Оценка взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии

Дополнительным компонентом C1q является провоспалительная молекула, высоко выраженная в микроокружении тканей, которая может взаимодействовать с внеклеточной матрицей. Здесь мы описываем метод, чтобы проверить, как C1q связаны с гиалуроновой кислотой влияет на сливки клеток.

Все чаще становится очевидным, что микроокружение опухоли играет активную роль в росте неоплазии и метастазах. Через различные пути, опухолевые клетки могут эффективно набирать стромальные, иммунные и эндотелиальные клетки путем выделения стимулирующих факторов, хемокины и цитокины. В свою очередь, эти клетки могут изменять сигнальные свойства микросреды, высвобождая стимулирующие рост сигналы, метаболиты и внеклеточные матричные компоненты для поддержания высокой пролиферации и метастатического свойства. В этом контексте мы определяем, что компонент C1q, высоко выраженный локально рядом злокачественных опухолей человека, при взаимодействии с внеклеточной матричной гиалуроновой кислотой, сильно влияет на поведение первичных клеток, изолированных от опухоли человека Образцов. Здесь мы описываем метод проверки того, как C1q, связанный с гиалуроновой кислотой (HA), воздействует на сливные клетки опухоли, лежащие в основе того факта, что биологические свойства ключевых компонентов внеклеточной матрицы (в данном случае HA) могут быть сформированы биоактивными сигналами к опухоли Прогрессии.

Микросреда опухоли (TME) влияет на развитие рака и прогрессирование, поскольку она может обеспечить вседозволенную нишу для выживания клеток, роста и вторжения. Выявление новых ключевых игроков в ТМЕ может быть полезным для открытия новых молекулярных инструментов для целевой терапии. TME включает в себя сложную и динамичную сеть незлокачественных клеток, таких как эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки иммунной системы, встроенные в окружающие внеклеточные матеновые компоненты (ECM), включая коллагены, ламинины, фибронектины, протеогликанов и гиалуронов. Как опухолевые, так и неопухолевые клетки синтезируют и выделяют компоненты ECM вместе с цитокинами, хемокинами, факторами роста и воспалительными и матричными ремоделирования ферментов, которые в целом изменяют физические, химические и сигнальные свойства TME. Среди этих компонентов, гиалуроновая кислота (HA) возникла оказывать решающую роль в биологии опухоли. Несмотря на свой простой химический состав, HA, вместе с его HA-связывающих молекул (гиаладеринов), может модулировать ангиогенез, иммунная система отзывчивость и ECM ремоделирования в размере и концентрации зависимым образом¹.

Система дополнения (С) также является частью местной ТМЭ, которой в последнее время уделяется все большее внимание. Система C включает в себя набор растворимых и мембранных белков, участвующих в первой линии защиты от не-самоклеток, нежелательных элементов хозяина и патогенных микроорганизмов. Функционально, C связывает двух-эффектор оружия врожденных и адаптивных систем для содействия либо прямого убийства клеток или монтажа воспалительных ответ². C активация может подавить рост опухоли, путем уничтожения раковых клеток или ингибирования их роста, но становится все более очевидным, что он может обладать опухолевых поощрения деятельности путем поддержания хронического воспаления, способствуя созданию иммуносупрессивной среде, вызывая ангиогенез, и активации рака связанных сигнальных путей³. В этом контексте, C1q, первая молекула распознавания классического пути системы C появился для оказания важных функций в микросреде опухоли независимо от активации C⁴. C1q было показано, что выражается локально целый ряд человеческих злокачественных опухолей, где он может способствовать раковой клетки адгезии, миграции и распространения в дополнение к ангиогенеза и метастазов⁵. Интересно, что C1q взаимодействует с основным компонентом ECM, таким как HA.

Мы разработали метод изолировать первичные раковые клетки от опухолевой массы. Кроме того, мы создали матрицу, которая может стимулировать микроокружение опухоли, в частности взаимодействие между C1q и высокомолекулярной гиалуроновой кислотой. C1q связаны с HA удалось вызвать сливку опухолевых клеток.

Образцы тканей у пациентов были собраны после информированного согласия после утверждения этических соображений Институциональным советом Университетской больницы Триеста, Италия.

1. Изоляция опухолевых клеток и культура (День 1)

1. Изолировать клетки мезотелиомы человека из твердых образцов MPM. Мелко фарш ткани с резаком для получения фрагментов около 2-3 мм² в размере и инкубировать в 5 мл раствора пищеварения состоит из Хэнкса сбалансированного сольного раствора (HBSS) дополнены 0,5 мм Ca²"Mg^{2 "}0,5% трипсин и 50 мкг/мл DNase I, на ночь при 4 градусах По Цельсию.
2. Изоляция опухолевых клеток и культура (День 2)
   1. После ночной инкубации поместите переваренные ткани на 30 мин в инкубатор 37 градусов с нежной тряской.
   2. Замените раствор пищеварения при центрифугации (250 х г) 3 мг/мл коллагеназа типа 1 растворяется в 5 мл среднего 199 с HBSS и далее инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия с нежной тряской.
   3. Блокируйте ферментативную реакцию, добавляя 10% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS). Resuspend клетки очень тщательно с 5 мл пипетка, чтобы убедиться, что большинство клеток высвобождаются из ткани. Затем процедите суспензию клетки через фильтр пор ы 100 мкм.
   4. Семя клетки в 12,5 см² колбы и культуры их на 37 градусов по Цельсию с человеческими эндотелиальных клеток сыворотки свободной среде (HESF), с 10% FBS и дополнены EGF (10 нг /мл), основные FGF (20 нг /мл), и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заменить на свежий средний каждые 2-3 дня.

2. HA покрытие (День 1)

1. Приостановить высокий молекулярный вес HA (1,5 kDa) в двойной дистиллированной воды при концентрации 1 мг/мл⁶.
2. Разбавить раствор запаса HA до 50 мкг/мл в карбонатном/бикарбонатном буфере (0,1 М, рН 9,6) с нежным пайпетированием.
3. Пальто 96-хорошо пластины с 100 л разбавленного HA бульона раствора на ночь на 4 градуса по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гиалуроновая кислота была добрым подарком от профессора Ивана Донати, кафедры наук о жизни, Университет Триеста⁷.

3. Покрытие C1q (День 2)

1. После ночной инкубации, вакуум аспирации обработанных скважин и мыть 96-ну пластины с 100 зл.
2. Разрешить C1q (25 мкг/мл или различных концентраций для экспериментов по дозам) или BSA (в качестве отрицательного контроля) привязать к пластиковой обездвиженной HA путем инкубации этих белков в концентрации 25 мкг/мл в 100 мл dPBS 0,5% BSA и 0,7 мМ Ca²"Mg^2" . Затем инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
3. Вакуумные аспирированные скважины и мыть 96-ну пластины с 100 Л /хорошо dPBS.

4. Маркировка клеток с FAST DiI

1. Resuspend 1 х 10⁵ опухолевых клеток в 500 Л dPBS, содержащий 10 мкг/мл флуоресцентного красителя FAST DiI. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе 5% v/v CO₂ для маркировки, смешивая вручную после 5 мин интервалов.
   1. Чтобы удалить избыток FAST DiI, добавьте 10 мл dPBS, пипетки мягко вверх и вниз, и центрифуга на 250 х г в течение 7 мин. Открепите клеточные гранулы в 1 мл человеческой эндотелиальной сыворотки свободной среде, содержащей 0,1% BSA (HESF 0,1% BSA).

5. Клеточная приливка на матрицах HA/C1q (День 1)

1. Вакуумные аспирированные скважины, покрытые различными матрицами (колодцы были покрыты шагом 3.2).
2. Распределите 100 qL маркированной клеточной суспензии на покрытые колодцы и инкубировать пластину в течение 35 мин при 37 градусах Цельсия в 5% v/v CO₂ инкубаторе.
3. Удалите неприсоединения клеток, успонившись супернатант. Вымойте один раз с dPBS, содержащим 0,5% BSA, 0,7 мМ Ca^{2 "и} 0,7 мм Мг^{2 "}
4. Lyse адепта клеток, добавив 200 л / хорошо 10 мм Tris-HCl, рН 7,4 й 0,1% V/ V SDS и сразу же читать 96-ну с флуоресценции читателя (544 нм, выброс 590 нм) с помощью кривой калибровки, порожденных через лисис все большего числа маркировки Клетки.

HA является отрицательно заряженных высокомолекулярно-вес полисахарида, который состоит из повторяющихся (No 1-4)-D-глюкуроновая кислота-(З,1-3)-N-ацетил-D-глюкозамин дисахарида единиц (Рисунок 1B)⁷. Было проверено возникновение связывания HA на 96-аплской пластине, а также эффективность ее иммобилизации с использованием биотинилатированных HA (био-HA). Различные концентрации Био-ХА, варьируясь от 10 мкг/мл до 1 мг/мл, были повторно приостановлены в карбонате 100 мМ/бикарбонат-буфер рН 9,6 и инкубированы на ночь при 4 градусах Цельсия.

После обширного стирки, био-HA связаны с 96-колодцы пластины был обнаружен с помощью стрептавидина сопряжены с щелочной фосфатазы, в то время как наличие стрептавидина была количественно с использованием PNPP (1 мг/мл) в качестве субстрата. Чтение было выполнено на длине волны 405 нм с помощью считывателя ELISA. Bio-HA удалось связать с 96-наилучшим образом пластины в порядке реакции дозы (данные не показаны); 50 мкг/мл было выбрано в качестве плато насыщения и поэтому используется в наших анализах.

Наши предыдущие данные показали, что C1q способен связываться с широким диапазономцелевых лигандов, локализованных в ECM 8. Эта привязка особенно сильна с HA⁹. Скважины микротитерной пластины были покрыты 50 мкг/мл HMW-HA и инкубированы с увеличением концентрации C1q. Bound C1q был визуализирован при инкубации с анти-C1q поликлональных антител. C1q способен связываться с высоким молекулярным весом HA в зависимости от дозы(рисунок 1A),достигая максимального уровня связывания при концентрации 50 мкг/мл. Установив, что C1q может связываться с HA, мы исследовали последствия этого взаимодействия в изменении сигнальных свойств ECM и их последствия в развитии опухоли. Для этого мы создали протокол для изолированных опухолевых клеток из биоптических образцов, полученных от пострадавших пациентов. Первичные опухолевые клетки были выделены из биопсии тканей, как обобщено на рисунке 2. Способность опухолевых клеток взаимодействовать с C1q была оценена путем выполнения исследования клеточной стыковой схватом с использованием различных матричных комбинаций, как показано на рисунке 3. Опухолевые клетки были окрашены флуоресцентным зондом FAST DiI и посеяны на обездвиженных HA, HA связаны с C1q или BSA (используется в качестве отрицательного контроля), в течение 35 мин. По сравнению с HA, покрытие с HA-связанных-C1q удалось увеличить количество припасов первичных клеток, но не в состоянии стимулировать сливопухоли опухолевых клеток линий, которые мы тестировали, как показано на репрезентативном графике на рисунке 3.

Рисунок 1 . Взаимодействие C1q с гиалуроновой кислотой. (A) Связывание C1q на HMW HA в дозе зависимым образом. Данные выражаются в виде среднего количества трех независимых экспериментов в тройном S.E.M. (B) Схематическое представление молекулы C1q и рекомбинантной одноцепной шаровой области. C1q собирается из трех полипептидных цепей(A, B,C), каждая из которых содержит N-терминал коллагена, как последовательность и C-терминал шаровой gC1q головы. (C) Химическая формула гиалуроновой кислоты, высоко полимеризованная цепь глюкуроновой кислоты и N-ацетилглукосамин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 . Сводка схема изоляции и морфологии опухолевых клеток. Опухолевые клетки были выделены из образцов плевральной биопсии. Клетки были посеяны в 12,5 см² колбы и культивируется в человеческой эндотелиальной сыворотки клеток Бесплатно е 10% FBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Рисунок 3 . Влияние C1q на сливку опухолевых клеток. Опухолевые клетки (MES) или первичной мезотелиомы клеточной линии (MSTO-211H) были посеяны до микротитерных скважин, предварительно покрытых гиалуроновой кислотой (HA), HA, привязанной к C1q или бычьей сыворотке альбумина (BSA). В верхней части рисунка был показан морфологический аспект одной репрезентативной первичной клеточной линии, применяемый к HA, HA, привязанным к C1q или BSA. Изображения были получены с помощью фазово-контрастного микроскопа, оригинального увеличения: 200x. FAST DiI помечены первичных клеток мезотелиомы или мезотелиомы клеточной линии (MSTO-211H) было разрешено придерживаться микротитер скважин предварительно покрытыHA, HA связаны с C1q или BSA. Данные выражаются в виде среднего значения трех независимых экспериментов, проведенных в трипликатах и S.E.M. и p slt; 0,01 против HA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Мы описываем простой метод для исследования того, как компонент дополнения C1q, взаимодействующий с гиалуроновой кислотой, способен модулировать поведение первичных клеток, изолированных от тканей опухоли человека. Оба HA и C1q обильно присутствуют в микросреде ткани как в физиологических, так и в патологических условиях, участвуя в нескольких клеточных биологических процессах. Например, C1q было показано, что присутствует в микросреде плаценты, где он выступает за экстравиллу с трофобластом вторжения материнской decidua во время плацентации⁸. C1q также откладывается в рану исцеления кожи, где он способствует ангиогенетического процесса, необходимого для регенерации тканей и ремонта¹⁰. Наконец, C1q был идентифицирован в нескольких различных опухолевых тканей⁴. Высокий молекулярный вес HA является естественным барьером для ангиогенеза и распространения и последние данные показали, что C1q, помимо своей классической роли в активации дополнения, способен действовать как молекула ECM, в пользу миграции клеток.

Новизна этой работы заключается в выводе о том, что связывание C1q к HA сильно изменяет взаимодействие опухолевых клеток с HA. Для создания этого метода были рассмотрены несколько контрольно-пропускных пунктов. Прежде всего, мы обеспечили, чтобы достаточное количество HA было привязано к пластику культуры и скважин ELISA с использованием биотинилаповых HA. Алциальное голубое окрашивание скважин подтвердило эти результаты (данные не показаны). Инкубация была выполнена в одночасье в буфере бикарбоната, рН 9.6, и эта процедура обеспечивает полное насыщение скважин HA (данные не показаны).

Вторым шагом было привязать C1q к HA. Привязка C1q к HA выполнена при физиологическом рН (7,4) и в присутствии Ca^{2 .} По этой причине мы использовали буфер dPBS-BSA с двухвалентными ионами. Сначала мы провели эксперимент по ответу на дозу, чтобы определить и выбрать оптимальное количество C1q, которое можно найти при ак. Хотя в нашей кривой доза-ответ мы не достигли точно плато, мы использовали концентрацию 25 мкг/мл, чтобы быть ближе к физиологической концентрации свободного C1q, учитывая, что количество C1q обычно присутствует в сыворотке составляет 75-150 мкг /мл. Было подсчитано, что сыворотка C1q бесплатно от C1r и C1s составляет около 10%-20% от комплекса C1¹¹. C1q известен своей способностью связывать полианионы, он был определен как молекула распознавания шаблона заряда и HA является отрицательно заряженным линейным полимером повторяющихся единиц (No1-4)-D-глюкуроновая кислота-(No,1-3)-N-ацетил-D-глюкозамин^{12, 13}. По этой причине мы исследовали это сильное нековалентное взаимодействие. Наши наблюдения показали, что опухолевые клетки чувствуют разницу между HA и HA, связанными с C1q. Клетки, как представляется, более распредоскивания по сравнению с клеткой, придерживающейся HA в одиночку. Мы заметили, что этот эффект не опосредовано растворимым C1q, указывая, что эта модификация в сцеплении клеток зависит от взаимодействия C1q с HA, вероятно, из-за конформационного изменения молекулы дополнения в результате связывания.

Мы хотим подчеркнуть важность использования первичных клеток в качестве моделей in vitro поведения опухолей для экспериментов с помощью стыковки, так как мы замечаем сильную разницу в способности слипа между первичными клетками по сравнению с несколькими клеточными линиями, как показано в Рисунок 3. Альтернативной и очень интересной моделью для оценки биологических свойств HA является использование 3D-моделей гидрогелевного эшафота HA. Этот эшафот с включением биологических молекул может быть использован для оценки биологическиактивных сигналов и для нескольких применений в регенеративной медицине¹⁴. Модель, которую мы предлагаем в данном исследовании, является более простым, быстрым и дешевым методом оценки клеточных реакций на сочетание стимулов, и ее можно рассматривать как первый шаг для понимания молекулярных механизмов, участвующих в такого рода Взаимодействия.

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Мы благодарим Ивана Донати за предоставление HA, Леонардо Амадио, Габриэлла Зито (Департамент гинекологии IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Италия) и Андреа Романо (Оперативное клиническое отделение анатомии и патологической гистологии, Больница Каттинара, Триест, Италия ) для сбора образцов тканей. Мы благодарим также Николо Морозини за помощь в подготовке видео и Алекс Коппола, голос. Эта работа была поддержана грантами от Института охраны здоровья матери и ребенка, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Италия (RC20/16) и Fondazione Cassa di Risparmio Trieste к R.Bulla.