Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом для анализа взаимодействия РНК-белок. Традиционно в большинстве экспериментов использовались вертикальные гели. Однако горизонтальные гели обладают рядом преимуществ, таких как возможность мониторинга комплексов во время электрофореза. Мы предоставляем подробный протокол для генерации и использования горизонтального гель-электрофореза.

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом молекулярной биологии, который широко используется для биохимического анализа взаимодействий РНК-белок. Эти взаимодействия традиционно анализировались полиакриламидными гелями, образованными между двумя стеклянными пластинами и образцами, электрофорезированными вертикально. Однако полиакриламидные гели, литые в лотках и электрофорезированные горизонтально, обладают несколькими преимуществами. Например, горизонтальные гели, используемые для анализа комплексов между флуоресцентными субстратами РНК и конкретными белками, могут быть отображены несколько раз по мере развития электрофореза. Это дает уникальную возможность контролировать РНК-белковые комплексы в нескольких точках во время эксперимента. Кроме того, горизонтальный гель-электрофорез позволяет параллельно анализировать многие образцы. Это может значительно облегчить эксперименты с временным курсом, а также одновременно проанализировать несколько реакций для сравнения различных компонентов и условий. Здесь мы имеемOvide подробный протокол для генерации и использования горизонтального нативного гель-электрофореза для анализа взаимодействия РНК-белок.

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSAs) оказались бесценным биохимическим инструментом для анализа специфических взаимодействий белок-нуклеиновая кислота ^{1 , 2 , 3} . Эти анализы могут предоставить важную информацию о связывании сродства белков к РНК или ДНК ³ , стехиометрии компонентов нуклеиновых кислот-белковых комплексов ¹ и дать важные новые сведения о специфичности связывания РНК-связывающих белков через субстратные конкурентные эксперименты ¹ .

Традиционная экспериментальная установка для этих анализов состоит из смешивания очищенного белка с радиоактивно меченым РНК-субстратом. Полученные комплексы затем анализируют с помощью неденатурирующих (нативных) полиакриламидных гелей, вылитых между двумя стеклянными пластинами с последующим электрофорезом образца в вертикальном устройстве ³, Хотя этот подход был использован исчерпывающе, чтобы дать важные сведения о биохимических механизмах, которые лежат в основе связывания белков с нуклеиновыми кислотами, он также имеет несколько ограничений. Например, эта базовая стратегия имеет относительно низкую пропускную способность и не легко адаптируется для приложений, требующих параллельного анализа многих реакций связывания. Кроме того, с традиционным вертикальным аппаратом сложно потенциально контролировать комплексы в несколько раз во время электрофореза ^{3 , 4} .

Здесь мы представляем адаптацию анализа EMSA, в котором используются нативные полиакриламидные гели, литые в планшетном аппарате, горизонтальный электрофорез и флуоресцентно меченные РНК-субстраты ^{4 , 5 , 6 , 7} . Включение этих относительно простых модификаций в основную структуруTegy дает некоторые мощные преимущества. В частности, горизонтальная планшетный формат , который легко поддается анализу десятков образцов одновременно ^4. Кроме того, для некоторых РНК-белковых комплексов, таких как те, которые образуются между белком Bicaudal-C и его электрофорезом в РНК-субстрате в горизонтальном геле, обеспечивается повышенная способность разрешать различные комплексы РНК-белок и отличить их от несвязанного РНК-субстрата.

1. Подготовка Горизонтального Нативного Полиакриламидного гел ⁴ .

1. Подготовка необходимых материалов.
   1. Для горизонтального гелеобразного аппарата используйте гелевую коробку (37 см х 24 см) с поддоном 27 см х 21 см и емкость для двух 24-луночных гребней. Эта настройка обеспечивает в общей сложности 48 выборок, которые могут быть проанализированы одновременно.
   2. Приготовить следующие реагенты: 40% акриламид-бис 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED и 10% APS (персульфат аммония).
2. Получение 10% активного акриламидного геля.
   1. В колбу на 500 мл добавьте 80 мл 5-кратного ТВЭ, 100 мл 40% акриламида и воду до конечного объема 400 мл.
   2. Добавить 4 мл 10% APS и 400 мкл TEMED. Хорошо перемешать.
   3. Вылейте смесь в горизонтальный литейный лоток и дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин. Гель будет иметь толщину приблизительно 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гели могут вставляться в вытяжной шкаф для ускоренияПолимеризации. После полимеризации тонкий слой жидкости останется на вершине геля.
   4. Вылейте жидкость и промойте бегущим буфером. Удалите гребенку (ы) тщательно и ополосните лунки бегущим буфером с помощью шприца.
3. Подготовка бегущего буфера.
   1. Подготовьте 2 л 1x TBE-буфера для гелевой коробки. Разбавляют 400 мл 5XTBE 1600 мл и перемешивают. Поместите буфер 1x TBE в холодную комнату для охлаждения.
4. Предварительная работа геля
   1. Добавьте 2 г холодного буфера в гелевую коробку и вставьте гель.
   2. Предварительно запустить гель при 120 В в течение 1 ч при 4 ° С в холодной комнате. В это время подготовьте реакцию связывания.

2. Связывающая реакция ⁸

1. 2.1.Подготовьте следующие компоненты реакции.
   20 мМ DTT
   10 мМ BSA
   10 мМ дрожжевых тРНК
   5X (50 мМ HEPES pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, 250 мМ KCl, 0,2% Твин-20)
   100 нМ флуоресцеиновой меченной РНК, приобретенной на коммерческой основе
   Концентрированный белок Bicaudal-C
   50% глицерина в обработанном DEPC H ₂ O
   Обработанный DEPC H ₂ O
2. Соберите компоненты реакции связывания в бесконтактной микроцентрифужной пробирке, свободной от РНКазы.
   1. В пробирку добавьте 5 мкл 10 мМ BSA, 5 мкл 20 мМ DTT, 5 мкл 10 мМ дрожжей тРНК, 10 мкл 5x Binding Buffer.
3. Добавить белок до конечной концентрации 250 нМ в 50 мкл. Добавьте воду до конечного объема 45 мкл.
4. Добавьте 5 мкл флуоресцентно меченого РНК-субстрата. Используйте коммерчески приобретенный 3'-флуоресцеин, меченный 32-нуклеотидным субстратом.
5. Смешать и инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.

3. Анализ образцов на родном горизонтальном полиакриламидном геле

1. Для каждой реакции добавьте 15 мкл 50% глицерина и осторожно перемешайте.
2. сторожныДобавьте 30 мкл каждой реакции к гелю. Количество образца, которое может быть загружено в одну лунку, варьируется в зависимости от толщины геля и размера лунок. Мы загрузили объемы всего 15 мкл и до 45 мкл в одну лунку гелей, созданных с помощью 24-луночного гребня, и вылили до толщины 2 см.
3. После подключения источника питания к гелевому устройству включите питание и настройте напряжение. Запустите гель при 4 ° C при 120 В.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для горизонтального гелеобразного аппарата это составляет примерно 5 В / см. Для вертикального гелеобразного аппарата это 16 В / см.
   1. Чтобы предотвратить повреждение или отбеливание флуоресцентно меченной РНК, проводите электрофорез в темноте.
   2. Время размораживания электрофореза в зависимости от специфики анализируемого комплекса РНК-белок.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основным преимуществом горизонтального анализа EMSA является то, что электрофорез может быть остановлен, геля визуализированы, а затем geЛ можно поместить обратно в аппарат, и электрофорез можно продолжать в течение более длительного времени.

4. Изображение геля

1. Проведите анализ с помощью любого инструмента, предназначенного для обнаружения и визуализации флуоресцентных субстратов.
2. Поместите гель на тепловизор.
3. Отрегулируйте настройки изображения. Для флуоресцеин-меченных РНК-лигандов используйте следующие настройки: FAM (длина волны 473 нм), 750 фотоумножителей (PMT), размер пикселя 100 мкм.
4. Сканирование геля для захвата изображения.

Чтобы продемонстрировать мощность и универсальность горизонтального гель-электрофореза, мы проанализировали связывание белка Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) с флуоресцентно меченной РНК, содержащей сайт связывания Bicc1. Белки Bicc1 функционируют в качестве мРНК-специфических трансляционных репрессоров для управления решениями о судьбе клеток во время материнской стадии развития животных ^{9 , 10 , 11 , 12,} а также функции конкретных органов у взрослых ^{13 , 14} . Наша работа в Xenopus идентифицировала первый сайт связывания белка Bicc1 ⁸ : 32-нуклеотидную область из 3'UTR мРНК Крипто-1 ^{8 , 12} . Этот сайт связывания был определен с использованием комбинации методов: защита RNaseИонные и следовые анализы, эксперименты по связыванию in vivo и анализы EMSA in vitro ⁸ .

Очищенный белок Xenopus Bicc1 смешивали с флуоресцентно меченной 32 нуклеотидной РНК; Сайт связывания Bicc1 из мРНК ⁸ Крипто-1. В отдельной реакции белок Bicc1 смешивали с флуоресцентно меченной 32 нуклеотидной РНК, полученной из 3'UTR мРНК cyclin B1. Bicc1 не связывается с мРНК ^{8 , 12} циклина B1 ^, и эта РНК служит отрицательным контролем. Половину каждой реакции анализировали на вертикальном нативном полиакриламидном геле ( фиг. 1А ), а другая часть анализировали параллельно с использованием горизонтального нативного геля ( фиг. 1В ). Это легко понять с помощью любого метода, который Bicc1 связывается с РНК-крипто-1-РНК и образует специфический комплекс aИ он не связывает отрицательную контрольную РНК циклина B1. Однако комплексы Bicc1-Cripto-1 значительно отличаются друг от друга при анализе с помощью горизонтального геля, способствуя их обнаружению и позволяя различать комплексы белок-РНК от несвязанной РНК. После визуализации гель помещали обратно в аппарат для геля и подвергали электрофорезу в течение дополнительных трех с половиной часов. После повторной визуализации геля комплексы еще мигрировали и все еще были легко обнаружимы, что свидетельствует об их стабильности ( рис. 1C ). Эта способность продолжать электрофорез и анализ после первоначальной визуализации была бы сложной, если не невозможной, с вертикальным гелевым форматом.

Рисунок 1: Сравнение вертикальных и горизонтальных природных гелей для анализа связывания Bicc1 с Cripto1 РНК. BiЭксперименты по связыванию cc1 проводили с 32-нуклеотидным флуоресцентным регулятором CyclinB1-РНК или флуоресцентным 32-нуклеотидным контрольным РНК-рецептором Cripto1. Каждая реакция содержала либо 0 нМ, либо 250 нМ N-конца SUMO-Bicc1 и анализировалась либо на ( А ) вертикальном полиакриламидном нативном геле в течение 30 мин при 120 В при 4 ° С, либо в виде дублированных образцов в горизонтальном геле на основе полиакриламида для ( B ) 2 ч при 120 В при 4 ° С или ( С ) 5,5 ч при 120 В при 4 ° С. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Родные полиакриламидные гели являются бесценным инструментом для исследования взаимодействия белок-РНК, и традиционно эти гели подвергают электрофорезу по вертикали ^{2 , 3} . Мы использовали модификацию протокола, который заменяет нативные полиакриламидные гели, созданные и электрофорезированные по горизонтали ^{1 , 4 , 6 , 7 , 15} . Эти изменения, используемые в сочетании с флуоресцентно мечеными субстратами РНК, дают многочисленные преимущества для биохимического анализа взаимодействий, связывающих белок-РНК. Эти преимущества включают в себя следующее: смешивание буферов упрощается по сравнению с вертикальным устройством, которое требует, чтобы насос передавал буфер из нижней камеры в верхние горизонтальные гели, могут генерироваться с более крупными лунками, которые обеспечивают повышенную способность к анализу larGer образцы, электрофорез на горизонтальных гелях часто обеспечивают улучшенное разрешение комплексов РНК-белок по сравнению с вертикальными гелями, а горизонтальный гель-электрофорез обеспечивает возможность экспериментов с изображениями в нескольких временных точках во время анализа.

Другим важным преимуществом является то, что горизонтальный формат позволяет создавать гели с большим количеством скважин, что обеспечивает возможность анализа нескольких выборок параллельно ¹ . Эта особенность значительно расширяет их использование в качестве биохимического инструмента для анализа взаимодействия РНК-белок. Например, способность анализировать несколько образцов облегчает исследование количественных параметров образования комплекса белка и РНК с использованием конкурентных экспериментов ¹⁵ , k _off analysis ^15, а также экспериментов, направленных на определение стехиометрии связывающих комплексных компонентов ¹⁵ . Кроме того, использованиеФлуоресцентные РНК-субстраты позволяют проводить множественные анализы, такие как анализы связывания флуоресцентной поляризации от одной реакции и получать как количественные, так и качественные данные связывания ^{5 , 15} .

Для получения оптимальных результатов от горизонтальной установки геля существуют различные параметры, которые можно настроить для улучшения качества комплексов для визуализации. Они включают изменение процентного содержания акриламида в геле, чтобы облегчить его обработку и улучшить отделение белково-РНК-комплексов от свободной РНК. Однако из-за размера может быть трудно обрабатывать акриламидные гели с низким процентом. Мы считаем, что легче использовать гели с концентрацией акриламида 7,5% или более. Кроме того, при необходимости условия электрофореза могут быть изменены для улучшения стабильности комплексов белок-РНК; Регулируя напряжение электрофореза, управляя гелем при комнатной температуре insteAd при температуре 4 ° C и настройке условий предварительного запуска.

Несмотря на многочисленные преимущества, существуют также некоторые ограничения, связанные с анализом на основе электрофореза на локальном геле. Например, его полезность максимизируется с использованием флуоресцентных субстратов РНК. В зависимости от выбранного флуорофора и размера РНК получение таких субстратов может быть дорогостоящим. Кроме того, горизонтальные гели обычно намного больше, чем вертикальные гели, и поэтому требуют большего количества материала, такого как полиакриламид и DEPC-обработанные растворы.

Горизонтальный нативный гель-электрофорез имеет потенциал для использования в качестве инструмента для проверки молекулярных экранов, которые направлены на выявление соединений, которые нацелены на клинически значимые взаимодействия РНК-белок. ¹⁶ . Такие экраны обычно используют биохимические анализы для определения соответствующих соединений для дальнейшего изучения. Более высокий пропускной потенциал горизонтального формата по сравнению с вертикальным форматом proviДают возможность применять собственный гель-электрофорез в качестве инструмента для вторичной валидации потенциальных кандидатов.

Авторам нечего раскрывать.

Мы благодарим Лауру Вандерплоэг за подготовку цифр. Работа в лаборатории Sheets поддерживается грантом NSF 1050395 и грантом NIH (R21HD076828). Работа в лаборатории Райдера поддерживается грантами NIH R01GM117237 и R01GM117008. Меган Доудл поддерживает стипендию SciMed GRS Advanced Opportunity через Университет Висконсин-Мэдисон и программу обучения биотехнологии через Национальный институт общих медицинских наук Национального института здоровья (T32GM008349).