回転運動の定量化システム (リクエスト) を用いたキイロショウジョウバエの運動レベルの測定

回転運動の定量化システム (リクエスト) は、動物によって実行されるアクティビティの量を同時に測定しながら回転をショウジョウバエ運動を引き起こすことができます。今回、リクエストを使用して回転運動治療法を経験している動物の活動レベルを測定する方法を詳述したポイントによってプロトコル

キイロショウジョウバエは運動の生物学の研究の新しいモデル生物です。までに、2 つの主な運動システム力タワーと、されて記載されています。ただし、運動治療により誘起された動物の追加の活動の量を測定する方法を欠いてきた。回転運動を発生している動物のための動物の活動の測定を提供するこの必要性を回転運動の定量化システム (リクエスト) に塗りつぶします。このプロトコルは、回転運動中に動物の活動を評価するために、リクエストを使用する方法の詳細し、生成できるデータの種類を示しています。ここでは、運動誘発性活動性特異的ひずみと違いを測定するため、リクエストを使用する方法を示します。運動誘発性活動の年齢、食事、または人口のサイズなどさまざまな実験的パラメーターの影響を評価する、リクエストを使用もできます。さらに、それを使用して、さまざまな運動トレーニングのプロトコルの効果を比較できます。重要なは、必要な場合のグループ間の活動の同量を達成するために研究者を許可する系統間の運動治療を標準化する機会を提供します。したがって、リクエストは運動生物ショウジョウバエ モデル システムでの作業の注目すべき新しいリソースであり、運動の既存システムを補完します。

最近では、研究者は、運動生物を勉強するミバエショウジョウバエを使用し始めています。キイロショウジョウバエは、以上 100 年^1,2遺伝子モデル システムをされています。しかし、ショウジョウバエの研究は遺伝学だけでなく、さまざまな神経生物学、行動生物学、生理学³など他の分野にも貢献をしました。2009 年、力のタワーでショウジョウバエの最初の運動マシン説明⁴であった。力タワーでは、動物の負走応答を活用します。時、妨げ、ショウジョウバエは、彼らのエンクロージャの上に移動する傾向にあります。この応答がよく確立され、登坂力やショウジョウバエの体力を推定する人気の「リング」(急速な反復負走⁵) アッセイの基礎であります。力タワー (Tinkerhess et al. 2012⁶負走応答を誘導するメカニカル アーム インチいくつかによって彼らのエンクロージャ内の動物セットを繰り返し持ち上げるモーター ユニットに接続し、地面にそれらをバック ドロップを使用します。力タワーの使用を示すビデオを提供する)。力タワーで長期の治療量を増やします (実行中または飛行) に身体活動の動物は無処理動物、体力⁴リングのアッセイでパフォーマンスが向上する時間リード比較して実行します。したがって、この作品は、運動の生物学のモデルとしてのショウジョウバエを使用しての可能性を実証しました。

2016 年にショウジョウバエ運動研究に利用できるツールのレパートリーを拡大するには、メンデスと同僚は 2 番目のショウジョウバエ運動マシンされて⁷を説明します。力タワーと同様に、されては、ショウジョウバエの負走応答を悪用します。ただし、この応答は、吊り上げおよび力タワーのようにドロップすることではなく、動物のエンクロージャの継続的な回転によって誘導されます。この誘導法は穏やかであり力タワーで運動中に発生する可能性があります任意の物理的な外傷を避けるより多く耐久性指向運動体制のことができます (を参照してください Katzenberger、r. j.ら2013⁸の影響を繰り返し物理的なショウジョウバエの健康にトラウマ)。力タワー⁴と同様に、されて動物の運動治療にリード本体重量⁷トリグリセリドのレベル、体力の変化などの生理学的応答のさまざまな。したがって、2 つの相補的な方法は、ショウジョウバエ生物学者運動の勉強にあります。

力タワーのされて 1 つの制限は運動治療による活動の量を測定することができません。ビデオ録画、されてからの解析は、運動治療⁷に対処方法に様々 なショウジョウバエ系統間で有意差があったことを示した。具体的には、系統がどれだけ動物実行追加の活動刺激⁷内の異なる勉強しました。この観測は、3 番目の運動システム、回転運動の定量化システム (リクエスト)、回転誘発運動⁹時に動物の活動レベルを測定することができますを開発するお求め。リクエストは、監視ユニットを介して、されてのように回転運動を刺激するために回転アームにインストールされている市販の活動を利用しています。リクエストの最初の仕事が確約したショウジョウバエの遺伝的に異なる系統-男女 - 回転の刺激を大幅に異なる応答を持つことができ、このように誘発される運動量は異なった遺伝子型の⁹の間で同一ではないです。.したがって、リクエストは今運動分野でさまざまな研究に新しい道を開く処理によって誘発される運動量を測定するショウジョウバエの生物学者をできます。

ここで詳細に回転運動の定量化のためのリクエストを使用する方法を示します。リクエストは回転運動を誘導して同時に扱われる動物の活動レベルを測定します。リクエストはさまざまな運動プログラムを収容することができる、シンプルな 2 h に至るメンデスと同僚⁷、刺激によって複雑な間隔トレーニング方法を示す連続エクササイズを介して調整することができます。回転速度 (1 分あたり回転約 1-13) の間。リクエストを生成するために使用するアクティビティ モニター単位、に応じてこのメソッドは単一のハエの分析または動物の大規模な集団に適応されます。この汎用性のため、リクエストは、ショウジョウバエ研究者人口密度の影響、食事介入やさまざまな運動体制などを勉強する機会の配列を提供します。

リクエストがショウジョウバエのアクティビティ モニター ユニットで構成されています (ソースについては、資料の表をご覧下さい) モーター ユニット (図 1) によって制御される、回転するアームにマウントされています。利用状況モニターは、アッセイ チューブのミドルを解剖のレーザ光線の配列が中断される所定の時間スパンで頻度を指定します。詳細な図面と詳細な特性評価、私たちの前の出版物⁹を参照してください。当社のシステムは、LAM25H ユニットを使用している間、リクエストは同様に他のショウジョウバエのアクティビティ モニター ユニットに合わせて変更できます。

1、リクエストのセットアップのテスト

1. ロード テストは、CO₂や、処理のために、空のチューブにそれらを移動チューブをキャップその他の選択した方法で動物を麻酔によるガラス試料管に飛ぶ。
2. 頂いたガラス試料管をアクティビティ モニター ユニットのスロットに挿入します。チューブのゴム O リング (17-18 ゲージ) を使用してセキュリティで保護されたおよび/またはチューブを確保するユニットの両側に輪ゴムを回転中に移動しないでください。
   1. 試料管を介して 1 つの o リングをスリップし、チューブの中間点近くに o リングを配置します。試料管を正面からアクティビティ モニターのスロットに挿入し、中央に配置。
   2. 必要に応じて、o リングを移動し、試料管を中心にすると、一度は、o リングはできるだけ活動モニター ユニットの近くに下落したことを確認します。ガラス管を再びできるだけ活動モニター ユニットの近くに o リングを移動、後ろから 2 つ目の o リングを入れることによって場所の試料管を修正します。
3. ユニットの前面にある電源スイッチを反転して、リクエストの回転を開始します。(4 rpm (1 分あたり回転) この例では) の所望の速度に、ユニットの前面のダイヤルで回転速度を調整します。
   注: この例では回転の速度は、以前に発行された研究⁷を一致するように選ばれました。異なる回転速度になります異なる動物の活動レベル、新しい研究を開始するとき、特定の実験の設定 (遺伝子型、練習試合等の長さ) の回転速度の最適化が必要かもしれません。
   注: 回転中にリクエスト単位の底に沿ってドラッグしないように、チューブが適切に配置することが重要です。
4. DAMSystem308 ソフトウェアを開いて、接続光のいくつかの回転の緑色を保持してショウジョウバエのアクティビティ モニター装置に付属データ収集システムへの接続をテストします。ソフトウェアが記録データ テキスト ファイル (複数のモニターを使用している場合は、ユニット番号をされている) X"monitorX"にすぐに開始開始時に。「詳細設定」タブで調整できる周波数を記録通常 5 分間隔で記録されます。
5. データ接続が正常に機能していることを確認する DAMSystem308 ソフトウェアによって生成されたテキスト ファイルを調査します。切り欠き (代表結果および表 2を参照)、リクエストですべてのポジションを 0 の活動が記録されている時点で接続に問題があります。切り欠きが発生した場合は、緩いまたはツイスト回転中にこの接続になることが回転の電話ジャックにつながるデータ接続を調整します。我々 は、この問題を回避に役立つテープとの接続を安定させることを見つけます。

2. 動物の準備

注: すべての動物は発生し、糖蜜/コーンミール メディア¹⁰インキュベーター (25 ° C、湿度 60-70%、12 時間の明暗サイクル) で標準的な条件下でテストされました。

1. 二週間前の計画実験がセットアップ バイアルから実験のハエを収集する動物密度の制御我々 は通常、男性 7 名、女性 10 名でバイアルを設定します。単一バイアルからの健全な株式を約 15 処女男女 15 名が 4 日間の期間に収集できます。試金; に必要な動物の数に基づいてセットアップ バイアル数を調整します。当研究室で典型的な試金には 10 処女男女の遺伝子型 (100 男女 100 名) につき 10 セットが含まれています。
   注: 非処女のハエは、特定の実験の質問に応じて使用できます。長期的な非処女動物実験を実施、クロール幼虫は正確なアクティビティの監視を妨げる可能性があります。
2. バイアルを設定した後 1 週間親のハエを削除します。
3. バイアルを設定した後 10 日目に始まり、バイアルから処女ハエを収集し、セックスで区切られた保存します。
4. 実験と、この例では 3 日間必要に応じて年齢のため十分な動物を収集します。
   注: 我々 は通常処理のための CO₂を持つ動物を麻酔します。CO₂は、治療後長期間の動物の活動レベルに影響を与える知られています (たとえば、バーソロミューら2015¹¹を参照)。CO₂効果は、計画の下流のアッセイまたは解析と干渉する場合は、氷 anesthetization など異なる麻酔法を使用します。

3. データ収集、リクエストで

1. CO₂または別の麻酔方法で運動の定量化研究に使用される動物を麻酔します。必要に応じてグループに分けるし、アクティビティ モニターの空のガラス管に動物のグループを読み込むこの例では、同じ年齢の 10 の動物、ガラス管、各動物型 (セックス/遺伝子型) 10 複製し 1 に読み込まれました。注意各チューブにどの動物のタイプをロードすることを確認します。
   注: 長い実験のため食品は検体チューブに含めることができます。この場合、食品が安全で、回転中に外れとなっていないが不可欠です。
2. 要件単位にガラス チューブはアッセイを読み込み、ゴム O リングで固定します。複数セックス/遺伝子型を操作する場合ランダム ブロックの設計または、リクエスト内の動物の位置のランダム化を使用して任意の潜在的な位置の影響がなくなります。ランダム化は、たとえば web ベース乱数ジェネレーター (例えばhttps://www.randomizer.org/) または、スプレッドシートの各バイアル ランダムな番号を割り当てると、ランダムな番号に基づいてバイアルを注文によって実現できます。
3. 一定の温度・湿度・光を確保するためインキュベーターに、リクエストを配置条件。データと電源のケーブルが正しく接続されていることを確認します。
4. 麻酔から回復して 1 h の新しい環境に順応する動物を許可します。
5. 希望の速度でリクエストの回転を開始することによって実験を開始します。
   注: 別のオプションまず回転刺激に対する応答の活動のレベルを記録することによって、回転の開始前に動物からベースライン アクティビティ データを収集することです。
6. (単にソフトウェア開始データ コレクションを開く) DAMsystem308 ソフトウェアを開いて、データの収集を開始します。データは、(ここでは 5 分) に指定された間隔でテキスト ファイルに書き込まれる必要に応じて、「プリファレンス」タブに間隔の設定を変更 (手順 1.4 参照).
7. コンピューターにデータを正常に送信するためには、1 つまたは 2 つの時間間隔が経過して、ファイルにデータが書き込まれていることを確認した後、DAMsystem308 ソフトウェアによって生成されたテキスト ファイルを開きます。閉じて、再度任意の追加の時間の点からのデータを表示するこのファイルを開きます。時間の必要な量のデータを収集します。この例では、2 h。
   注: 動物、あらゆる障害に対し非常に敏感と活動の増加で応答可能性があります、分析期間中にインキュベーターを開かないでください。
8. 運動アッセイの終わりには、DAMsystem308 ソフトウェアを終了してデータの収集を終了し、リクエストをオフにします。ガラス アッセイ チューブから動物を外し、チューブをきれい。繰り返しさまざまな年齢層での対策が必要な場合、動物は食品容器に戻すことができます。
   注: 練習の政体の間に死亡者が発生した場合に記録されなければならないと死んだハエの存在することができますアクティビティの数に影響を与えます。DGRP2 フライ ライン^12,13での経験、4 回転でのエクササイズ 2 h は任意の死亡で起因しなかったが、弱い株が異なる応答可能性があります。

4. データ解析

1. ラベル「モニター 1」DAMSystem308 ソフトウェアによって生成された .txt ファイルを開きます。
2. (不在時点、等; データ集録中に発生した可能性があります問題のデータ ファイルを確認します。表 1)。必要に応じて、先頭と末尾の記録のデータ ポイントを削除することによってファイルを検閲します。
3. 収集したデータを分析 (例えばR)、好みの統計ソフトウェアを使用しています。記述統計を生成し、データが正規分布のとき分散分析 (ANOVA) セックスなど遺伝子の効果を調査するを実行します。データが正規分布していない場合は、グループを比較するクラスカル-ウォリス テストなどの非パラメトリック法を使用します。必要な特定の分析は、特定の科学的な質問と実験的なデザインに依存します。

リクエストと個々 の実行からの出力は、(使用例は補足のファイル 1) 既定でに"Monitor1.txt"をラベル付けする DAMSystem308 ソフトウェアによって生成されたデータ テーブルです。このような表からの抜粋は、表 1に示します。各列には、行に最後 (下) に実験 (上) の初めから各時間間隔で測定されるアクティビティが含まれている間、個々 のアッセイ チューブからのデータが含まれています。というケース、ケーブルを調整する必要があります (これらに見られるなど表 2)、データ切り抜き絵があります、最初の 3 つのデータ ポイントを監視する必要があります。

図 2は、4 つの遺伝的に異なるショウジョウバエ ライン (DGRP2 ライン 897、810、703 371^12,13) の比較実験の結果を示しています。4 行ごとに、男女ともに 10 処女ハエのグループから測定として収集された 10 の複製はプロトコルのセクションで説明します。DAMSystem308 ソフトウェアの出力ファイルから「10 ハエあたり 5 分あたり平均活動」は、全体 2 時間スパンに活動手段を平均することによって算出しました。このなかの各列からこうして各測定室の 1 つのメジャーが生成されます。図 2に基づいている概要の表に表 3に示します。

テーブル 3で提供されるデータは、分散分析、遺伝子型、セックス、セックスと遺伝子の相互作用の効果のテストで分析されました。遺伝子型の効果のみが有意に (p < 2 x 10^-16)、2 つの男女は、図 2に示すようなグラフに結合されました。分散は、グラフで明らかになっている遺伝子の強い効果を検出しました。平均運動活動レベル間のすべての 4 つの遺伝子型は互いと異なっている (p < 0.05;テューキー HSD)、したがって、図 2は運動活動レベルの遺伝子型の影響を検出するためのリクエストの使用方法を示しています。

図 1: リクエストこの写真では、リクエストはこの手順で使用を示します。アクティビティ モニター ユニット (A) は回転アーム (B) によって駆動される水平軸を中心に回転します。回転速度はダイヤル (C) を介して調整可能な機械の操作は (D) のオン/オフ スイッチによって制御されます。インセット (E) は、アクティビティ モニタ ユニットとジャックの回転間のデータ接続のクローズ アップを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 4 つの異なる DGRP 系統のリクエストによって測定される運動活性の比較。X 軸: 動物の遺伝子型。Y 軸: 動物の活動は 5 分あたり 10 動物ごとビーム交差として測定されます。A: DGRP2 ライン 897;B: DGRP2 行 810;C: DGRP2 行 703;D: DGRP2 行 371。ここに示すグラフから男性と女性、データを結合は、これらの特定の行 (ANOVA; 重要な性の効果があったとp = 0.557)。しかし、ある強い遺伝子型の効果 (分散分析;p < 2 x 10^-16)、4 つの遺伝子型の間すべての個々 の比較が非常に重要な (テューキー HSD;p < 0.05)。ブラック ダイヤモンド: 遺伝子型の意味。黒線: ± 1 SD (標準偏差)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: DAMSystem308 ソフトウェアから正確なデータの出力例。列ごとに"Activity(#)"は、5 分間隔で記録された活動の 10 ハエの 1 バイアルを表します。

表 2:DamSystem308 ソフトウェアからパケットロスを伴う故障データの出力例。各列は、5 分間隔で記録された活動と 10 のハエの 1 バイアルを表します。行を 12:00、12:10、そして 12:20 データ接続 (せいに問題を示す、すべての列で「0」の活動記録を見る?「はい」で最後の列)。

テーブル 3: サンプル データを生成するために使用図 2。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足ファイル 1:DAMSystem308 ソフトウェアによって生成された未処理の出力ファイル。列 1 時間ポイント数を記録します。2 列目は、実験と列 3 のレコードの日付、時間の各ポイントが記録される時間を記録します。列 4-10 を使用しないと列 11-42 活動モニターの 32 スロットからの録音を表します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

代表の結果が示すよう、リクエストはショウジョウバエを運動の活動を正確に計測が可能です。リクエスト、柔軟なさまざまな運動の生物学や運動介入に関連する研究質問に対処するための研究者をことができます。強調表示するプロトコルの 2 つの重要な手順があります。まず、リクエスト、リクエストから、DAMSystem308 へのデータ送信が正常に機能していることを確保するためのセットアップをテストするのには不可欠です。されていない場合正しくセットアップ、データ ケーブルは回転中もつれになることができ、(とはいえ、我々 にあった、リクエストのほぼ毎日の使用で、リクエストと、DAMSystem308 間の接続が磨耗・損傷による回転接続で中断される時々コネクタを交換、2 年に一度)。交換部品を手で保持することをお勧めします。第二に、環境パラメーターの一貫性は、実験の成功に不可欠です。ショウジョウバエが音や振動に非常に敏感、したがって、実験、データ収集中に邪魔されないことが重要です。従って、理想的には、実験は、実験の実行中にアクセスできない専用インキュベーターで実行されます。これらの 2 つの重要な手順に注意が、リクエスト数から質の高いデータを収集することを確認します。

ここで、リクエストを使用して動物のグループから 2 時間連続運動療法中に動物の活動を測定する方法を示す、時間と運動強度はさまざまな運動治療法を調整できるという点で、リクエストは柔軟です。また、アクティビティ モニター ユニットの使用によってそれはから単一のはえまたは動物の非常に大規模な集団の活動を測定する変更することがことができます。さらに、デザインと運動体制の最適化をテストするのには、リクエストを使用できます。このユーティリティを使用すると、日、動物の年齢、食事、人口サイズ、または誘導活動や運動に対する薬物治療の時間など追加の変数の効果を測定することもできます。正確な実験装置、すなわち、長さエクササイズとタイミングによっては、ショウジョウバエの自然な睡眠パターンと干渉する、リクエストを使用ことができます。これらの例は、リクエストとショウジョウバエ研究のいくつかの潜在的な用途の多彩な性質を示しています。他の小動物の研究コミュニティもありますの目的のため、リクエストの適応に興味がある従ってこの新しいツールの有用性を広げます。

現在、リクエストの制限の 1 つは、最大 32 サンプルの分析を使用すると、アクティビティ モニターによって決まりますが、特定の時間に処理することができますサンプルの限られた数です。複数リクエスト単位の使用は、大規模な遺伝的画面または同様のアプリケーションに使用するリクエストをすることは可能、リクエストの高いスループット バージョンの開発は理想的であります。

されてと同じ方法で誘導の活動レベルを測定するその能力により、リクエストまでのやや高いスループットを実現できるされてと組み合わせて使用 (48 サンプルは一度に処理することができます)。リクエストを使用して、さらに研究されて上に実装し、運動のプロトコルを最適化できます。したがって、されてとリクエスト使用できます特定の研究デザインのため必要に応じて補完的です。

リクエストは誘導活動の定量化のため、ショウジョウバエ運動研究における重要な前進であります。またアクティビティを利用する運動と測定のこの練習は明確な必要があるショウジョウバエに実践練習場、科学者のドイツのグループが独立して、「スイング ボート、」と呼ばれる非常に類似のデバイスを開発同時に引き起こすことができる機械を持っていること回転¹⁴による運動時の活動を測定するモニター。「スイング ボート」完全な回転を使用しませんが、代わりにアクティビティ モニター ユニット バックと回転の軸線のまわりなど約 30 度のスイングします。したがって、「スイング ボート、」リクエスト数のような継続的に動物の活動を高める負走応答を誘導して回転を使用します。リクエストと既存のビデオ追跡方法ショウジョウバエ覚醒追跡システム (DART)¹⁵などの刺激後ショウジョウバエを試金する「スイング ボート」補完。刺激中止後のみの活動を追跡する、ダーツのようなシステムを改良する、リクエストと「スイング ボート」。したがって、リクエストと「スイング ボート」、既存されておよび力タワーのデバイスと組み合わせて使用することができますショウジョウバエ運動分野の研究者の重要な新しいツールです。

著者が明らかに何もありません。

仕事は、賞の数 P30DK056336 から、国立研究所の糖尿病と消化器系と腎臓病 NCR 栄養と肥満研究所アラバマ大学バーミンガムからパイロットをによって支えられました。