Измерение уровня осуществления в Drosophila melanogaster , с использованием системы количественной оценки вращающихся упражнения (REQS)

Вращающиеся осуществлять количественную оценку системы (REQS) может вызвать упражнения в Drosophila melanogaster путем вращения при одновременно измерять количество деятельности животных. Здесь мы представляем протокол точка за точкой, детализируя как измерить уровни активности животных испытывают вращательные упражнения процедуры с использованием REQS.

Дрозофилы является новой модели организма для исследований в области биологии упражнения. На сегодняшний день, две основные упражнения системы, мощность башни и Treadwheel были описаны. Однако отсутствует способ измерить количество дополнительных животных активности, индуцированной через упражнения лечение. Вращающиеся осуществлять количественную оценку системы (REQS) заполняет эту потребность, обеспечивая мера деятельности животных для животных, которые испытывают вращательные упражнения. Этот протокол подробно описано, как использовать REQS для оценки активности животных во время вращения упражнения и показывает тип данных, которые могут быть сгенерированы. Здесь мы демонстрируем, как REQS используется для определения конкретного пола и штамм различия в упражнения индуцированной активности. REQS может также использоваться для оценки влияния различных других экспериментальных параметров, таких как возраст, диета или населения размер на упражнения индуцированной деятельности. Кроме того она может использоваться для сравнения эффективности различных осуществлять подготовку протоколов. Важно то, что он предоставляет возможность стандартизировать процедуры осуществления между штаммами, позволяя исследователя для достижения равных количествах деятельности между группами при необходимости. Таким образом REQS заметный новый ресурс для биологов упражнения, работающих с системой модель дрозофилы и дополняет существующие системы упражнений.

Недавно исследователи начали использовать плодовой мушки Drosophila melanogaster для изучения биологии упражнения. D. melanogaster был генетической модели системы для более чем 100 лет^1,2. Однако исследования дрозофилы внесла вклад не только генетике, но и целый ряд других дисциплин, включая нейробиологии, поведенческой биологии и физиологии³. В 2009 году, власти башня, первый тренажер для дрозофилы было описано⁴. Башня власти использует ответ отрицательный geotaxis животных. Когда нарушается, дрозофилы, как правило, перейти к верхней части их корпуса. Этот ответ хорошо отлажена и является основой assay популярные «кольцо» (⁵быстрого итеративного негативные Geotaxis), который используется для оценки восхождение способности и/или физической у дрозофилы. Башня власти использует механическая рука, подключенными к блоку электродвигателя неоднократно поднять набор животных в пределах их корпуса на несколько дюймов и снижается их обратно на землю в ответ отрицательный geotaxis (Tinkerhess et al. 2012⁶ предоставить видео, иллюстрирующие использование Power Tower). Длительное лечение на башне власти таким образом увеличивает объем физической активности (бег или полет) животные выполняют по сравнению необработанных контроля животных и течение времени приводит к улучшению производительности в assay кольцо для физической⁴. Таким образом эта работа продемонстрировала целесообразность использования дрозофилы как модель для осуществления биологии.

Чтобы расширить репертуар инструменты для исследований упражнения дрозофилы, в 2016 году, Мендес и коллеги описал второй дрозофилы тренажер, Treadwheel⁷. Подобно к башне власти, Treadwheel эксплуатирует ответ отрицательный geotaxis дрозофила. Однако этот ответ индуцируется продолжение вращения вольеры для животных, а не путем отмены и снижается их как Power Tower. Этот метод индукции мягче и позволяет более выносливость ориентированных на осуществление режима, который избегает любой физической травмы, которые могут возникнуть во время учений в башне власти (см. Katzenberger, R. J. et al. 2013⁸ для воздействия повторяются физической травмы на дрозофилы здоровья). Подобно Power Tower⁴, упражнения лечение животных на Treadwheel приводит к различных физиологических реакций, включая изменения в физической пригодности, триглицеридов и тела вес⁷. Таким образом два взаимодополняющих методы доступны для биологов дрозофилы, изучая упражнения.

Одно ограничение мощности башня и Treadwheel является невозможность измерить объем деятельности, вызванных лечения упражнения. Анализ видео записей взяты из Treadwheel продемонстрировал, что имеются существенные различия среди различных штаммов дрозофилы в как они реагируют на лечение упражнение⁷. В частности штаммы изучал отличается в сколько дополнительной деятельности животных когда стимулировали⁷. Это наблюдение побудило нас, чтобы разработать систему третьей упражнения, вращающихся осуществлять количественную оценку системы (REQS), что позволяет нам оценить уровни активности животных во время вращения индуцированной упражнение⁹. REQS использует коммерчески доступных деятельности, мониторинга, установленный на вращающейся рукоятки для стимулирования осуществления путем вращения как Treadwheel. Первоначальная работа с REQS подтверждает, что генетически различных штаммов дрозофилы — и полов - могут иметь существенно различные ответы на вращения стимуляции и таким образом количество упражнений, индуцированной не идентичен среди различных генотипов⁹ . Таким образом REQS теперь позволяет дрозофилы биологи измерить количество упражнений, вызванных лечения, открыв целый ряд новых направлений исследований в области осуществления.

Здесь мы подробно описать как пользоваться REQS для количественного определения вращательные упражнения. REQS индуцирует вращательные упражнения и одновременно измеряет уровни активности животных лечат. REQS возможность размещения различных программ упражнений, начиная от простого 2 h непрерывного осуществления режима продемонстрировали здесь для более сложных методов обучения интервал как описано Мендес и коллеги⁷и стимуляции может быть скорректирована посредством скорость вращения (между приблизительно 1-13 оборотов в минуту). В зависимости от активности монитор используется для производства REQS этот метод адаптируется для анализа одного мух или больших популяций животных. Благодаря этой гибкости REQS обеспечивает дрозофилы исследователей с массивом возможностей для изучения, например, различные упражнения режимы, диетические вмешательства или влияния плотности населения.

REQS состоит из блока монитора активности дрозофилы (источник информации, см. Таблицу материалы) монтируется на вращающейся руки, которая контролируется электродвигателя (рис. 1). Монитор активности определяет, как часто в течение заданного времени которые массив лазерных лучей, пройдя в середине трубы пробирного нарушается. Подробные чертежи и углубленная характеристика смотрите наши предыдущие публикации⁹. В то время как наша система использует блок LAM25H, REQS могут быть изменены для размещения другие Drosophila монитор активности единиц, а также.

1. Тестирование настройки REQS

1. Нагрузочный тест влетает в стеклянных трубок образца, обезболивающим животных с CO₂ или другой выбранный метод для обработки, перемещая их в пустой трубы и укупорки трубы.
2. Вставьте ограничен стекла образец трубки разъемы блока монитора активности. Безопасный трубы, используя резиновые уплотнительные кольца (17-18 калибр) и/или резиновых полос на обе стороны подразделения для обеспечения трубы не двигаться во время вращения:
   1. Скольжения одно кольцо над образец трубки и Установите уплотнительное кольцо рядом середину трубки. Вставьте образец трубки в гнездо монитора активности от фронта и его центр.
   2. Переместите кольцо при необходимости и убедитесь, что после того, как образец трубки центрируется, уплотнительное кольцо заводят как можно ближе к монитор активности как можно скорее. Исправьте образца трубки в месте путем скольжения второе кольцо через стеклянную трубку от спины, снова перемещая кольцо как можно ближе к монитор активности как можно.
3. Инициировать ротацию REQS, листать выключатель питания на передней панели устройства. Регулировать скорость его вращения с ручку на передней панели устройства для требуемой скорости (4/мин (оборотов в минуту) в этом примере).
   Примечание: Скорость вращения в этом примере был выбран, чтобы соответствовать ранее опубликованные исследования⁷. Как различные вращательной скорости приведет к различных животных активность, при инициировании нового исследования, оптимизация скорости вращения для конкретных экспериментальных set-up (генотип, продолжительность схватки упражнения и т.д.) может быть необходимо.
   Примечание: Важно обеспечить, что трубы правильно расположены так, что они не тащить вдоль нижней части блока REQS во время вращения.
4. Проверьте подключение к системе сбора данных, предоставляемых с блоком монитор активности дрозофилы, открыв DAMSystem308 программного обеспечения и обеспечения того, что подключение свет горит зеленым для нескольких ротаций. Программное обеспечение начнет запись данных в текстовый файл «monitorX» (X в номер устройства, если используются несколько мониторов) сразу же после начала. Запись частоты может корректироваться в закладке «Настройки»; Мы обычно записывать с интервалом 5 минут.
5. Расследования в текстовый файл, созданный DAMSystem308 программного обеспечения, что подключение данных функционирует нормально. Проблемы с подключением к привести к вырезами, время точек, где 0 активность регистрируется для всех позиций в REQS (см. Представитель результаты и Таблица 2). Если вырезами, настройки подключения данных, ведущих к вращающейся телефонной линии, как во время вращения, эта связь может стать сыпучих или витой. Мы находим, что стабилизации связи с лентой помогает предотвратить эту проблему.

2. Подготовка животных

Примечание: Все животные были подняты и испытаны в стандартных условиях в инкубаторе (25 ° C, влажность 60-70%, 12 h свет/темно цикла) на мелассы/кукурузной муки СМИ¹⁰.

1. За две недели до запланированного эксперимента, настроить флаконов с контролируемой плотностью животных для сбора экспериментальных мух от; Обычно мы создали флаконов с 7 мужчин и 10 женщин. С здорового материала, от одного флакона примерно 15 девственной мужчин и 15 женщин могут быть собраны за 4 дня периода времени. Отрегулировать количество флаконов, созданы на основе числа животных, необходимых для анализа; Типичная пробирного в нашей лаборатории включает в себя 10 наборов 10 Девы мужчин и женщин за генотипа (100 мужчин и 100 женщин).
   Примечание: Non Девы мух могут использоваться в зависимости от конкретных экспериментальных вопрос. Если проведение долгосрочных экспериментов с животными не девственница, ползающих личинки могут мешать точного мониторинга.
2. Удаление родительского мух одну неделю после настройки флаконов.
3. Начиная на 10 день после создания флаконы, собирать девственной мух от флаконы и хранить их разделены по признаку пола.
4. Соберите достаточно животных для эксперимента и возраста их как необходимые, 3 дня в этом примере.
   Примечание: Обычно мы анестезировать животных с CO₂ для обработки. CO₂ , как известно, влияют уровни активности животных для длительных периодов времени после лечения (например, см. Бартоломью et al. 2015¹¹). Если эффект CO₂ препятствует запланированных течению анализов или анализа, используйте метод другой анестезии как лед анестезии.

3. сбор данных с REQS

1. Анестезировать животных, которые будут использоваться для осуществления исследования по количественной оценке с CO₂ или другого метода анестезии. Разделите их на группы по мере необходимости и загрузить групп животных в пустых стеклянных трубок монитора активности; в этом примере 10 животных того же возраста загружаются в стеклянную трубку, с 10 репликация для каждого животного типа (секс/генотип). Убедитесь, что вы обратите внимание, какие животные тип загружается в каждой тюбике.
   Примечание: Для больше экспериментов, питание могут быть включены в образец трубки. В этом случае важно, что пища является безопасным и не стать выбили во время вращения.
2. Загрузить пробирного стеклянных трубок в REQS блок и закрепите их с резиновые уплотнительные кольца. При работе с более чем одного пола/генотип, используя рандомизированных блок конструкции или рандомизации положение животных в REQS позволит устранить любые потенциальные последствия позиции. Рандомизации может достигаться путем назначения каждого флакона случайное число, например от веб-генератор случайных чисел (например, https://www.randomizer.org/) или в электронной таблице и затем заказа флаконов на основе случайного числа.
3. Поместите REQS в инкубатор для обеспечения постоянной температуры, влажности и свету условий. Убедитесь, что кабели питания и данных подключены правильно.
4. Разрешить животных, чтобы оправиться от анестезии и акклиматизироваться к новой среде за 1 час.
5. Начните эксперимент, инициируя REQS на желаемую скорость вращения.
   Примечание: Еще один вариант — сначала собирать базовые данные о деятельности от животных до начала вращения, следуют записи уровни активности в ответ на стимуляцию вращения.
6. Начать сбор данных, открыв программное обеспечение DAMsystem308 (просто открытие программного обеспечения инициирует сбор данных). Данные записываются в текстовый файл с заданным интервалом (здесь, 5 минут); При необходимости, измените параметры интервала в закладке «Настройки» (см. шаг 1.4).
7. Чтобы гарантировать, что данные успешно передаются на компьютер, откройте текстовый файл, созданный DAMsystem308 программного обеспечения после одного или двух интервалов времени прошло и подтвердите, что данные записываются в файл. Закрыть и снова открыть этот файл, чтобы увидеть данные из любой точки дополнительное время. Сбор данных для желаемого количества времени; в этом примере, 2 ч.
   Примечание: Не открывайте инкубатора в период анализа, как животные очень чувствительны к любой беспорядков и скорее всего будет реагировать с повышенной активностью.
8. В конце упражнения assay прекратить сбор данных путем закрытия DAMsystem308 программного обеспечения, а затем выключить REQS. Удаление животных из стеклянных трубок пробирного и очистить трубы. Животные могут быть перемещены обратно в пищевой флаконов если повторяется, необходимы меры в разных возрастов.
   Примечание: Если смертей происходят в ходе осуществления режима, она должны регистрироваться, как присутствие мертвые мухи могут влиять деятельность графов. В нашем опыте с DGRP2 летать линии^12,13позаниматься в 4 об/мин 2 h не приводили к любой смерти, но слабее штаммы могут реагировать по-разному.

4. анализ данных

1. Откройте файл .txt, под названием «Monitor1» производства программного обеспечения DAMSystem308.
2. Проверка файла данных для любых проблем, которые могли произойти во время сбора данных (пропущенные время точек, и т.д.; Таблица 1). При необходимости, цензор файла путем удаления точек данных в начале и в конце записи.
3. С помощью статистического программного обеспечения по вашему выбору (например, R), анализировать собранные данные. Генерировать описательной статистики и осуществляют дисперсионный анализ (ANOVA) расследовать такие эффекты, как секс и генотип, если данные нормально распределены. Если данные не распространяются как правило, используйте непараметрические методы, такие как тесты Крускала-Уоллиса, для сравнения групп. Конкретные необходимые анализы будет зависеть от конкретного научного вопроса и экспериментальный дизайн.

Из отдельных run с REQS выводится таблица данных, производимых DAMSystem308 программного обеспечения, которое будет называться «Monitor1.txt» по умолчанию (для примера см. дополнительный файл 1). Отрывок из такой таблицы показан в таблице 1. Каждый столбец содержит данные из отдельных пробирного трубки, в то время как строки содержат активности, измеряемая в каждый интервал времени от начала эксперимента (вверху) до конца (внизу). Первые три точки данных следует контролировать в том случае, если данные вырезы (таких, как те видели в таблице 2), в которых должны быть скорректированы случае кабель.

Рисунок 2 показывает результаты эксперимента, сравнивая четыре линии генетически различных дрозофилы (DGRP2 линии 371, 703, 810 и 897^12,13). Для каждого из четырех строк десять реплицировать измерения из группы десяти девственной мух обоих полов были собраны как описано в разделе протокол. Из выходного файла программного обеспечения DAMSystem308 «Средняя активность за 5 мин за 10 мух» был рассчитан путем усреднения деятельность меры через всю 2-часовой интервал. Это среднее от каждого столбца таким образом производит один показатель для каждого Пробирной палаты. Сводная таблица, на основе Рисунок 2 приводится в таблице 3.

Представленные в таблице 3 данные были проанализированы ANOVA, тестирование для эффектов генотип, секс, и взаимодействие между сексом и генотип. Как только эффект генотип было значительным (p < 2 x 10^-16), двух полов были объединены в графе показано на рисунке 2. ANOVA обнаружено сильное влияние генотипа, которая проявляется в графе. Уровни активности означает осуществление между всех четырех генотипов значительно отличаются друг от друга (p < 0,05; Тьюки HSD), и таким образом, Рисунок 2 иллюстрирует, как REQS может использоваться для обнаружения влияние генотипа на уровни активности упражнения.

Рисунок 1: REQS. Показано на этой фотографии, REQS используется в этой процедуре. Монитор активности (A) вращается вокруг горизонтальной оси обусловлен вращающейся рукоятки (B). Скорость вращения регулируется через набор (C), и операции машина управляется переключателем вкл/выкл (D). Врезные (E) показывает крупным планом подключения данных между блоком монитор активности и вращающейся телефонной линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: сравнение осуществления деятельности как измеряется REQS в четырех различных штаммов DGRP. Оси: животных генотип. Оси: животных активности измеряется как пересечения луча на 10 животных за 5 мин. Ответ: DGRP2 линия 897; B: DGRP2 линия 810; C: DGRP2 линия 703; D: строка DGRP2 371. График, показанный здесь объединяет данные из мужчин и женщин, поскольку не было никаких значительных секс эффект для этих конкретных линий (ANOVA; p = 0.557). Однако есть эффект сильной генотипа (ANOVA; p < 2 x 10^-16), и все отдельные сравнения между четырех генотипов являются весьма значительными (Тьюки HSD; p < 0,05). Черный алмаз: среднее генотипов; Черная линия: + /-1 SD (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: пример вывода точных данных из программного обеспечения DAMSystem308. Каждый столбец «Activity(#)» представляет один флакон 10 мух, с активностью, записанная интервалом 5 минут.

Таблица 2: Пример вывода ошибочных данных потери пакетов с программным обеспечением DamSystem308. Каждый столбец представляет один флакон 10 мух, с активностью, записанная интервалом 5 минут. Строки 12:00:00, 12:10:00 и 12:20:00 Показать «0» деятельность записи по всем столбцам, указывающее на проблему с подключением к данным (неисправность? «Да» в последней колонке).

Таблица 3: пример данных, используемый для создания Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Необработанные выходной файл, как программным обеспечением DAMSystem308. Колонка 1 записывает время запятой. Колонка 2 Дата эксперимента и колонка 3 записи время, записанный каждый момент времени. Не используются столбцы 4-10, и столбцы 11-42 представляют записи из 32 слотов монитора активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Как представитель результаты показывают, REQS точно измерять активность осуществления дрозофилы. REQS является гибким и позволяет исследователям решать разнообразные исследования вопросов, относящихся к биологии упражнения или упражнения вмешательств. Существует два важных шага в протоколе для выделения. Во-первых важно для тестирования установки REQS для обеспечения передачи данных от REQS DAMSystem308 работает нормально. Если не правильно настроен, кабель данных может стать запутанной во время вращения, и иногда связь между REQS и DAMSystem308 прерывается на вращающиеся соединения из-за износа (хотя, с почти ежедневного использования REQS, нам пришлось Замените коннектор раз в два года). Это разумно, чтобы держать под рукой запасные части. Во-вторых согласованность экологических параметров имеет важное значение для успешного проведения экспериментов. Дрозофилы очень чувствительны к шум или вибрацию, и таким образом, важно, что эксперимент не нарушается во время сбора данных. Таким образом в идеале, эксперименты, выполняются в выделенный инкубатор, который не доступен во время экспериментального запуска. Внимание на этих двух важнейших шагов обеспечит сбор данных высокого качества от REQS.

В то время как мы здесь продемонстрировать, как REQS может использоваться для измерения активности животных во время 2 часа непрерывного осуществления лечения от групп животных, REQS является гибким, что время и интенсивность упражнений могут быть скорректированы для различных процедур осуществления. Кроме того в зависимости от активности монитор используется, его можно изменить для измерения активности от одного мух или очень большой популяции животных. Кроме того REQS может использоваться для проверки проектирования и оптимизации режимов упражнения. Он также может использоваться для измерения воздействия дополнительных переменных, таких как время дня, животных возраста, диета, численности населения или медикаментозное лечение на индуцированный физическая активность и упражнения ответов. В зависимости от точного экспериментальной установки, т.е., длина режима упражнений и сроки может также использоваться REQS вмешиваться в естественный сон дрозофилы. Эти примеры иллюстрируют универсальный характер REQS и некоторых потенциальных применений в исследованиях дрозофилы. Другие общины малых животных исследования также может быть заинтересованы в адаптации REQS для их целей, расширяя таким образом полезность этого нового инструмента.

В настоящее время одно ограничение REQS является ограниченное количество образцов, которые могут быть обработаны в данный момент времени, который диктуется действия мониторы, используемые, которые пробирного максимум 32 образцов. В то время как использование нескольких единиц REQS возможно позволить REQS использоваться для крупномасштабных генетических экранов или аналогичных приложений, разработка более высокой пропускной способности версии REQS бы идеально.

Благодаря своей способности измерять уровни активности, вызванные идентичным образом Treadwheel, REQS может использоваться в сочетании с Treadwheel, который позволяет за несколько более высокую пропускную способность (48 образцов могут быть обработаны одновременно). Осуществление протоколов могут быть оптимизированы с помощью REQS и затем реализованы на Treadwheel для дальнейших исследований. Таким образом Treadwheel и REQS могут использоваться дополнительные, необходимые для конкретного исследования конструкций.

REQS является важным шагом вперед в исследованиях дрозофилы упражнения как позволяет для количественной оценки деятельности индуцированная. Имея машину, которая одновременно может вызвать физические упражнения и меры, это упражнение было ясно нуждаются в дрозофилы осуществлять поле, как немецкая группа ученых независимо разработана очень подобное устройство, называют «качели лодка,», который также использует действие монитор для измерения активности во время упражнения, вызванных вращением¹⁴. «Качать лодку» не использовать полной ротации, но вместо этого колебания активности монитор назад и вперед приблизительно 30 градусов вокруг оси вращения. Таким образом, «качели, лодка, «как REQS, использует вращение постоянно стимулировать ответ отрицательный geotaxis и увеличение активности животных. REQS и «качели лодка» дополнять существующие видео отслеживания методы, используемые для анализа дрозофилы после стимуляции, такие как дрозофила возбуждение отслеживания системы (DART)¹⁵. REQS и «свинг лодка» совершенствовать системы как Дарт, которые отслеживать деятельность только после прекращения стимул. Таким образом REQS и «качели лодка» являются важные новые инструменты для исследователей в области дрозофилы упражнение, которое может использоваться в сочетании с существующими устройствами Treadwheel и Power Tower.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Работа была поддержана премии номер P30DK056336 из Национального института диабета и ЖКТ и почек болезней через экспериментальный грант от питания и ожирения научно-исследовательский центр при университете штата Алабама в Бирмингеме в NCR.