Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать

Нил красное окрашивание фиксированной Caenorhabditis elegans — это метод для количественного измерения нейтральных липидных отложений, в то время как нефть красный O пятнать способствует качественной оценки липидного распределения среди тканей.

Caenorhabditis elegans является организма исключительные модели для изучения метаболизма липидов и энергетического гомеостаза. Многие из его гены липидного сохраняются в организме человека и связаны с метаболическим синдромом или других заболеваний. Экспертиза накопления липидов в этот организм может осуществляться фиксирующие красителей или метки бесплатные методы. Фиксаторные пятна, как Нил красный и масло красный O недорогой, надежный способов количественно измерить уровень липидов и соблюдать качественно распределение липидов в тканях, соответственно. Кроме того эти пятна позволяют для высокопроизводительного скрининга различных генов метаболизма липидов и пути. Кроме того их гидрофобная природа облегчает растворимости в липидах, уменьшает взаимодействие с окружающих тканей и предотвращает диссоциации в растворитель. Хотя эти методы эффективны при рассмотрении содержания общих липидов, они не предоставляют подробную информацию о химическом составе и разнообразия липидных отложений. Для этих целей, лейбл бесплатные методы, такие как GC-MS и автомобили микроскопии лучше подходит, их расходы, несмотря на.

Липиды являются необходимым для жизни. Они являются неотъемлемыми компонентами мембран, выступать в качестве вторичного посыльных и сигналов датчиков и имеют важные функции в хранения энергии. Когда метаболизма липидов является dysregulated, это приводит к заболеваний, как ожирение и диабет типа II, которые насущных проблем общественного здравоохранения⁹. Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой отличную модель организм для изучения метаболизма липидов, потому что он имеет относительно короткий жизненный цикл, прозрачное тело, известный клеток линии и полностью виртуализированного генома. Главным образом гермафродита, C. elegans позволяет исследователям привлечь большое количество isogenic животных в короткие периоды времени выполнять вперед генетических экраны высокой пропускной способностью для изучения широкий спектр метаболических генов и пути⁴. Этот подход показал высокую степень сохранения в 273 генов метаболизма липидов C. elegans среди людей, мышей, крыс и дрозофилы. Кроме того более 300 липидов генов у нематоды Caenorhabditis elegans у человека orthologues, которые связаны с заболеваниями, не связанные с метаболическим синдромом¹¹. Традиционно изучение хранения липидов в C. elegans основном опирался на краситель меченых анализов, которые предоставляют надежную информацию о накопление липидов. Реже представляет собой описание где локализовать липиды и измеренных различия в изобилии липидов в тканях. Однако последние работы показал, что распределение липидов может быть также важно, как накопление липидов⁶.

В последнее время, исследования начали интеграции методы, такие как высокая производительность жидкого хроматография масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС), и последовательной анти Стокса микроскопия комбинационного рассеяния (легковые автомобили) адрес недостатки подходов, основанных на пятно, анализируя содержание липидов экстрактов, конкретных Липидные фракции и липидных отложений, соответственно^10,11непосредственно. Кроме того автомобили микроскопия показала, что Нил красный может служить лишь в качестве прокси для накопление жира при использовании в качестве фиксирующие краска, для его использования как пятно жизненно приводит к пятнать пробить авто люминесцентные органеллы¹⁰. Однако необходимых технических специалистов и расходы, связанные с этими хроматографии и методы микроскопии делают их использования неприемлемой для многих исследований вопросов. В этой статье мы обсудим удобный и надежный способ фиксировать и выведение липидный нейтральными вкладов в C. elegans с помощью Нил красный и масло красный O различать изобилие липидов в целом животных и в определенных тканях.

Нил красный, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, является benzophenoxazone краска, которая легко растворяется в различных органических растворителей, но в основном нерастворимые в воде. Это отличный lysochrome краска используется для пятно нейтральные липиды как триглицеридов или эфиры холестерина потому, что он имеет сильный цвет, solubilizes хорошо в липиды, имеет незначительное взаимодействие с окружающими тканями и менее растворим в растворитель чем в липиды. Он имеет возбуждения и выбросов Максима 450-500 и 520 Нм, соответственно¹. При просмотре Нила красно окрашенных C. elegans для зеленой флуоресценцией дискретных липидов органов может быть наблюдается на протяжении кишечника и других тканях либо в кластеры или равномерно рассеяны, в зависимости от генотипа животного или экспериментальное лечение ⁷.

O нефти красный является lysochrome, жирорастворимых краситель, используемый для пятно триглицеридов и липопротеидов. Это называется azo краситель, потому что его химическая структура содержит две группы АЗО, придает трех ароматических колец. Это трудно ионизируется, который оказывает растворяется в липидах. Его пятно цвета красный и его максимального поглощения света — 518 Нм ³. C. elegans витражи с маслом, красный O показывают красный липидного капель, которые стоят вне против прозрачное тело животного, которое способствует качественной оценки липидного распределения среди различных тканей⁶.

1. Нил красный (NR) пятная липидов

1. Подготовка 5 мг/мл NR Стоковый раствор
   1. В 500 мл бутылки добавьте 100 мг порошка NR 200 мл ацетона, 100%.
   2. Обложка бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы избежать любого воздействия на свет.
   3. Перед применением перемешайте раствор 2 h в темноте.
   4. Для долгосрочного использования храните в плотно закрытой бутылке без любой освещенности Стоковый раствор NR. Стоковый раствор масштаба NR согласно потребности в научных исследованиях. Убедитесь, что же Стоковый раствор используется через NR-окрашивание эксперименты для получения последовательной окрашивание и визуализации результатов.
2. Приготовление рабочего раствора NR
   1. Для каждого 1 мл 40% изопропиловый спирт (v/v) мкл 6 NR Стоковый раствор.
   2. Подготовка 600 мкл рабочего раствора NR для каждого образца.
      Примечание: Сделать свежий NR работает право решения до окрашивания. В зависимости от потребностей Стоковый раствор NR используйте 15 мл или 50 мл окончил Конические трубки.
3. Подготовка червей для окрашивания липидов NR
   1. Червей расти ранней стадии L4 при 20 ° C на нематод роста среднего (НГМ) семенами с конца журнала ОР50 E. coli.
   2. Моют червей от пластины с 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline + 0,01% раствор Тритон X-100 (PBST) и положить подвеска червя в 1,5 мл отцентрифугировать.
   3. Центрифуги, черви на 560 x g за 1 мин удалить супернатант и повторить этот шаг до E. coli очищается от подвески.
   4. 100 мкл 40% изопропиловый спирт червь Пелле и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин.
   5. Центрифуга для червей на 560 x g за 1 мин и удалить супернатант без нарушения червь Пелле.
      Примечание: Использование больших объемов PBST мыть червей от пластин, если с помощью больших пластин или окрашивания больше червей за тарелку. Не мойте червей в PBST более чем за 15 мин до фиксации образцов. Выполните дополнительные автомойки, если супернатант не очищается от бактерий. Проводить инкубацию в 40% изопропиловый спирт, с помощью nutator или рокер. Всегда контролировать трубы, чтобы убедиться, что происходит полный пример агитации.
4. Липидов, окрашивание с NR
   1. В темноте добавьте 600 мкл рабочего раствора NR для каждого образца. Инвертировать трубок три раза и полностью смешать червей в растворе NR.
   2. Вращайте образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
   3. После инкубации центрифуга червей на 560 x g за 1 мин и удалить супернатант.
   4. 600 мкл PBST и Проинкубируйте образцы в темноте для 30 минут, чтобы удалить избыток NR пятно.
   5. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и удалить все, но примерно 50 мкл супернатант.
      Примечание: NR инкубации не требуют агитации. Оседание червей часто встречается во время этого шага.
5. Подготовка слайдов изображения микроскопа
   1. Ресуспензируйте червь Пелле в оставшихся супернатант.
   2. Место 5 мкл суспензии червя на микроскопа и положить coverslip на тщательно во избежание захвата воздушные пузыри.
   3. Уплотнение coverslip с лак до визуализации червей.
   4. Подготовьте только пару слайды одновременно. Это будет гарантировать, что NR изображений остается постоянным по всей пробы. Качество NR-окрашенных изображений уменьшается после того, как 6 ч. дискретные липидного капель трудны для того наблюдать и фон флуоресценции увеличивается, который вмешивается NR сигнал обнаружения.
6. Визуализационная диагностика NR-окрашенных червей
   1. Изображения червей на 5 X увеличение захватить несколько животных в поле зрения.
   2. Переключиться на 10 крат лучше количественной оценки отдельных червей.
   3. Используйте канал FITC/GFP изображения NR-окрашенных червей и попробовать различные воздействия раз, чтобы определить оптимальные условия для количественной оценки.
   4. Сохранение файлов в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      Примечание: Типичный воздействия раз варьируются от г-жи 100-1000, успев оптимальной экспозиции, использовать его для всех образцов для поддержания последовательности изображений.
7. NR окрашивание изображения количественная оценка
   1. Загрузите микроскопии ImageJ. В раскрывающемся меню Плагины используйте функцию био-форматов, если файл изображения не распознается.
   2. В раскрывающемся меню изображения, под функцию стеки используйте изображения для стека для создания стека изображений при сравнении нескольких микроскопии.
   3. В том же выпадающее меню настроить яркость/контрастность изображения стека и распространить изменения на все изображения, нажав кнопку Применить.
   4. Использовать выбор многоугольник разграничить каждый образ червя и использовать функцию меру под анализ выпадающее меню для количественного определения интенсивности флуоресценции, испускаемых NR.
   5. Для каждого изображения измерить пяти местах фон и рассчитать интенсивность флуоресценции средняя фоновая.
   6. Вычитание фона интенсивности флуоресценции от каждого образа червя по формуле N = G - (A x B), где N – чистая флуоресценции, G для грубых флуоресценции, А для всего червь области и B для флуоресценции средняя фоновая.
   7. Нормализовать интенсивности флуоресценции размером червь, разделите каждый червь чистой флуоресценции, его общая площадь. Результаты представлены как интенсивности флуоресценции в произвольных единицах (а.е.), на пиксель.
      Примечание: Избегайте экспорт изображений в формате JPEG. В то время как сжатие делает более управляемым для хранения файлов, нарушения целостности данных в этот формат. Убедитесь, что все изображения изменены и проанализированы одинаково. Не забудьте включить линейку правильно оценить размер при различных увеличениях. Для лучше визуализировать различия в интенсивности флуоресценции, используя ImageJ, переключить тип изображения из RGB в 8-разрядный и выберите огонь из меню поиска таблиц (LUT) изображения. Это создает образ тепло карта, в которой увеличение цвета яркость коррелирует с повышенной флуоресценции интенсивности.

2. масло красный O окрашивание (Оро) липидов

1. Подготовка Оро Стоковый раствор
   1. Во флаконе 250 мл добавить 500 мг порошка Оро в 100 мл 100% изопропиловый спирт и хорошо перемешайте.
   2. После подготовки, хранения решения, плотно закрытой с не освещенности.
2. Приготовление рабочего раствора Оро
   1. Разбавьте Оро Стоковый раствор в воде (3:2) до 60% изопропиловый спирт.
   2. Перед использованием фильтра рабочего раствора Оро через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем ацетат целлюлозы.
      Примечание: Для лучшего качества решения, приготовить рабочий раствор Оро за день до и пусть это смешать всю ночь. Однако если решение является необходимой тот же день, разбавленных и перемешать Оро решение на рокер для по крайней мере 2 ч перед использованием. Перед качания, оберните Конические трубки в парафин ленты, чтобы избежать утечки раствора Оро.
3. Подготовка червей для Оро липидов пятнать
   1. Растут червей при 20 ° C на нематод роста среднего (НГМ) семенами с конца журнала ОР50 E. coli желаемый жизни сцену.
   2. Добавить 1 мл PBST раствора к пластине и вихрем до тех пор, пока все черви являются у плиты. Наклона пластины и мыть его с 1 мл PBST. Передать червь подвеска 1,5 мл отцентрифугировать.
   3. Центрифуги, черви на 560 x g за 1 мин удалить супернатант не нарушая гранул и повторите стирки шаг с 1 мл раствора PBST три раза. Удалите все супернатанта но 100 мкл.
   4. 600 мкл 40% изопропиловый спирт Пелле червя и рок его при комнатной температуре в течение 3 мин.
   5. Центрифуга червей на 560 x g 30 s и удалить все супернатанта но 100 мкл без нарушения червь Пелле.
      Примечание: Используйте более высокие объемы PBST мыть червей у плиты, если делать высок объём окрашивание. Не мойте червей в PBST более чем за 15 мин до фиксации образцов. Сделайте дополнительные автомойки, если супернатант не очищается от бактерий. Осуществляют инкубации в 40% изопропиловый спирт, с помощью nutator или рокер. Всегда контролировать трубы, чтобы убедиться, что происходит полный пример агитации.
4. Липидов, окрашивание с Оро
   1. Добавление Оро 600 мкл рабочего раствора для каждого образца. Инвертировать трубу в три раза и перемешать червей в Оро.
   2. Поворот образцов 30 об/мин – 2 ч при комнатной температуре.
   3. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и ликвидации всех супернатанта но 100 мкл.
   4. Ресуспензируйте образцы в 600 мкл PBST и поверните трубы на 30 об/мин за 30 минут, чтобы удалить избыток Оро пятно.
   5. Центрифугуйте образцы на 560 x g за 1 мин и ликвидации всех но 50 мкл супернатант.
   6. Чтобы лучше различать местоположения животного микрофлорой и кишечные клетки, пятно ядер, добавив 1 мкл (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-индол-6-carboxamidine) (DAPI) для каждого 1 мл Оро рабочего раствора. Осуществляют Оро пятнать 2 h с добавлением DAPI до монтажа слайды для изображений. Кишечные ядер больше по размеру и Гонада отличается развивающихся зародышевых клеток.
      Примечание: После окрашивания Оро, черви могут придерживаться стороны отцентрифугировать трубки и не формируют заметно Пелле. Если это произойдет, центрифуга черви снова или разрешить червей урегулировать самотеком по крайней мере 10 минут.
5. Подготовка слайдов для визуализации червь
   1. Ресуспензируйте червей в оставшихся супернатант и хорошо перемешать раствор.
   2. Поставьте 5 мкл суспензии червя на микроскопа и место coverslip тщательно, обеспечение не воздушные пузыри форме.
   3. Уплотнение coverslip с ногтей и изображения червей.
      Примечание: После фиксации и окраски, черви может быть очень жесткой и трудно Пипетка. Чтобы обойти это, делают широкий родила пипетки, отрезав их советы.
   4. Храните слайды в микро центрифуга стойку на 4 ° C до 24 часов, если не изображений сразу же после окрашивания.
6. Визуализационная диагностика Оро окрашенных червей
   1. Используете цвет способный камеру для изображения Оро окрашенных червей.
   2. Используйте 5 X увеличение изображений несколько червей в одном поле зрения.
   3. Переключитесь в 10-кратном для лучшего изучения отдельных червей.
   4. Экспорт изображений в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      Примечание: Если окрашивание с Оро + DAPI, переключите цвет способный камеру в один, который может захватить флуоресценции.
7. Анализ изображений Оро окрашенных червей
   1. Загрузите micrograph(s) ImageJ. В раскрывающемся меню Плагины используйте функцию био-форматов, если файл изображения не распознается.
   2. В раскрывающемся меню изображения, под функцию стеки используйте изображения для стека для создания стека изображений при сравнении нескольких микроскопии.
   3. Отрегулируйте Яркость/контраст под же выпадающее меню для улучшения видимости капелек липидов.
   4. Классификация изображений по накопление липидов на протяжении всего тела животного или в определенных тканях.
   5. Для лучшей оценки липидного локализации и для идентификации изображения неспецифической артефактов с помощью ImageJ выберите функцию цвета в раскрывающемся меню изображение и нажмите на стек в RGB для отображения сигналов каждого компонента RGB.

SKN-1 является bZip, цитопротективных транскрипционный фактор, который разделяет гомологии с млекопитающих NRF2 и было показано, что посредником окисление жирных кислот. В зависимости от концентрации глюкозы в их диете черви с аллеля конститутивно активированные skn-1 показывают уровень различных липидов при окрашенных с Нил красный⁷. Рисунок 1A -C показывает активированные skn-1 животных, подвергшихся воздействию условий, которые приводят к увеличению уровня липидов. NR флуоресценции захвачен с помощью канала FITC/GFP видных вдоль кишечника, но диммер в голову, хвост и просвета кишечника. Как увеличить уровень липидов, дискретные NR-окрашенных частицы являются более трудно различить, который может потребовать меньше времени экспозиции. Хотя этот метод использует интенсивности флуоресценции в качестве количественных прокси для накопления липидов, неадекватным в отличительный неспецифических пятнать клеточных структур, которые не являются жира магазинов и подвержен сигнал помехи от кишечных авто флуоресцирование. Таким образом альтернативные метки и методы-метка должна использоваться параллельно однозначно определить нейтральные липиды в животных¹⁰.

Возраст зависимых соматических истощение Fat (Asdf), — что фенотип, что происходит в возрасте червей, whereby отображения животных снизилась соматической клетки липидов, в то время как клетка семенозачатка липиды остаются неизменными⁶. Пятнать Красного масла O не является метод, который надежно измеряет уровень липидов, но отлично подходит для визуализации липидов локализации и полезен для определения жира истощения фенотипов как Asdf в червь. Хотя это легко классифицировать глисты согласно наличие или отсутствие Asdf, это может быть трудно идентифицировать животных с промежуточным жира (рис. 2A). По сравнению с не Asdf животных, которые показывают ярко-красные пятна по всему телу с несколько полупрозрачных областей (рис. 2B), Asdf черви обладают заметно истощения жира в клетках кишечника (рис. 2 c). Животные в процессе разработки Asdf (Рисунок 2D) часто Показать полупрозрачный пятна, где большинство потери жира в конечном итоге происходит. Кроме того Asdf черви могут по-прежнему располагают ярко красного окрашивания в регионах головы и хвоста потому что фенотипа не определен полный соматических потери жира, но обширные жира истощение по отношению к не возраста (не Asdf) животных. Использование нефти красный O окрашивание, таким образом, позволяет для качественного определения локализации липидов и выявление фенотипов, которые существенно изменить жировых отложений в червь.

Рисунок 1: пятнать липидов, Нил Ред Нил красное окрашивание активирован skn-1 мутантов в условиях, которые вызывают повышение липидов накопления (A-C). Усиление функции skn-1 штамм (lax188) гавани E237K аминокислоты замены, визуализирующего конститутивно активных SKN-1. L4-этап червей были подвержены 0, 15 и 30 J/m² УФ свет последовал период восстановления 12-h на unseeded NGM пластины перед NR-окраски и обработки изображений. Изображения показаны являются представитель фенотипа. Липидов количественная оценка была проведена как упомянуто в разделе 1.7. Огонь-это ImageJ Посмотреть таблицу (LUT) используется для создания тепловизионное изображение, которое показывает флуоресценции интенсивности различия между изображениями. Слиянием показывает FITC/GFP и DIC изображения объединены. Количественная оценка интенсивности флуоресценции для каждого изображения отображается в нижней части Фотомонтаж изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: пятнать липидов, масло красный O. Масло красное окрашивание O активирован skn-1 мутантов (lax188) показывает наличие или отсутствие Asdf фенотип (A-D). A & D шоу животных с промежуточным Asdf фенотипов. B & C отображения напротив Оро окрашивание. Хотя Б не Asdf, C показывает существенные соматических жира истощения с соответствующим увеличением микрофлорой накопление жира, который определяет Asdf фенотип. Черви окрашивали Оро, следуют изображений 144 hafter L1-синхронизированы животных были размещены на NGM СМИ семенами с ОР50 бактериями. Изображения показаны являются представитель животных с или без Asdf фенотип. Врезные Мультфильмы изменяются от Линн, и др. ⁶ и представляют собой отсутствие (B) или наличие (C) соматических жира истощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рост ожирения и метаболических заболеваний ставки делает C. elegans подходящую модель для изучения механизмов, которые регулируют накопление жира в клетках и тканях. Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в уровне липидов коррелируют с клеточных процессов, начиная от инсулина, сигнализации⁸, активации гормон рецепторов², чтобы репродуктивные выход⁵. По сравнению с этикетки бесплатно микроскопии и методы хроматографии, Нил красный и нефти красный O являются относительно недорогим красители, используемые для пятно нейтральные липиды в червь последовательно и герметизации^10,12,13. Первая позволяет для количественного определения уровней всего липидов, в то время как второй облегчает оценки липидного распределения среди тканей, таких как подкожную клетчатку, кишечника и зародышевой линии. При использовании в сочетании, NR и Оро позволяют исследователям определить как генотип и экологические изменения влияют на накопление липидов и где в червь эти изменения происходят.

Эти красители, тем не менее, не оценить непосредственно накопление липидов в том же неинвазивные как автомобили микроскопии¹². Таким образом они склонны к ошибкам во время фиксации и окраски, которая может поставить под угрозу измерения точности¹³. Кроме того, эти красители могут непреднамеренно взаимодействовать с липофусцин и кишечные гранул, что приводит к флуоресцирования, не связанные с внутриклеточной нейтральный жир магазины^10,14. Кроме того в тех случаях, когда уровни липида появляются низкие, NR и Оро окрашивания не может отличить, если результаты результаты от проницаемости вопросов или уменьшить накопление жира. Кроме того чувствительность этих пятен света требует специальных мер во время хранения и активную обработку этого предела деградации и фото отбеливания. Однако если осторожность при выполнении и выводов с метками анализов, NR и пятнать Оро являются отличным средством вперед генетических экранов для изучения путей метаболизма липидов и изучить их взаимодействия с другими физиологическими функции. Чтобы сделать относительное сравнение накопления увеличение и снижение липидов, соответственно рекомендуется использовать daf-2 и жир-6 червей. Мытье и фиксирующий шаги NR и Оро пятнать похожи. Таким образом оба могут выполняться в тот же день. Однако только слайды с Оро окрашенных черви могут храниться для визуализации позже, потому что NR пятнать несовместимо через 6 ч. Во время стирки, важно включить Тритон 100-X не только для повышения проницаемости NR и Оро, но и избежать потери червя из-за чрезмерной приверженности пластик. Кроме того черви должны быть вымыты менее чем за 30 мин до окрашивания для обеспечения максимальной проницаемости для каждого пятна. Хотя NR и Оро инкубации раз может быть уменьшено до 1 ч 30 мин, соответственно, рекомендуется следовать за время, предложенных в этой статье для более последовательного окрашивание и визуализации результатов. Длительное воздействие NR решения свет и неспособности фильтровать Оро решение до использования увеличит флуоресценции фон во время визуализации. Проведение этих пятная протоколы требуется 3-4 ч в дополнение к визуализации времени. Хотя пятно инкубации предлагает более 2 ч паузы между шагами, настоятельно рекомендуется что протоколы осуществляется с перерывами в несколько максимально сократить многие источники ошибки, присущие для всех на основе красителя методы количественной оценки липидов и экзамен.

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Эта работа стала возможной благодаря гранта NIH: R01GM109028 (S.P.C.)