece per tali scopi di pulizia.

Nel complesso, il gancio di traino integra i vantaggi di entrambi il patch clamp (ad esempio, la manipolazione meccanica della membrana) e il PLB (ad esempio, la possibilità di modificare la composizione lipidica della membrana). Vari tipi di proteine canale e canale-formare sostanze sono state studiate^52,53,69,70. Lo sviluppo di questo metodo è opportuno, poiché sempre più ricercatori si stanno concentrando su interazione canale-membrana e il gancio di traino fornisce una piattaforma versatile per vari esperimenti. Si prevedono ulteriori sviluppi sperimentali nel metodo CBB.

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Gli autori vorrei ringraziare Mariko Yamatake e Masako Takashima per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da KAKENHI grant numeri 16H 00759 e 17 H 04017 (SO).