脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

ナイルの赤固定線虫の染色は、組織中の脂質分布の定性的な評価を容易にオイル赤 O 染色中性脂質堆積物の定量的測定法です。

線虫脂質代謝・ エネルギー代謝を研究するための特別なモデル生物であります。その脂質の遺伝子の多くは人間には維持され、メタボリック シンドロームまたはその他の疾患に関連付けられています。この生物における脂質蓄積の検討は定着性染料またはラベル自由な方法で実施できます。定着性の汚れはナイル川のように赤いとオイル赤 O の脂質レベルを定量的に測定し、質的、組織間でそれぞれ脂質分布を観察する安価な信頼性の高い方法があります。さらに、これらの汚れ各種の脂質代謝遺伝子および細道の高速スクリーニングを可能にします。また、疎水性性質は、脂溶性を容易に、周囲の組織との相互作用を減らす溶媒に解離を防ぐことができます。これらのメソッドは一般的な脂質含量を調べることで効果的なしかし、化学組成と脂質堆積物の多様性の詳細については行いません。これらの目的は、GC-MS と車の顕微鏡などラベル自由な方法がより適していますな、コストにかかわらず。

脂質は、生命に不可欠です。膜の不可欠なコンポーネント、二次メッセンジャーとして機能し信号のトランスデューサー、エネルギー貯蔵に重要な機能を持っています。脂質代謝が調節不全、肥満、II 型糖尿病、公衆衛生の懸念⁹を押しているような病気に します。線虫(線虫) 比較的短いライフ サイクル、透明体、知られている細胞系統、完全に配列されたゲノムをもっているために、脂質の代謝を研究するためのエクセレント モデル生物であります。両性具有者に主にc. の elegansは、要するに持ち帰り高スループット転送遺伝子スクリーニング遺伝子経路の代謝⁴の広い配列を勉強する時間の期間の同質の動物の数が多いを高めるために研究者をことができます。このアプローチは、273線虫脂質代謝遺伝子ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエにおける保全の高度を明らかにしました。さらに、線虫の以上 300 の脂質遺伝子人間第オーソロガス メタボリック シンドローム¹¹に関係のない病気に関連付けられているがあります。伝統的に、線虫脂質ストレージの検討が主染料ラベルのアッセイは、脂質蓄積に関する信頼性の高い情報を提供にしていました。あまり一般的は、組織全体で脂質がローカライズして豊富な脂質の測定の違いの説明です。しかし、最近の作品では脂質分布を脂質蓄積⁶と同じくらい重要にすることができることを明らかにしました。

最近は、高性能液体クロマトグラフィー質量分析 (高速液体クロマトグラフィー-MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS) などの方法を統合する研究を始めているし、コヒーレント反ストークス アドレスにラマン散乱 (CARS) 顕微鏡、脂質抽出物、特定の脂質画分および脂質堆積物、それぞれ^10,11の内容を直接分析することによって汚れ・ ベース ・ アプローチの欠点。さらに、CARS 顕微鏡ではナイルの赤は、脂肪蓄積オフのターゲット自動蛍光細胞小器官¹⁰の染色につながる重要な汚れとの使用のため定着性色素として使用する場合のプロキシとして使用できますを明らかにしました。ただし、これらのクロマトグラフィーに関連する必要な技術的な専門知識とコスト、顕微鏡検査方法の使用多くの研究質問理不尽。この記事ではこだわると線虫ナイルの赤を使用して中性脂質沈着汚れし、オイル赤 O の脂質豊富な全動物と特定の組織を区別するために便利で信頼性の高い方法をについて説明します。

ナイルの赤、9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one、benzophenoxazone 染料容易に様々 な有機溶剤に溶解するが、主水に溶解されていません。それは優秀な lysochrome 色素中性脂質トリグリセリドなどを染色するために使用またはコレステロール エステルそれは強い色を特徴とするので可溶性脂質で、周囲の組織とのごくわずかな相互作用よりも溶剤に難溶です。脂質。450-500 と 520 の nm、それぞれ¹の励起・発光極大値があります。離散脂質体の腸や他の組織の中でいずれかのクラスターを観察または動物の遺伝子型または実験的な治療によって、均等に分散できる蛍光グリーンのナイルの赤はc. の elegansをステンド グラスを見ると、⁷。

オイル赤 O、lysochrome、トリグリセリド、リポタンパク質を染色に使用される脂溶性の色素です。アゾ染料は、その化学構造に 3 つの芳香環に接続されている 2 つのアゾ基が含まれているために呼び出されます。それは、イオン化することは困難非常に脂質に溶けるがレンダリングをします。その汚れの色は赤く、その光吸収最大は 518 nm ³。線虫は、オイル赤い O ショー異なったティッシュ⁶脂質分布の定性的な評価を容易に動物の透明体に対して際立つ赤脂質液滴と汚れます。

1. ナイル (NR) 脂質の染色

1. 5 mg/mL NR ストック溶液の調製
   1. 500 mL ペットボトルで 100% アセトン 200 mL に NR 粉末 100 mg を追加します。
   2. 光への露出を避けるためにアルミ箔でボトルをカバーします。
   3. 使用前に暗闇の中で 2 時間のためのソリューションをかき混ぜます。
   4. 長期的な使用、光の露出をせず密閉瓶で NR の原液を格納します。研究のニーズに応じて NR 原液をスケールします。NR 染色実験間で一貫性のある染色とイメージングの結果を取得する使用される同じ在庫ソリューションを確認します。
2. NR 作業溶液の調製
   1. すべて 1 mL 40% イソプロパノール (v/v)、NR 原液の 6 μ L を追加します。
   2. 各サンプルの NR 実用的なソリューションの 600 μ L を準備します。
      メモ: は、染色する前にソリューション権利を働いて新鮮な NR をください。NR 在庫ソリューションのニーズ、に応じて 15 mL または 50 mL のメスシリンダーの円錐管を使用します。
3. NR 脂質染色のワームの準備
   1. 線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50エシェリヒア属大腸菌でシードの 20 ° C で L4 早期にワームを成長します。
   2. X リン酸緩衝生理食塩水 + 0.01% トリトン X-100 (pbst;) 溶液 1 ml の 1 プレートからワームを洗って 1.5 mL および microfuge の管でワームの懸濁液を置きます。
   3. 遠心 560 x gで 1 分間にワームは懸濁液から清と繰り返し大腸菌まで、この手順をオフにするを削除します。
   4. ワーム ペレットに 40% イソプロピル アルコール液 100 μ L を追加し、3 分間室温でインキュベートします。
   5. 1分間 560 x gでワームを遠心し、ワームのペレットを中断させることがなく、上清を除去します。
      メモ: pbst; 場合、皿のワームを洗うのに大量に使用より大きい版を使用して、プレートごとに多くのワームを染色します。サンプル固定する前に 15 分以上の PBST でワームを洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を実行します。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。
4. 脂質染色 NR
   1. 暗闇の中 NR 実用的なソリューションの 600 μ L を各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、NR のソリューションでワームを完全にミックスします。
   2. 2 時間室温で暗闇の中サンプルを回転させます。
   3. 次の孵化、1分間 560 x gでワームを遠心し、上清を除去します。
   4. Pbst; 600 μ L を追加し、余分な NR 染色を削除する 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。
   5. 1分間 560 x gでサンプルを遠心し、上清の約 50 μ L を除くすべてを削除します。
      注: NR インキュベーションでは、攪拌は必要ありません。このステップの間にワームのセトリングが一般的です。
5. 顕微鏡のスライドの準備
   1. 残りの上清でワーム ペレットを再懸濁します。
   2. 顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を置き、空気の泡を引っかけないように慎重に観察をつけます。
   3. ワームをイメージングする前にマニキュアで coverslip をシールします。
   4. 一度にいくつかのスライドのみを準備します。これは NR 画像はサンプル間で一定となります。NR 染色画像の品質低下後 6 h 離散脂肪滴が観察することは困難と背景の蛍光性の増加、NR 信号検出を妨害します。
6. NR ステンド ワームのイメージング
   1. ビューのフィールドごとのいくつかの動物を捕獲する 5 倍の倍率でワームをイメージします。
   2. 個々 のワームよりよい定量化の 10 倍の倍率に切り替えます。
   3. NR ステンド ワームをイメージして定量化のための最適の条件を決定する異なる露光時間 FITC/GFP チャネルを使用します。
   4. 圧縮データを失うことを避けるために TIF 形式でファイルを保存します。
      注: 典型的な露出時間の範囲は 100-1000 さんが最適な露出時間を過ごしてから、イメージの一貫性を維持するすべてのサンプルのためにそれを使用します。
7. NR 染色画像の定量化
   1. ImageJ に顕微鏡写真をアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。
   2. スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。
   3. 同じプルダウン メニューで画像のスタックの明るさ/コントラストを調整し、適用をクリックしてすべての画像への変更を反映します。
   4. 各イメージのワームを描く NR によって放射される蛍光強度を定量化し解析プルダウン メニューの下メジャー関数を使用して、多角形選択ツールを採用してください。
   5. 各イメージの 5 つの背景の場所を測定し、平均バック グラウンド蛍光強度を計算します。
   6. N 式を使用して各イメージのワームからのバック グラウンド蛍光を引く G = (A B x)、N が純蛍光、総蛍光 G、合計ワーム領域の A と B の平均背景の蛍光性の略します。
   7. ワームのサイズによって蛍光強度を正規化するには、その総面積による各ワームの純蛍光を分割します。結果は、ピクセルあたり任意の単位 (a.u.) での蛍光強度として報告されます。
      メモ: は、JPEG 形式で画像をエクスポートしないでください。圧縮はファイルを格納するより管理しやすい間、この形式でデータの整合性が損なわれます。すべての画像を変更するか、同じ分析とを確認します。異なる倍率でサイズを正しく評価するスケール バーを含めるようにしてください。ImageJ を用いた蛍光強度の違いをよりよく視覚化するには、8 ビット RGB から画像の種類を切り替え、イメージ ルックアップ テーブル (LUT) メニューから火を選択します。これは高められた蛍光強度と相関する輝度色が増加熱マップ イメージを作成します。

2. オイル赤 O 染色 (オロ) 脂質

1. オロ ストック溶液の調製
   1. 250 mL のボトルに 100 mL 100% イソプロパノールにオロ パウダー 500 mg を追加、よく混ぜてね。
   2. 準備が整うと、光の露出無しで密閉ソリューションを格納します。
2. オロ作業溶液の調製
   1. オロ 60% イソプロパノール (3:2) 水で原液を希釈します。
   2. 使用前に 0.2 μ m 酢酸セルロースの滅菌注射器フィルターを通して作業オロ ソリューションをフィルターします。
      注: 最高のソリューションの品質を前日作業オロ ソリューションを準備、一晩を混在させること。ただし、ソリューションが必要な同じ日の場合希釈し、使用前に少なくとも 2 時間ロッカーにオロ ソリューションをミックスします。ロッキング、前にオロ液漏れを避けるためにパラフィン テープで円錐管をラップします。
3. オロ脂質染色のワームの準備
   1. 線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50 E. 大腸菌望ましいライフ ステージとシードに 20 ° C でワームを成長します。
   2. プレートに PBST 溶液 1 mL を追加し、すべてのワームがプレートをオフになるまで旋回します。プレートを傾けるし、pbst; 1 mL で洗います。ワームの懸濁液を 1.5 mL および microfuge の管に転送します。
   3. 遠心 560 x gで 1 分間にワームは、ペレットと洗浄ステップ pbst; 1 mL で 3 回繰り返しを乱すことがなく上澄みを除去します。すべての培養上清が 100 μ L を削除します。
   4. ワーム ペレットに 40% イソプロパノールの 600 μ L を追加し、3 分間室温でロックします。
   5. ワームの餌を中断させることがなく 30 s と削除すべて培養上清中のgが 100 μ L x 560 でワームを遠心します。
      注: は、高スループットの染色を行う場合、プレートをワームを洗浄するのに PBST の高いボリュームを使用します。ワーム pbst; サンプル固定する前に 15 分以上は洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を行います。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。
4. 脂質染色オロ
   1. 600 μ L オロ作業ソリューションを各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、オロにもワームをミックスします。
   2. 室温で 2 時間 30 rpm でサンプルを回転させます。
   3. 1分間 560 x gでサンプルを遠心し、すべて上澄みが 100 μ L を排除します。
   4. Pbst; 600 μ L のサンプルを再懸濁します、余分なオロ染色を削除する 30 分間 30 rpm でチューブを回転させます。
   5. 560 × gで 1 分でサンプルを遠心し、上清を 50 μ l 添加以外のすべてを排除します。
   6. 動物の生殖細胞や消化管細胞の場所を区別しやすく、1 μ L を追加することによって核を染色 (2-(4-amidinophenyl)-1 H-インドール-6-carboxamidine) (DAPI) オロ実用的なソリューションのすべて 1 ml。オロ染色 DAPI をイメージング用のスライドをマウントする前に追加すると 2 h を行います。腸の核は、サイズが大きいと、生殖腺は発展途上の生殖細胞によって区別されます。
      注: オロ染色後、ワームがおよび microfuge の管の側面に付着、失敗は顕著なペレットを形成します。この場合、もう一度ワームを遠心分離機または少なくとも 10 分のために重力によって解決するワームを許可します。
5. イメージングのワームのためのスライドの準備
   1. 残りの上清でワームを再懸濁します、ソリューションをよく混ぜます。
   2. 顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を入れて、気泡ではフォームないの確保、慎重に観察を配置します。
   3. マニキュアとイメージ ワーム coverslip をシールします。
      注: 固定と染色の後ワームでき非常に堅いピペットにくい。これを回避するには、先端を切り落とすことによりワイドボア ピペットを確認します。
   4. 染色後すぐにではなく、イメージング スライド 24 h まで 4 ° C でマイクロ遠心分離機ラックに格納します。
6. オロ ステンド ワームのイメージング
   1. 画像オロ ステンド ワームにカラー対応のカメラを使用します。
   2. 5 倍の倍率を使用して、1 つのビューのフィールドのいくつかのワームをイメージします。
   3. 個々 のワームのより良い検査のため 10 倍の倍率に切り替えます。
   4. 圧縮によるデータの損失を避けるために TIF 形式の画像をエクスポートします。
      注: オロ + DAPI 染色する場合は、蛍光を捉えることができますいずれかにカラー対応のカメラを切り替えます。
7. オロ ステンド ワームの画像解析
   1. ImageJ micrograph(s) にアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。
   2. スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。
   3. 脂質小滴の可視性を改善するために同じプルダウン メニューの下の明るさ/コントラストを調整します。
   4. 動物の体全体または特定の組織での脂質蓄積によると画像を分類します。
   5. 脂質の局在化のより良い評価と ImageJ を用いた非固有のイメージ アイテムの識別のため、画像のプルダウン メニューの下色関数を選択し、RGB 各成分の信号を RGB にスタックをクリックします。

SKN 1 は bZip 胃酸転写因子 NRF2 の哺乳類と相同を共有して脂肪酸酸化を仲介することが示されています。彼らの食事療法のグルコース濃度に応じて恒常活性skn 1の対立遺伝子を持つワームはナイルの赤⁷と異なる脂質レベルを表示します。図 1A-C活性skn 1動物脂質レベルを上げることにつながる条件にさらされているを示しています。腸に沿って顕著な FITC/GFP チャネルを使用してキャプチャした NR 蛍光が頭、尾、そして消化管内腔に調光器脂質レベル増加に伴い、NR ステンド離散的な粒子が低い露光時間が余儀なくされるかもしれませんより、検知しにくいです。このメソッドは、脂質蓄積の定量的プロキシとして蛍光強度を使用するがそれは脂肪質の店ではない細胞の構造の非特異的染色を区別する適切な腸管自動から混信しやすい蛍光。したがって、代替ラベルおよび非ラベル メソッド使わなければなりません並列に¹⁰の動物の中性脂質を明確に定量化します。

年齢依存した体細胞枯渇の脂肪 (Asdf) は動物の表示という高齢者のワームは、表現型胚細胞脂質のまま変わらず⁶体細胞脂質を減少しました。オイル赤 O 染色は、確実に脂質レベルを定量化が脂質の局在化の可視化に最適です、ワームで空自のような脂肪の枯渇の表現型を決定するために役立ちますが方法ではありません。それは空自の有無によるとワームを分類する簡単ですが、それは中間の脂肪質の損失 (図 2 a) で動物を識別するために難しいかもしれません。いくつかの半透明領域 (図 2 b) と体全体を汚す明るい赤を表わす非空自動物と比較して空自ワームは腸細胞 (図 2) の顕著な脂肪の枯渇を展示します。空自 (図 2 D) をしばしば開発の過程で動物は、ほとんど脂肪の損失が最終的に発生する半透明のスポットを表示します。また、空自のワームは完全な体脂肪の損失ではなく非高齢者 (非空自) 動物に対する広範な脂肪の枯渇、表現型が定義されていないために、頭と尾の領域に明るいとして赤い染色はまだ機能があります。オイル赤 O 染色の使用したがって、脂質局在の定性定量とワームの脂肪沈着を大幅に変更する表現型を識別できます。

図 1: ナイルの赤によって脂質染色ナイルの赤の染色skn 1変異蓄積脂質量の増加 (A ~ C) を引き出す条件下でアクティブになります。関数skn 1株益 (lax188)恒常活性 SKN 1 をレンダリングする E237K のアミノ酸置換を宿します。L4 段ワームは、0、15、30 J/m² NR 染色・ イメージングの前にシードされていない NGM プレート 12 h 回復期間に続いて紫外線にさらされました。示されている画像は、表現型の代表です。脂質定量は、前述のセクション 1.7 で行った。火は、ImageJ ルックアップ テーブル (LUT) 蛍光画像の輝度の差を示しています熱画像を作成するために使用します。マージは、FITC/GFP と DIC イメージの組み合わせを示しています。各イメージの蛍光強度の定量化は、画像モンタージュの下部に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 染色による脂質オイル赤 o.オイル赤 O 染色skn 1突然変異体 (lax188) 航空自衛隊表現型 (A ~ D) の有無を示すアクティブになります。A & D ショー動物空自の中間の表現型と。B & C は、反対のオロ染色を表示します。B は非空自が、C は、生殖細胞脂肪の蓄積は、空自の表現型を定義の増加と実質的な体脂肪の枯渇と表示されます。ワームは 144 をイメージング続くオロ染まった hafter L1 同期動物 OP50 細菌とシード NGM メディア上に配置されました。示されている画像は、空自の表現の有無、動物の代表です。はめ込み式の漫画がリンらから変更します。⁶ (B) (C) の有無体脂肪減少を表す。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

肥満および代謝性疾患の率の上昇は、細胞や組織の脂肪蓄積を調節する機構を研究対象に適したモデルを線虫になります。最近の証拠は、脂質レベルの変化がインスリン シグナル⁸、ホルモン受容体²、生殖出力⁵への活性化に至る細胞プロセスに関連付けられることを示唆しています。ラベル無料顕微鏡とクロマト グラフ法、ナイルの赤と油に比べて赤 O は、一貫して中性脂質はワームを染色する比較的安価な染料と再現性をもって^10,12,13。最初は、2 番目の下皮、腸、生殖細胞など組織のなかの脂質分布の評価を容易にしながら総脂質レベルの定量化のためことができます。組み合わせて使用するとき、黄金の NR は研究者が遺伝子型と環境の変化が脂質蓄積に与える影響し、ワームのどこにこれらの変更が発生して判断するを有効にします。

これらの染料は、それにもかかわらず、していない直接ため脂質蓄積同じ非侵襲的な方法で、車顕微鏡¹²。したがって、彼らは固定中にエラーになりやすいです、染色、測定精度¹³を妥協する可能性があります。さらに、これらの染料が誤って対話するリポフスチンと腸内顆粒、^10、14を格納蛍光細胞内の中性脂肪とは無関係に生じる。また、NR とオロの脂質レベルが低く、表示される場合染色を区別できない結果、透磁率の問題からの結果または脂肪の蓄積を低減します。また、光にこれらの汚れの感度は、劣化と漂白の写真、保管およびアクティブな操作制限の中に特別措置を必要です。しかし、もし実行してラベルに基づく試金、NR から結論を描画するときに注意が、オロ染色脂質代謝経路を調査し、他の生体との相互作用を調べる前方遺伝スクリーンの優れた手段関数。それぞれ増加と減少の脂質蓄積の相対的な比較を行うためdaf 2 脂肪 6ワームの使用お勧めします。洗濯物を取り込んで、NR とオロ手順を遠ざけているか染色と同様。したがって、両方が同じ日に実行できます。ただし、6 h 後一貫して NR 染色ですので後で画像のオロ ステンド ワームのスライドのみを格納できます。洗濯中にトリトン 100 X NR、オロ、透磁率を高めるだけでなく、容器への過度の執着によるワームの損失を避けるためにも含めることが重要です。さらに、ワームは、各汚れに最大透磁率を確保するために汚れる前に 30 分未満を洗浄する必要があります。NR とオロのインキュベーション時間は 1 時間 30 分にそれぞれ低下ことがあります中より一貫性のある染色と結果の画像は、この記事で提案した時間に従うことお勧めします。光とオロ ソリューション使用する背景の蛍光イメージングが増加する前にフィルターを適用する失敗する NR のソリューションの長期暴露。これらのプロトコルを汚す実施イメージング時間に加えて 3 4 h が必要です。汚れインキュベーション提供ステップ間一時停止のせいぜい 2 h しますが、強くお勧めするプロトコルとして実施しているいくつかの中断と脂質定量のすべて染料ベース メソッドにつきもののエラーの多くの情報源を削減することが可能と検査。

著者は利益相反を宣言しません。

この作品は NIH グラントによって可能になった: R01GM109028 (S.P.C.)