Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion

Die Komplementkomponente C1q ist ein in der Gewebemikroumgebung hochgradig exprimiertes pro-inflammatorisches Molekül, das mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, die Zellhaftung beeinflusst.

Es wurde zunehmend gezeigt, dass die Tumormikroumgebung eine aktive Rolle bei Neoplasiewachstum und Metastasen spielt. Durch verschiedene Wege können Tumorzellen stromale, Immun- und Endothelzellen effizient rekrutieren, indem sie stimulierende Faktoren, Chemokine und Zytokine sezernieren. Im Gegenzug können diese Zellen die Signaleigenschaften der Mikroumgebung verändern, indem sie wachstumsfördernde Signale, Metaboliten und extrazelluläre Matrixkomponenten freisetzen, um eine hohe Proliferation und metastasierende Kompetenz aufrechtzuerhalten. In diesem Zusammenhang identifizieren wir, dass die Komplementkomponente C1q, die lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren stark exprimiert wird, wenn sie mit der extrazellulären Matrix Hyaluronsäure interagiert, das Verhalten von Primärzellen stark beeinflusst, die aus dem menschlichen Tumor isoliert sind. Exemplare. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure (HA) gebunden ist, die Adhäsion von Tumorzellen beeinflusst, was der Tatsache zugrunde liegt, dass die biologischen Eigenschaften der Wichtigsten komponenten der extrazellulären Matrix (in diesem Fall HA) durch bioaktive Signale in Richtung Tumor geformt werden können. Fortschreiten.

Die Tumormikroumgebung (TME) beeinflusst die Entwicklung und Progression von Krebs, da sie eine freizügige Nische für Zellüberleben, Wachstum und Invasion bieten kann. Die Identifizierung neuer Schlüsselakteure in TME kann für die Entdeckung neuer molekularer Werkzeuge für die Zieltherapie nützlich sein. TME umfasst ein komplexes und dynamisches Netzwerk von nicht-bösartigen Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems, eingebettet in die umgebenden extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Kollagene, Laminine, Fibronectine, Proteoglykane und Hyaluronane. Sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen synthetisieren und sezernieren ECM-Komponenten zusammen mit Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren und entzündlichen und Matrix-Remodeling-Enzymen, die insgesamt die physikalischen, chemischen und signalischen Eigenschaften von TME verändern. Unter diesen Bestandteilen, Hyaluronsäure (HA) hat sich herausgebildet, um eine entscheidende Rolle in der Tumorbiologie zu üben. Trotz seiner einfachen chemischen Zusammensetzung kann HA zusammen mit seinen HA-bindenden Molekülen (Hyaladherinen) Angiogenese, Reaktionsfähigkeit des Immunsystems und ECM-Umbau in einer größen- und konzentrationsabhängigen Weise modulieren¹.

Das Komplementsystem (C) ist auch Teil der lokalen TME, die in letzter Zeit zunehmend Beachtung gefunden hat. Das C-System umfasst eine Reihe von löslichen und membrangebundenen Proteinen, die an der ersten Verteidigungslinie gegen Nicht-Selbstzellen, unerwünschte Wirtselemente und Krankheitserreger beteiligt sind. Funktionell verbindet das C die Zweieffekterarme angeborener und adaptiver Systeme, um entweder die direkte Zelltötung oder die Montage einer Entzündungsreaktion zu fördern². C-Aktivierung kann Tumorwachstum unterdrücken, indem krebsartige Zellen zerstört oder ihr Auswuchs hemmt, aber es ist immer klarer geworden, dass es eine tumorfördernde Aktivität besitzen kann, indem es chronische Entzündungen aufrechterhält und die Etablierung eines immunsuppressives Milieu, die Angiogenese induzieren und krebsbedingte Signalwege aktivieren³. In diesem Zusammenhang hat sich C1q, das erste Erkennungsmolekül des klassischen Signalwegs des C-Systems, herausgebildet, um wichtige Funktionen in der Tumormikroumgebung unabhängig von c-Aktivierung⁴auszuüben. C1q hat sich gezeigt, lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren ausgedrückt werden, wo es Krebszelladhäsion, Migration und Proliferation zusätzlich zu Angiogenese und Metastasierung⁵bevorzugen kann. Interessanterweise interagiert C1q mit einem hauptbestandteil des ECM wie HA.

Wir entwickelten eine Technik, um die primären Krebszellen von der Tumormasse zu isolieren. Darüber hinaus haben wir die Matrix entwickelt, die die Tumormikroumgebung stimulieren kann, insbesondere die Wechselwirkung zwischen C1q und hochmolekularer Hyaluronsäure. C1q gebunden an HA war in der Lage, Adhäsion der Tumorzellen zu induzieren.

Gewebeproben von Patienten wurden nach Zustimmung der Informierten nach Genehmigung der ethischen Erwägungen durch das Institutional Board des Universitätsklinikums Triest, Italien, entnommen.

1. Tumorzellisolierung und -kultur (Tag 1)

1. Isolieren Sie menschliche Mesotheliomzellen aus mPM-Festkörperproben. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Fräser fein hacken, um Fragmente von ca. 2-3 mm² in der Größe zu erhalten und in 5 ml Verdauungslösung zu brüten, bestehend aus Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), ergänzt mit 0,5 mM Ca²⁺/Mg^2+,0,5% Trypsin und 50 g/ml DNase I, über Nacht bei 4 °C.
2. Tumorzellisolierung und -kultur (Tag 2)
   1. Nach der nächtlichen Inkubation das verdaute Gewebe 30 min in einen 37 °C-Inkubator mit sanftem Schütteln legen.
   2. Ersetzen Sie die Verdauungslösung bei Zentrifugation (250 x g) durch 3 mg/ml Kollagenase Typ 1 gelöst in 5 ml Medium 199 mit HBSS und weiter für 30 min bei 37 °C mit sanftem Schütteln inkubieren.
   3. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) hinzufügen. Setzen Sie die Zellen sehr sorgfältig mit einer 5 ml Pipette aus, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Filtern Sie dann die Zellsuspension durch einen 100-m-Porenfilter.
   4. Säen Sie die Zellen in einem 12,5 cm² Kolben und kultichen Sie sie bei 37 °C mit menschlichen Endothelzellen serumfreies Medium (HESF), mit 10% FBS und ergänzt mit EGF (10 ng/mL), Basis FGF (20 ng/ml) und 1% Penicillin- Streptomycin.
      HINWEIS: Ersetzen Sie alle 2-3 Tage durch frisches Medium.

2. HA-Beschichtung (Tag 1)

1. Hochmolekulares HA (1,5 kDa) in doppelt destilliertem Wasser in der Konzentration von 1 mg/ml⁶wieder aufsetzen.
2. HA-Stammlösung in Karbonat/Bicarbonat-Puffer (0,1 M, pH 9,6) mit sanfter Pipettierung auf 50 g/ml verdünnen.
3. Beschichten Sie die 96-Well-Platte mit 100 l verdünnter HA-Lagerlösung pro Brunnen über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Hyaluronsäure war ein freundliches Geschenk von Professor Ivan Donati, Department of Life Sciences, Universität Triest⁷.

3. C1q-Beschichtung (Tag 2)

1. Vakuum aspirieren die behandelten Brunnen nach über Nacht und waschen die 96-Well-Platte mit 100 L von Dulbeccos PBS (dPBS) pro Brunnen.
2. C1q (25 g/ml oder unterschiedliche Konzentrationen für Dosisreaktionsexperimente) oder BSA (als Negativkontrolle) an kunststoffimmobilisiertes-HA binden lassen, indem diese Proteine in einer Konzentration von 25 g/ml in 100 l dPBS + 0,5% BSA und 0,7 mM Ca²⁺/Mg²⁺ . Dann über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Vakuum-Aspirieren sie die Brunnen und waschen Sie die 96-Well-Platte mit 100 l/Well von dPBS.

4. Zellbeschriftung mit FAST DiI

1. Resuspend 1 x 10⁵ Tumorzellen in 500 l dPBS mit 10 g/ml des Fluoreszenzfarbstoffs FAST DiI. 15 min bei 37 °C in einem 5% v/v CO2-Inkubator für die Etikettierung inkubieren, manuell nach 5 min Intervallen mischen.
   1. Um überschüssiges FAST DiI zu entfernen, fügen Sie 10 ml dPBS, Pipette sanft nach oben und unten und Zentrifuge bei 250 x g für 7 min. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml des menschlichen endothelialen Serum-freien Mediums mit 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA) auf.

5. Zellhaftung auf HA/C1q-Matrizen (Tag 1)

1. Vakuum-Aspirat der mit den verschiedenen Matrizen beschichteten Brunnen (Bohrungen wurden in Schritt 3.2 beschichtet).
2. Verteilen Sie 100 l der markierten Zellsuspension auf die beschichteten Brunnen und inkubieren Sie die Platte für 35 min bei 37 °C in 5% v/v CO2-Inkubator.
3. Entfernen Sie die nicht haftenden Zellen, indem Sie den Überstand anheben. Einmal mit dPBS mit 0,5% BSA, 0,7 mM Ca²⁺ und 0,7 mMMg²⁺waschen.
4. Lyse die anhaftenden Zellen durch Zugabe von 200 l/Well von 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS und sofort die 96-Well-Platte mit einem Fluoreszenzleser (544 nm, Emission 590 nm) mit einer Kalibrierkurve durch die Lyse einer zunehmenden Anzahl von markierten Zellen.

HA ist ein negativ geladenes hochmolekulares Polysaccharid, das aus sich wiederholenden (1-4)-D-Glucuronsäure-(1-3)-N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharid-Einheiten besteht (Abbildung 1B)⁷. Das Auftreten der Bindung von HA auf der 96-Well-Platte sowie die Effizienz ihrer Immobilisierung wurden unter Ausnutzung von biotinyliertem HA (bio-HA) getestet. Verschiedene Konzentrationen von Bio-HA, die von 10 g/ml bis 1 mg/ml reichten, wurden in 100 mM Karbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9,6 wieder aufgehängt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.

Nach umfangreichen Wassen wurde Bio-HA, die an 96-Wells-Platte gebunden war, mit Streptavidin konjugiert mit alkalischer Phosphatase nachgewiesen, während das Vorhandensein von Streptavidin mit pNPP (1 mg/ml) als Substrat quantifiziert wurde. Die Lesung wurde mit einer Wellenlänge von 405 nm mit einem ELISA-Reader durchgeführt. Bio-HA war in der Lage, an eine 96-Well-Platte in einer Dosis-Reaktion-Weise zu binden (Daten nicht gezeigt); 50 g/ml wurden als Sättigungsplateau gewählt und daher in unseren Assays verwendet.

Unsere bisherigen Daten haben gezeigt, dass C1q in der Lage ist, an eine Vielzahl von Zielliganden zu binden, die im ECM⁸lokalisiert sind. Diese Bindung ist besonders stark bei HA⁹. Die Bohrungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 50 g/ml HMW-HA beschichtet und mit zunehmender Konzentration von C1q inkubiert. Bound C1q wurde bei der Inkubation mit anti-C1q polyklonalen Antikörpern visualisiert. C1q ist in der Lage, in dosisabhängiger Weise an hochmolekulares HA zu binden (Abbildung 1A), und erreicht bei einer Konzentration von 50 g/ml die maximale Bindungsstufe. Nachdem wir festgestellt hatten, dass C1q an HA binden kann, untersuchten wir die Implikation dieser Wechselwirkung bei der Änderung der Signaleigenschaften des ECM und deren Auswirkungen auf die Tumorentwicklung. Zu diesem Ziel haben wir ein Protokoll zu isolierten Tumorzellen aus bioptischen Proben von betroffenen Patienten erstellt. Primäre Tumorzellen wurden aus der Gewebebiopsie isoliert, wie in Abbildung 2zusammengefasst. Die Fähigkeit von Tumorzellen, mit C1q zu interagieren, wurde durch durchführung eines Zelladhäsionstestes mit verschiedenen Matrixkombinationen, wie in Abbildung 3dargestellt, bewertet. Tumorzellen wurden mit der fluoreszierenden Sonde FAST DiI gefärbt und 35 min an immobilisierte HA, HA gebunden an C1q oder BSA (als Negativkontrolle) gesät. Im Vergleich zu HA konnte die Beschichtung mit HA-gebundenem C1q die Menge an haftenden Primärzellen erhöhen, ist aber nicht in der Lage, die Haftung von Tumorzelllinien zu stimulieren, die wir getestet haben, wie in der repräsentativen Grafik in Abbildung 3dargestellt.

Abbildung 1 . Wechselwirkung von C1q mit Hyaluronsäure. (A) Bindung von C1q auf HMW HA in dosisabhängiger Weise. Die Daten werden als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten in der dreitklikativen S.E.M. (B) Schematische Darstellung des C1q-Moleküls und der rekombinanten einkettigen Kugelregion ausgedrückt. C1q wird aus drei Polypeptidketten(A, B,C) zusammengesetzt, die jeweils eine N-terminale Kollagen-ähnliche Sequenz und einen C-terminalen kugelförmigen gC1q-Kopf enthalten. (C) Chemische Formel von Hyaluronsäure, einer hochpolymerisierten Kette aus Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 . Zusammenfassung der Isolierung und Morphologie von Tumorzellen. Tumorzellen wurden aus Pleurabiopsieproben isoliert. Die Zellen wurden in einem 12,5 cm² Kolben gesät und in Human Endothelial Cell Serum Free Medium + 10% FBS kultiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Abbildung 3 . Wirkung von C1q auf die Adhäsion von Tumorzellen. Tumorzellen (MES) oder primäre Mesotheliom-Zelllinie (MSTO-211H) wurden in Mikrotiterbrunnen gesät, die mit Hyaluronsäure (HA), HA gebunden an C1q oder an Rinderserumalbumin (BSA) vorbeschichtet waren. Im oberen Teil der Abbildung wurde der morphologische Aspekt einer repräsentativen primären Zelllinie gezeigt, die an HA, HA gebunden an C1q oder BSA gehalten wurde. Die Bilder wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop, Originalvergrößerung: 200x, aufgenommen. FAST DiI gekennzeichnet primäre Mesotheliom-Zellen oder eine Mesotheliom-Zelllinie (MSTO-211H) durften mikrotiterBrunnen mit HA, HA gebunden an C1q oder BSA beschichtet haften. Die Daten werden als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt, die in Triplicaten durchgeführt werden. S.E.M. * p < 0,01 vs HA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wir beschreiben eine einfache Methode, um zu untersuchen, wie die Komplementkomponente C1q, die mit Hyaluronsäure interagiert, in der Lage ist, das Verhalten von Primärzellen zu modulieren, die aus menschlichen Tumorgeweben isoliert sind. Sowohl HA als auch C1q sind sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen reichlich in der Gewebemikroumgebung vorhanden und nehmen an mehreren zellbiologischen Prozessen teil. Zum Beispiel, C1q hat sich gezeigt, in der Mikroumgebung der Plazenta vorhanden zu sein, wo es extravillous trophoblast Invasion der mütterlichen Decidua während der Plazentation⁸begünstigt. C1q wird auch in der wundheilenden Haut abgelagert, wo es den angiogenetischen Prozess fördert, der für die Geweberegeneration und -reparatur¹⁰erforderlich ist. Schließlich wurde C1q in mehreren verschiedenen Tumorgeweben identifiziert⁴. Hochmolekulares HA ist eine natürliche Barriere für Angiogenese und Proliferation und neuere Beweise zeigten, dass C1q, neben seiner klassischen Rolle bei der Komplementaktivierung, in der Lage ist, als ECM-Molekül zu fungieren und die Zellmigration zu begünstigen.

Die Neuheit dieser Arbeit besteht in der Feststellung, dass die Bindung von C1q an HA die Wechselwirkung von Tumorzellen mit HA stark verändern. Um diese Methode einzurichten, wurden mehrere Prüfpunkte in Betracht gezogen. Zunächst haben wir dafür gesorgt, dass eine ausreichende Menge an HA mit biotinylierten HA an den Kunststoff der Kultur und ELISA-Brunnen gebunden war. Die alcian blaue Färbung der Brunnen bestätigte diese Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Die Inkubation wurde über Nacht im Bicarbonatpuffer, pH 9,6, durchgeführt, und dieses Verfahren stellt die vollständige Sättigung der Brunnen durch HA sicher (Daten nicht dargestellt).

Der zweite Schritt bestand darin, C1q an HA zu binden. Die Bindung von C1q an HA wurde bei einem physiologischen pH-Wert (7.4) und in Gegenwart von Ca²⁺durchgeführt. Aus diesem Grund haben wir einen dPBS-BSA-Puffer mit bivalenten Ionen verwendet. Wir führten zunächst ein Dosis-Wirkungs-Experiment durch, um die optimale Menge an C1q zu identifizieren und auszuwählen, die an HA angehängt ist. Obwohl wir in unserer Dosis-Wirkungs-Kurve nicht genau das Plateau erreichten, verwendeten wir die Konzentration von 25 g/ml, um näher an der physiologischen Konzentration von freiem C1q zu sein, wenn man bedenkt, dass die Menge an C1q, die normalerweise im Serum vorhanden ist, 75-150 g/ml beträgt. Es wurde berechnet, dass Serum C1q frei von C1r und C1s etwa 10%-20% des C1-Komplexes¹¹beträgt. C1q ist bekannt für seine Fähigkeit, Polyanionen zu binden, es wurde als ein Ladungsmuster-Erkennungsmolekül definiert und HA ist ein negativ geladenes lineares Polymer von sich wiederholenden Einheiten von (,1-4)-D-Glucuronsäure-(1-3)-N-Acetyl-D-Glucosamin^{12, 13}. Aus diesem Grund haben wir diese starke nicht-kovalente Wechselwirkung untersucht. Unsere Beobachtungen zeigten, dass Tumorzellen den Unterschied zwischen HA und HA, die an C1q gebunden sind, erkennen. Die Zellen scheinen stärker verteilt zu sein, wenn sie mit der Zelle verglichen werden, die allein an HA haftet. Wir beobachteten, dass dieser Effekt nicht durch lösliches C1q vermittelt wird, was darauf hindeutet, dass diese Veränderung der Zellhaftung von der Wechselwirkung von C1q mit HA abhängt, wahrscheinlich aufgrund einer Konformationsänderung des Komplementmoleküls als Folge der Bindung.

Wir möchten die Bedeutung der Verwendung von Primärzellen als In-vitro-Modelle des Tumorverhaltens für die Adhäsionsexperimente hervorheben, da wir einen starken Unterschied in der Haftfähigkeit zwischen Primärzellen im Vergleich zu mehreren Zelllinien feststellen, wie in Abbildung 3. Ein alternatives und sehr interessantes Modell zur Bewertung der biologischen Eigenschaften von HA ist die Verwendung von 3D-Modellen von HA-Hydrogelgerüsten. Dieses Gerüst mit der Einbindung biologischer Moleküle kann zur Auswertung bioaktiver Signale und für verschiedene Anwendungen in der regenerativen Medizin¹⁴eingesetzt werden. Das Modell, das wir in dieser Studie vorschlagen, ist eine einfachere, schnellere und kostengünstigere Methode zur Bewertung zellulärer Reaktionen auf eine Kombination von Reizen, und es kann als ein erster Schritt für das Verständnis der molekularen Mechanismen betrachtet werden, die an dieser Art von gegenseitige einwirkung.

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Wir danken Ivan Donati für die Bereitstellung von HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Abteilung für Gynäkologie der IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Italien) und Andrea Romano (Operative Klinische Abteilung für Anatomie und pathologische Histologie, Cattinara Krankenhaus, Triest, Italien ) für die Gewebeprobenentnahme. Wir danken auch Nicolé Morosini für die Hilfe bei der Videovorbereitung und Alex Coppola, der Stimme. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Instituts für Mütter- und Kindergesundheit, IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Italien (RC20/16) und Fondazione Cassa di Risparmio Trieste an R.Bulla unterstützt.