Микро рассечение эмаль органа от нижней челюсти резцы крыс воздействию экологических токсикантов

Понимание формирования и возможных изменений эмали требует изучения ameloblast деятельности. Здесь мы описываем надежного и последовательного метода микро-вскрыть эмаль органов, содержащие ameloblasts стадии секреции и созревания, которые могут быть использованы для дальнейших количественных и качественных экспериментальных процедур.

Дефекты эмали, вытекающие из условий окружающей среды и образа жизни являются проблемы общественного здравоохранения из-за их высокой распространенности. Эти дефекты в результате измененный активность клеток, ответственных за эмаль синтеза, названный ameloblasts, который присутствует в эмаль органа. Во время Амелогенез ameloblasts следовать конкретные и точные последовательности событий распространения, дифференциация и смерти. Крыса, постоянно растущих резцов является подходящей Экспериментальная модель для изучения ameloblast активности и дифференциации этапов в физиологических и патологических условиях. Здесь мы описываем надежного и последовательного метода микро-вскрыть эмаль орган крыс воздействию экологических токсикантов. Микро расчлененный Стоматологическая эпителия содержат секрецию и созревания этап ameloblasts, который может использоваться для качественной экспериментов, например иммуногистохимия анализов и в situ гибридизация, а также для количественного анализа, такие как RT-ПЦР РНК seq и Западный blotting.

Многие дефекты развития эмали может быть результатом воздействия экологических токсикантов и/или ненадлежащее life-style^1,2,3,4. Характеристика срыва мероприятий и молекулы Амелогенез используя настоящее время описанная процедура будет содействовать использованию результирующей дефектов эмали как ранних маркеров воздействия ряда токсикантов и может помочь восстановить историю здоровья Каждый пациент в перинатальный период, когда эмаль синтезированный^1,2. Синтез эмаль можно разделить на четыре основных этапа в зависимости от ameloblast деятельности⁵. Первый шаг объединяет клеток и pre-ameloblast распространения прекурсоров. На втором шаге дифференцированных ameloblasts выделяют эмаль матрицы белки (ИПК), главным образом amelogenin, enamelin и ameloblastin, которые определяют толщину окончательного эмали. Таким образом любое нарушение синтеза EMP приводит к количественным дефекты эмали. После осаждения Толщина полной эмали начинается этап созревания. На этом этапе апатита роста кристаллитов в ширины и толщины позволяет эмали для достижения высокой минерализации соотношение в биологической ткани, до 96% по весу. Нарушая события, которые происходят во время созревания этап приведет к качественным эмаль дефектов. Наконец ameloblasts вступит в фазу после созревания, также называется пигментации на грызунов и проходят apoptosis во время извержения зуба, делая дефектов эмали (если таковые имеются), необратимого и непоправимого, таким образом дефекты обеспечивают потенциальным ретроспективный запись ameloblast подчеркивает. Грызунов Амелогенез следующим же последовательность событий с особенностью, что их резцов непрерывно растет, что делает их подходящую модель для изучения общего процесса Амелогенез. Таким образом любое нарушение Амелогенез приводит изменений эмали качество или количество, в зависимости от окна времени нарушения события. В этом смысле воздействием диоксинов, свинец и эндокринные нарушения химических веществ (ЭЭС) как бисфенол А (BPA), генистеин и винклозолин, было показано, чтобы генерировать эмаль hypomineralizations^{1,2,3 ,6,,78}. Асимметричная белый непрозрачный пятна были определены на резцы у крыс, получавших дозу BPA низкой дозы во время периода плода и в первый месяц после рождения¹. Эти дефекты эмали у крыс и те из человека Молярная резца hypomineralization (MIH), имеют аналогичные структурные, клинические и биохимические характеристики. MIH-патология недавно описан зубной эмали, для которой этиологии по-прежнему остается неясным^9,10 несмотря на множество причинных факторов была гипотеза^{9,10,11 ,12}.

Еще один важный эмаль hypomineralization патологии из-за экологических факторов является флюороз (DF), который является следствием чрезмерного фторид поглощения (> 0,1 мг/кг/день)^13,14. Основным источником Фтор является питьевая вода, которая дополняет или естественно обогащенного фторидами. Фторид также часто прописывают для предотвращения кариеса, но профилактическая доза составляет лишь 50% ниже, чем токсичные один (≤0.05 мг/кг/день). МИ и DF, два частые патологий, в результате воздействия факторов окружающей среды, могут представлять общие черты, которые должны квалифицироваться в результате потенцирования эффектов hypomineralizing фтора в сочетании с другими токсикантов например ЭЭС² или амоксициллин¹⁵.

Микро рассечение крыса эмаль органа, содержащие ameloblasts на дифференциации различных стадиях поможет понять механизм действия молекул может нарушить деятельность ameloblast и вызвать дефекты эмали для постановки диагноза после извержения зуба. Иными словами характеристика изменения состава эмали ген выражение и эмаль матрицы из-за экологических токсикантов позволяет воссоздание истории воздействием токсикантов и облегчает мониторинг экологической безопасности для общественности здоровья.

Все животные, используемые в настоящем исследовании были сохранены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных от французского министерства сельского хозяйства (A-75-06-12).

1. животных воздействием токсикантов

1. Перед выполнением этого протокола, получить необходимые институциональные одобрение и обязательно соблюдать все правила ухода за животными.
2. Применить дизайн исследовательский протокол, позволяющий Конституции различных экспериментальных групп для того, чтобы проверить влияние molecule(s) на ameloblast секреции стадии и стадии созревания ameloblast. Здесь в зависимости от их воздействия фторид (NaF) в сочетании или не с BPA (рис. 1A)²были созданы четыре группы самцов крыс Wistar. Все животные были наблюдается и расчленены на день 65 (рис. 1B).

2. рассечение Hemi мандибулы от взрослых крыс

1. Усыпить крыс CO₂ удушение, при необходимости сопровождаемое обезглавливание в отдельном голову от остальной части тела. Разоблачить крысы CO₂ для 5 минут в Специальный ящик¹⁶.
2. Удалите все кожу от нижней губы, с помощью скальпеля #11 для того, чтобы получить легкий доступ к нижних резцов.
3. С же скальпель надрезают между двух нижних резцов с небольшим давлением и нижней челюсти будет разделен на две половинки.
4. Височной нижнечелюстной совместное с помощью скальпеля для отсоединения челюсти, удержания и отрезания пленки hemi челюсти с помощью пинцета, штраф.
5. Вырезать окружающих мягких тканей с помощью скальпеля и удалить все мышцы, сухожилия и связки, скребком, до тех пор, пока кости совершенно чистой.

3. изоляция резца^17,18

1. Тщательно сбрить кости, поместив лезвия параллельно основной продольной оси резца. Начало в костлявые хребта возле советы резца (проксимальный конец) до конца резца возле шейки матки цикла. Разрез движения исходит из проксимальных в дистальном направлении.
2. Сделать первый разрез дистально в шейки матки цикл с скальпеля для удаления gonion hemi челюсти и разрешение на взлет резца легко без повреждения шейки матки цикла или стадии секреторного ameloblasts (красная линия на рис. 2).
3. Сделать второй сократить ниже второй молярной и вставьте скальпель между костью и медиальной поверхности резцов. Когда поднимается базальная кость, поверните наружу резца и снять его тщательно избегать эмаль ткани органов ослабить с помощью тонкой пинцета.

4. микро рассечение эмаль органа под объектив бинокля

1. Падение 200 мкл физиологическим фосфатного буфера (PBS 1 X) на резец, с помощью пипетки. Возьмите резца с тонкой пинцет с лабиальной поверхности, обращенной вверх. Сделайте скальпель Марк между бесцветные и оранжевый частями ткани. Этот знак соответствует базовой белое пятно, который наблюдается после (рис. 2).
2. Царапина, экскаватор или эквивалентные средства, клеточной поверхности от Марк скальпель в верхушечный конец соответствующий секрецию ameloblasts этап (бесцветный) и от Марк скальпель на кончик резца для созревания этап (оранжевый) ameloblasts.
3. Удаление ткани 2-мм соответствует переходной стадии, как ранее описанных¹⁹. Не открывайте резца во время эмаль орган рассечение избежать загрязнения, мезенхимы.
4. Вырежьте шейки матки цикла, расположенный сразу в апикальной части резца (рис. 2) как описано выше²⁰.
5. Соберите его в 10% растворе формалина или лизиса для дальнейшего расследования (см. Таблицу материалы).

5. коллекция тканей органа разлученных эмаль для дальнейшего расследования

1. Капля 200 мкл буфера PBS 1 X на резца.
2. С лезвием скальпеля #11 Аккуратно отсоедините Стоматологическая эпителиальные клетки постепенно в буфере, отдельно, для каждого этапа с помощью скальпеля марки, сделанные ранее.
3. Для ячейки РНК и белков извлечений Положите ткани в лизис решение, которое позволяет извлечения белков и РНК (см. Таблицу материалы).
   Примечание: Подготовьте высокого качества РНК, повернув ткани экскаватор в трубе и затем измельчения клетки до получения однородной смеси. Смесь готова к РНК и белков извлечений согласно процедуре производителя, который был ранее описанных^2,8,17. Обычно, около 5-10 мкг всего 150 мкг всего белков и РНК были получены для каждого приготовления.
4. Для гистологического анализа иммуногистохимия (IHC) и в situ гибридизация (ISH), наносят слой клеток в формалина 10% за 2 ч, затем хранить при 4 ° C в PBS 1 X. Ткани затем можно внедрить в воск/парафин или ткани OCT для замороженных секций.
5. Для извлечения EMP принимайте резца с тонкой пинцетом. После короткого воздействия воздуха (небольшое обезвоживание) белое пятно будет отображаться вокруг средней части лабиальной поверхности резцов, который представляет начало минерализации эмали. Это белое пятно соответствует переход- / раннего созревания этап ameloblasts, так что используйте его как индикатор для извлечения EMPs²¹.

Многие эмаль дефекты, такие как флюороз^12,13, могут в результате экологических условий вследствие чрезмерного фторид поглощения или эмали похож на MIH вследствие воздействия на некоторые ЭЭС^1, hypomineralization ^7,22. Эти дефекты развития эмали может быть экспериментально воспроизведена на крысах (рис. 1)^1,2,7,23,24. Крыса hemi челюсти содержит один резца, отделены от трех моляров на разрыв под названием диастема. Непрерывно растущие резца содержит две минерализованных ткани, дентина, производимые odontoblasts и эмали, производимые ameloblasts в орган эмали с другими эпителиальных клеток (рис. 2). Грызун резца, как представляется, быть подходящей моделью для изучения Амелогенез как, вопреки моляров, он содержит все этапы распространения/дифференциация ameloblast на протяжении всей жизни животного.

Микро расчлененный эмаль орган от резцов крысы могут быть разделены согласно ameloblast дифференциация стадии с помощью белое пятно, которое появляется после небольшое обезвоживание, и это может быть использовано как показатель переходного этапа между секреция - и созревания этапы^19,21,25. Качество микро расчлененный эмали, которую тканей могут быть проверены Trichrome Masson окрашивание (рис. 3A). Микроскопические наблюдения показали типичные эмаль эпителиальных клеток и ameloblast частокол. Отсутствие мезенхимальных загрязнения было подтверждено отсутствие коллагена зеленой окраски (Рисунок 3А) и выражения (рис. 3B). Эти микро расчлененный ткани может использоваться для qualitative analyses как ИХС (рис. 3 c) и ISH и количественного анализа как RT-ПЦР (рис. 3B), РНК seq и Западный blotting. К примеру, андрогена был специально локализуется в ameloblasts стадии созревания, с помощью специфического антитела, направленные против этого белка (см. Таблицу материалы) (рис. 3 c)⁸. Основные ameloblast дифференциация этапов характеризуются конкретный ген выражение модели²⁶ , могут быть определены на микро расчлененный эмаль орган. К примеру, секреция этап ameloblasts Экспресс enamelin² и созревания этап ameloblasts express калликреин 4 (KLK4) (рис. 3B). Они содержат высокие уровни ферритина, которые дают возможность хранить большое количество железа, которое отвечает за оранжевый цвет эмали²⁷.

Фторид нарушение Амелогенез легко может сопровождаться наблюдения lysates клетки для экстракции РНК: управления стадии созревания лизатов были оранжевый, тогда как фтор лечить те свет желтого до бесцветные (рис. 4A). Анализ уровня РНК, извлеченные из микро расчлененный стадии созревания эмали орган показал KLK4 вниз регулирование после лечения фтора (рис. 4B), который также свидетельствует анализ крупномасштабных транскриптомики недавно сообщила². Специфические белки, выраженному либо путем секреции - или созревания стадии ameloblasts также могут быть локализованы с помощью микро расчлененный эмаль орган²⁸. Например андрогена был специально локализации с помощью микро расчлененный эмаль орган^8,28.

Рисунок 1: эмаль дефектов, наблюдается на крыс фторид (NaF) в сочетании или не с бисфенол А (BPA). (A) схематическое представление четырех экспериментальных групп крыс Вистара, являются для целей настоящего исследования, группы, которые зависят от различных экологических условий, применяемых к крысам. От гестационный день 1 (fecondation) до отъема дня 21 (P21) 5 мкг/кг BPA в 0,5 мл кукурузного масла было перорально путем затравки ежедневно для беременных и кормящих женщин, тогда как кукурузное масло один вводили к группе элементов управления. После отнятия от груди, каждой плотины было выявлены и случайным образом распределены в одном из соответствующих двух групп. Самцов крыс были отобраны для этого исследования и подвергается 5 мкг/кг/день BPA только 5 мм NaF только, или в той же дозе до 65 дней после рождения (P65). Контрольной группе было дано только растворителем. (B) в послеродовом день 30 (P30), крыс хронически низких доз BPA выставлены белый непрозрачный пятен и для взрослых крыс (P65) было выявлено больше не очевидным Стоматологическая фенотип. Чередуя белый и оранжевый полос типичных флюороз (DF) наблюдались у крыс, получавших NaF. В крыс обоих агентов было выявлено более тяжелых фенотип характеризуется важным резца обесцвечивания. Однородной оранжевого инцизального эмаль квалифицируется управления крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Схематическое представление процедуры. Изоляция ameloblasts от секреции - и созревания этапов от микро расчлененный эмаль орган. Крыса hemi челюсти содержит три моляров и постоянно растущей резца с двумя минерализованными тканей, дентин, производимые odontoblasts (в желтый) и эмали, производимые ameloblasts (в оранжевый). Когда резца изолирована и слегка обезвоженная, белое пятно в апикальной части лабиальной поверхности является наблюдаемый объект. Это помогает идентифицировать ameloblast стадии дифференцировки, как она охватывает переходный этап между секрецию и созревания этапов. Эмаль орган тщательно микро расчлененный, разлученных в 3 частях, в зависимости от стадии дифференцировки ameloblast и используется для качественного анализа (гистологический) или количественных экспериментальных подходов (мРНК и белковый анализ по RT-ПЦР и Западный blotting, соответственно).

Рисунок 3: контроль качества микро расчлененный секреция - и созревания стадий эмаль органа. Крыса эмаль орган разделена на 3 части, содержащие шейки матки цикла, секреция этап ameloblasts и ameloblasts стадии созревания. (A) Trichrome Masson пятнать микро расчлененный частей показал различных эпителиальных клеток и отсутствие мезенхимальных клеток. Шкалы, 100 мкм. (B) анализ выражения гена экспериментами RT-ПЦР РНК, извлеченные из стадии секреции и созревания эмали орган. Типичная схема enamelin и KLK4 выражение было отмечено, а также отсутствие коллагена 1 ожидается в мезенхимальных клеток. (C) люминесцентная, окрашивание используется антитела (см. Таблицу материалы) специально направлены против андрогена, только выраженные стадии созревания ameloblasts. Шкалы, 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: представитель результаты, полученные с микро расчлененный крыса эмаль орган. (A) при клетки были высокомобильна литического буфера для извлечения РНК (см. Таблицу материалы), стадии созревания тканей, содержащих пигментированной ameloblasts появился оранжевый в условиях лечить контроля и анализатором соответствия рекомендациям. Секреция этап часть желтого независимо от условий. В лечении NaF, все лизатов были свет желтого до бесцветные. (B) пример RT-ПЦР данных, полученных с РНК препаратов из эмали органов крыс, представленные в различных условиях окружающей среды. NaF вниз регулируется KLK4 в стадии созревания, и BPA увеличилось enamelin выражение в стадии секреции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Изменены ameloblast деятельности и/или нарушается ameloblast распространения, дифференцировки и созревания процессы привести к необратимым эмаль дефекты и, в свою очередь, характеристика дефектов эмали может помочь развить понимание изменены ameloblast деятельность во время Амелогенез. Таким образом исследования на изолированные эмалью органа являются определяющим для выяснения патологические события, приведшие к эмали дефекты независимо от их происхождения, экологические или генетические.

Эта техника первоначально был описан Хиллер и др. ¹⁷ и Робинсон и др. ¹⁸и используется для демонстрации специфические эффекты на каждой стадии дифференцировки орган эмали. Он тогда был адаптирован для EMP извлечений^19,24,25. Мы в настоящее время эта процедура позволяет отделить основные части органа эмаль и сбор биологических образцов в различных экологических условиях для анализа РНК и белков (возможно внутри и загородный cellular белки) с использованием количественных и качественных методы.

Точность микро рассечение требует существенной подготовки перед его применением, чтобы позволить коллекции сохранились эмаль органа и избежать мезенхимальных загрязнение и разрушение любых тканей. Кроме того весьма трудно добиться успеха с малых крыс или мышей. Действительно сложная часть процедуры является сохранение морфологии тканей, гистология и ориентации в МГС и ISH, в отличие от классических методов, обычно проводится на резцы для этих двух подходов.

Одно из главных преимуществ использования микро расчлененный эмаль орган по сравнению с деминерализованной весь hemi-нижней челюсти является поддержание эмали РНК и белков, благодаря отсутствие любой коллекции после лечения. Микро расчлененный эмаль орган непосредственно может использоваться для всех методов молекулярной биологии и биохимии без выбора или культивирование клеток. Преимущество этой процедуры является прямых измерений уровня РНК и белка, которые отражает их количества в конкретных ameloblasts в естественных условиях в физиологических и патологических условиях. Кроме того некоторых токсикантов выступать на сцене один дифференциация специально, как в случае с фтором, который действует на стадии созревания ameloblasts и не на секрецию этап те^23,24. Микро рассечение различных регионов эмаль органа позволяет изучение механизма действия некоторых токсикантов или конкретные гены, последствия которого могут быть обнаружить на весь эмаль орган или на отдельные клетки. Действительно ameloblasts, особенно дифференцированы, те, которые трудно собрать и культуры в пробирке, который подтверждается отсутствие исследований, сообщил по этому вопросу. Pre-ameloblasts и стволовые клетки шейки матки петли²⁰только Стоматологическая эпителиальные клетки, которые могут быть изолированы. Кроме того, сообщил ameloblastic клеточных линий, главным образом крыса ХЕТ-7²⁹, мыши LS8³⁰, ALC³¹и человека AM-1³², часто теряют характеристик дифференциация в vivo ameloblasts: они выражают внеклеточная матрица белки (ИПК), например ameloblastin подобно к ameloblasts секреция стадии и также KLK4 или SLC26A4/pendrin, таких как стадии созревания ameloblasts⁸, но более или менее не в состоянии выразить amelogenin и минерализации матрицы для производства эмали. Изоляции Стоматологическая стволовых клеток эпителия и эмбриональных ameloblasts может представлять собой возможность для изучения первых этапов дифференцировки ameloblast, но исследования в процессе минерализации терминала эмаль не может осуществляться по-разному чем с в естественных условиях модели. Эта последняя часть Амелогенез является определяющим фактором качества эмали. В то время как ключевые факторы, связанные с зуба развития, например Bmp, Msx, ФБП, паз, Тсс, Wnt хорошо описана^33,34, плотно вовлеченных в эмаль качества все еще плохо поняты. Характеристика ключевых факторов качества эмали необходимо расшифровать зубного кариеса и обнаружить инновационных восстановительных или предупредительных лечение кариеса, которые представляют собой проблему общественного здравоохранения как 92% от 20 до 64 лет старых взрослых в мире имеют или имели по крайней мере один кариеса^35,,3637.

Грызуны, воздействию экологических токсикантов способны нарушить Амелогенез и изменению качества эмали могут являться хорошей моделью для исследования экологических факторов. Аналогичные процедуры могут также использоваться для функциональных исследований на гены интереса, прямо или косвенно участвующих в Амелогенез. Микро расчлененный эмаль органом является подходящим материалом для характеристики механизмов действия токсикантов и их целевых генов в vivo избегая любой экспериментальной предвзятости. Когда будет характеризоваться дефекты развития эмали, такой подход может использоваться как модель прогнозирования потенциального патологического воздействия новых загрязнителей.

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Эта работа финансировалась университета Париж-Diderot, французский Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM) и французский институт одонтологического характера исследований (ИФРО).