Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела

Мы описываем метод измерения активации Fc опосредованной эффекторных функций антителами, предназначенных гемагглютинина вируса гриппа. Этот assay также может быть адаптирована для оценки способности моноклональных антител или поликлональных сыворотки против других вирусных поверхностных гликопротеинов побудить Fc опосредованный иммунитет.

Антитела играют решающую роль в муфты врожденного и адаптивного иммунного ответа против вирусных патогенов через их антиген связывания доменов и Fc регионы. Здесь мы опишем, как измерить активации ФК эффекторных функций моноклональные антитела против гемагглютинина вируса гриппа с использованием генетически Jurkat клеточной линии, выразив активации типа 1 Fc-с помощью этого метода, FcγR. вклад специфических взаимодействий Fc-FcγR, предоставленных иммуноглобулины могут быть определены с помощью assay в пробирке .

Иммунитет, предоставляемый вакцины против сезонного гриппа традиционно были оценены гемагглютинации ингибирование (HI) пробирного¹, который измеряет наличие антител, которые целевой сайт связывания рецептора гемагглютинина. Эти Привет активные антитела могут наделять стерилизации иммунитет, но обычно узкие в их масштабы защиты, предоставляя иммунитет к только выбрать несколько штаммов вируса гриппа. Выделение и характеристика широко реактивной моноклональных антител, которые признают гемагглютинина (HA) предлагаю развития универсальной вакцины от гриппа в пределах досягаемости^{2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8}. одной из основных целей универсальной вакцины от гриппа является сильным антител ответ к сохраняемой регионах гриппа вирус^{9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16}. широко реактивной антитела, которые признают эти сохранены epitopes, состоящий из нейтрализовать и не нейтрализуя антитела^17,18было показано требуют взаимодействия Fc-FcγR для оптимального защита в естественных условиях и выделить вклад Fc опосредованный иммунитет на общий иммунный ответ на гриппа вирус^19,20.

Коррелляты защиты играют решающую роль в оценке иммунитет к инфекции. Эти метрики позволяют ученых и клиницистов, для оценки эффективности вакцин, значение данных и курс лечения. Только установленные коррелятом защиты от инфекции вируса гриппа является пробирного торможение гемагглютинации. Титр 1:40 ассоциируется со снижением риска болезни^1,21 – 50% и отражает наличие антител, которые препятствуют склеиванию путем привязки сайта, расположенный на шаровых голову HA рецептора. Однако следует также отметить, что Т-клеток ответов может быть лучше коррелируют защиты от инфекции вируса гриппа в пожилом возрасте. Интересно, что недавний доклад свидетельствует о том, что нейраминидазы ингибирование активности может быть лучше предсказатель иммунитета к гриппа²². К счастью типичных в vitro assays такие, как нейтрализация или нейраминидазы ингибирование анализов можно измерить ха стебель или нейраминидазы специфических антител. Однако, большинство этих обычных в vitro анализов, только принимать во внимание функции регионе связывания антигена антитела и не измерить роль региона Fc. Кроме того вклад-нейтрализующих антител, которые защитить через Fc рецептор участия в естественных условиях , не обнаруженных^17,18. Для того чтобы измерить защиты, обеспечиваемой антител, которые индуцируют Fc опосредованный иммунитет как зависимые ячейки при посредничестве цитотоксичности антител (ADCC), необходим надежный в vitro пробирного.

Описанный ниже метод оценивает способность мышиных моноклональных антител побудить Fc опосредованной функций с использованием генетически модифицированных линия клетки Jurkat, выразив активации мышиных типа 1 FcR, FcγRIV. Антитело участие FcγR передает, внутриклеточная сигнализация ядерный фактор что триггеры активированные Т-клетки опосредованной Люцифераза деятельности. Assay имеет ряд преимуществ над традиционными методами, которые требуют изоляции и культуры основных эффекторных клеток и использования проточной цитометрии для выявления активации Fc опосредованной эффекторных функций^{19,23,24 25, ,26}. Во-первых протокол, описанные здесь может быть легко адаптирована для включения различных вирусных цели, FcγRs и антитела от разных видов (человека и мышиных). Во-вторых использование модифицированных клеток Jurkat линия, выражая, FcγR с Люцифераза Репортер ген под ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) позволяет для assay большого формата, который может быть легко проанализирован с помощью пластины читатель измерения люминесценции. Здесь традиционной активации основного эффекторных клеток заменяется индукции NFAT-Люцифераза на антитела участие FcγR на поверхности клетки Jurkat. Этот assay формат 96-луночных пластина позволяет для измерения до четырех различных образцов в triplicates с семи разведения – количество выборок, которые могли бы быть громоздким, с использованием традиционных методов. Есть дополнительные очки рассмотреть этот assay, которые могут повлиять на дизайн экспериментов и интерпретации данных. Вирусная цели должны быть выражены на поверхности клеток, в порядке признания антитела. Чтобы избежать этого, целевой антиген (например внутренних вирусного белка) могут наноситься непосредственно на поверхности плиты. Однако это не еще не протестирована тщательно. Кроме того изменение линии клетки Jurkat выражает только один тип активации FcγR и не выразить любой тормозной FcγRs, в то время как главной ячейки линии Экспресс всех рецепторов в физиологических условиях.

Ранее мы использовали этот assay продемонстрировать что epitope специфики в рамках поликлональных играет решающую роль в регулировании Fc опосредованной эффекторных функций и оптимального активации антител зависимых клеточный ответ требует две точки контакт^2827,. Здесь мы описываем метод, который оценивает способность стебель специфических моноклональных антител и активировать Мурина, активация FcγRIV. Хотя есть исключения^29,30, большое количество широко реактивной антител целевых регионе антигенно сохранены стебель гемагглютинин и таким образом играют важную роль в развитии всеобщего гриппа вакцина.

Эксперименты, предварительно отформованных в этой рукописи были сделаны следующие Icahn школы медицины в институциональных кодекс этики и правил.

1. выражение гемагглютинина вируса гриппа через Transfection или инфекции

Трансфекция:

1. Пластина человеческих эмбриональных почек (ГЭС 293T) клетки на плотности 2 х 10⁴ клетки/хорошо в белой культуры ткани лечение 96-луночных пластины и дайте ему сидеть в течение 4 ч в инкубаторе 37 °C (с 5% CO₂).
2. Transfect клетки с 100 нг ДНК кодирования для вирусных гемагглютинин и 0,2 мкл Реагента трансфекции за Ну в общем объеме 50 мкл.
   Примечание: Оба плазмиды и transfectant реагент разводят в 1 x Opti-минимум основных СМИ (MEM) сокращение сыворотке среднего.
3. После инкубации пластины в инкубатор 37 °C с 5% CO₂ для 18 h, удалите трансфекции СМИ.

2. инфекции

1. Плита A549 или Darby Мадин собак почечных клеток на плотности 2 х 10⁴ клетки/хорошо в белой культуры ткани лечение 96-луночных пластины и расти по крайней мере 18 ч 37 °C инкубатор с 5% CO₂.
2. Разбавить вирус в 1 x MEM и заразить клетки на разносторонности инфекции 3, 1, или 0,33 за 1 ч в инкубаторе 37 °C с 5% CO₂. Общий объем должен быть равен 100 мкл.
   Примечание: 10 x MEM разбавляется с водой, чтобы сделать 1 x MEM рабочей сток для разбавления вирус, упомянутых выше.
3. После заражения, удалите посевным материалом и добавьте 100 мкл 1 x мем в пластину в отсутствие трипсина.
4. Растут инфицированных клеток для 18-24 ч, 37 °C инкубатор с 5% CO₂.

3. Оценка FcRg/NFAT-опосредованной активации деятельности Люцифераза моноклональные антитела или сера

1. Во-первых замените средства роста transfected или зараженных клеток 25 мкл пробирного СМИ (1 x RPMI 1640 с 4% (vol/vol) низкая IgG плода говядину сера).
2. В отдельную тарелку 96-луночных выполняют четырехкратное разведений антител интерес, начиная с 30 мкг/мл, с помощью анализа СМИ. Выполните разведений в triplicates и макетом плита пример иллюстрируется на рисунке 1A. Убедитесь в том включить элемент управления, что исключает антитела (без управления антитела), а также фон управления (только Пробирная буфера).
   Примечание: для обоих «не антитела» и фона элементов управления, добавить 25 мкл аналитического буфера вместо антитела.
3. Передать 25 мкл антител серийно разреженных от шаг 3.2 соответствующие скважин на табличке transfected клеток или инфицированных клеток.
4. Инкубируйте пластины в инкубатор 37 °C (с 5% CO₂) за 15 мин.
5. Добавьте 25 мкл соответствующие модифицированных эффекторных Jurkat ячейки, выражая мышиных FcgRIV или человеческого FcgRIIIa (75000 клеток/хорошо). Общий объем для каждого должно быть 75 мкл и начальный конечная концентрация антител в 10 мкг/мл (рис. 1B).
   Примечание: Для фона элемента управления, добавьте 25 мкл аналитического буфера вместо эффекторных клеток. Для изучения антитела зависимых клеточный фагоцитоза, может использоваться измененные ячейки Jurkat выражением человеческого FcgRIIa.
6. Инкубируйте пластины в 37 ° C инкубатор с 5% CO₂ на 6 ч.
7. Оттепель и теплых Люцифераза субстрата буфер в воды 37 °C около 1 часа перед использованием.
   Примечание: Чтобы сделать буфер субстрата Люцифераза, воссоздания лиофилизированные Люцифераза пробирного субстрат в Пробирной буфер, предоставленный. Восстановленный субстрата буфер может храниться при-30 °C до-10 °C до шести недель.
8. Добавление 75 мкл/хорошо Люцифераза субстрата буфера для всех скважин за исключением фона элемента управления.
9. Читайте на люминометра.
10. Рассчитать индукции сложить с помощью следующего уравнения: Сложите индукции = (индуцированные значение фона значение) / (стоимость фона значение не МАБ).

Мы продемонстрировали, что стебель конкретных МАБ, 6F12, но не голова конкретных конкретного головы МАБ, PY102, смогла активировать первичной естественных клеток-киллеров по upregulating CD107a и интерферона гамма¹⁹. Для моделирования стебель специфические антитела способность активировать первичных человеческих НК-клеток, мы показываем, что стебель конкретных МАБ, 6F12, энергично можно активировать модифицированных клеток Jurkat, выражая мышиных FcγRIV, ~ четырнадцатикратное. С другой стороны руководитель конкретного МАБ, PY102 и управления IgG делать не (рис. 2)²⁸.

Расследовать если кратность инфекции (МВД) может повлиять на индукции Jurkat клеток, выражая мышиных FcγRIV, мы инфицированных клеток MDCK с X31 (реассортантных A вирус гриппа выражая гемагглютинин и нейраминидаза A/Hong Конг/1/68 (H3N2) вирус с внутренним сегментами A/Puerto Рико/8/34 (H1N1)) с MOI 3, 1, или 0,33. Двадцать четыре часа позже, Jurkat клетки, выражая мышиных FcγRIV и МАБ 9H 10 были добавлены к инфицированных клеток MDCK. На рисунке 3мы покажем, что клетки, инфицированные MOI 3 может вызвать люминесценции, примерно в 3 раза выше, чем MDCK клетки, инфицированные с мои 0,33.

Рисунок 1 : Схема образца пластины макета и состав экспериментальных групп. (A) Начальная концентрация для каждого образца, антитела на 10 мкг/мл и серийно разводили через пластину (столбец 1 к колонке 12) 4 раза. Каждый образец делается в triplicates. Строка G резервируется для элемента не МАБ и строка H является фоном. (B) окончательный объем для каждой экспериментальной группы перед добавлением Люцифераза субстрата буфера составляет 75 мкл. Следует отметить образца и «не МАБ группы» имеют 25 мкл эффекторных клеток добавил, в то время как фон элемента управления группы имеют 75 мкл пробирного средств массовой информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Индукция модифицированных Jurkat клеток, выражая FcgR стебель моноклональное антитело. A549 клетки были инфицированы с A/Puerto Рико/8/34 (H1N1) с MOI 3. На 24 часа пост инфекции, мышиных выражая FcγRIV Jurkat, были добавлены ячейки в сочетании с PY102, 6F12 или элемент управления IgG. Индукции Jurkat клеток были оценены сигнал люминесценции Светлячок Люцифераза под элементом ответа NFAT. Планки погрешностей = стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Многообразие инфекции затрагивает индукции стебель специфические антитела. MDCK клетки были инфицированы MOI 3, 1, или 0,33 с X31 (H3N2). В 24 ч пост инфекции, выражая FcgR Jurkat клеток в сочетании с 9H 10 (начального разбавления 10 мкг/мл) Добавлено. Индукции Jurkat клеток были оценены сигнал люминесценции Светлячок Люцифераза под элементом ответа NFAT. Планки погрешностей = стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Метод, описанный здесь позволяет измерить ха специфических моноклональных антител способность привлекать мышиных FcγRIV. Цель антигена, гемагглютинина вируса гриппа, выражается на поверхности клеток после заражения вирусом или трансфекции плазмидной ДНК. Assay далее поддается с использованием различных вирусных белков, поверхность выразил в сочетании с другими FcγRs (людей или Мурина). Кроме того, мы использовали образцы сыворотки для оценки способности в контекст поликлональных антител побудить ФК эффекторных функций (данные не показаны), которые могут обеспечить более актуальной информации при изучении адаптивного иммунного ответа вызванных инфекцией или вакцинации. Дополнительно мы предположить, что assay может быть изменено для измерения индукции антител, которые признают внутренней вирусные белки, непосредственно покрытие пластин с растворимого белка. Однако эта методология не были тщательно протестированы.

Индукция антител зависимых эффекторных функций может влияет несколько факторов, включая но не ограничиваясь эффекторных соотношение целевых (количество клеток эффекторов добавил в колодец), концентрация антител использовано, длина инкубации между Эффектор и целевых клетки и концентрация низкая IgG сыворотки, используемых в assay buffer.

Исторически стандартного анализа для измерения активности антител зависимой клеточной цитотоксичности антител или поликлональных сера включает первичной естественной убийца (НК) клетки заготавливаемым от доноров. Взаимодействие FcγR и активации внутриклеточных пути обычно определяется выражение маркеров активации CD107a и ИФН γ-^19,-^23,-^24,-³¹. Хотя классические assay использует более релевантные эффекторных клеток, поскольку они не были инженерии генетически, доноров вариации аллельные различиями в FcγR могут повлиять на активации клеток NK и привести к вариации партии к партии. Альтернативных анализов, используется в качестве суррогатов для ADCC деятельности включают в себя FcγR на основе димер ELISA или убийство пробирного²⁵выпуска хрома. Несмотря на то, что использование на основе димер ELISA FcγR высокой пропускной способности, проба не может быть физиологически соответствующие, как этот assay не использовать эффекторных клеток³². Хотя меры пробирного релиза хрома прямой убийство, это не высокую пропускную способность и требует первичных НК-клеток, которые снова доноров зависимых³³. Один из последних методов описывают использование мышиных hybridomas Т-клеток, стабильно выражая химерных FcγR-CD3ζ цепи молекулы и меры активации через секреции IL-2. Assay описал аналогично методу описано здесь, который делает использование модифицированных Т-клеток как суррогат для эффекторных клеток, выразив особой активация FcγR³⁴. Кроме того линия клетки (NK92.05-CD16), выражая FcγRIIIa может использоваться как эффекторных клеток и upregulation дегрануляции антигена, CD107a используется как маркер активации. Однако следует отметить использование вирионов и вирусных пептидов на ELISA пластины на последнем протоколе как белки, покрытием на гидрофобной поверхности не всегда могут резюмировать физиологические структуры антигены³⁵.

Метод, описанный здесь это 96-луночных формат пробирного, использует физиологически соответствующих и изначально выразил Вирусная целей и могут быть изменены для человека или мышиных антител. Генетически модифицированные клетки Jurkat может быть сохранен в культуре и замораживают³⁶. Хотя в настоящее время эффекторных клеток выразить только один активация FcγR, измеряя антитела зависимых клеточный эффекторные функции следует учитывать многие преимущества использования этого протокола, описанных в настоящем исследовании.

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора P01AI097092-04S1 (P.E.L.).