Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.

A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental da biologia molecular que tem sido amplamente utilizada para a análise bioquímica das interações RNA-proteína. Essas interações foram tradicionalmente analisadas com géis de poliacrilamida gerados entre duas placas de vidro e amostras submetidas a eletroforese verticalmente. No entanto, os géis de poliacrilamida moldados em bandejas e submetidos a electroforese horizontalmente oferecem várias vantagens. Por exemplo, géis horizontais utilizados para analisar complexos entre substratos de ARN fluorescentes e proteínas específicas podem ser imaginados várias vezes à medida que a eletroforese progride. Isso proporciona a oportunidade única de monitorar complexos de RNA-proteína em vários pontos durante o experimento. Além disso, a eletroforese horizontal em gel possibilita analisar muitas amostras em paralelo. Isso pode facilitar muito as experiências de tempo, bem como analisar várias reações simultaneamente para comparar diferentes componentes e condições. Aqui nós prUm protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal para analisar as interações RNA-Proteína.

Os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) provaram ser uma ferramenta bioquímica inestimável para analisar as interações específicas de proteína-nucleico ^{1 , 2 , 3} . Esses ensaios podem fornecer informações importantes sobre a afinidade de ligação das proteínas ao RNA ou DNA ³ , a estequiometria componente dos complexos de ácido nucleico-proteína ¹ e fornecem novos pontos de vista importantes sobre a especificidade de ligação das proteínas de ligação de ARN através de experiências de competição de substrato ¹ .

A configuração experimental tradicional para estes ensaios consiste em misturar a proteína purificada com um substrato de ARN radiomarcado. Os complexos resultantes são então analisados ​​com géis de poliacrilamida não desnaturantes (nativos) vertidos entre duas placas de vidro seguidas por eletroforese de amostra num aparelho vertical ³. Embora esta abordagem tenha sido utilizada de forma exaustiva para fornecer informações importantes sobre os mecanismos bioquímicos subjacentes à ligação das proteínas aos ácidos nucleicos, ela também possui várias limitações. Por exemplo, esta estratégia básica tem um rendimento relativamente baixo e não é facilmente adaptável para aplicações que exigem a análise de muitas reações vinculativas em paralelo. Além disso, com o aparelho vertical tradicional, é desafiador monitorizar complexos em várias ocasiões durante a eletroforese ^{3 , 4} .

Aqui apresentamos uma adaptação do ensaio EMSA que utiliza géis nativos de poliacrilamida em um aparelho de platina, eletroforese horizontal e substratos de ARN marcados fluorescentemente ^{4 , 5 , 6 , 7} . A incorporação dessas modificações relativamente simples ao nível básicoTegy oferece algumas vantagens poderosas. Em particular, o formato de plataforma horizontal facilmente se presta a analisar dúzias de amostras simultaneamente ⁴ . Além disso, para alguns complexos de RNA-proteína, tais como aqueles formados entre a proteína Bicaudal-C e sua eletroforese de substrato de ARN em um gel horizontal, proporciona uma capacidade aumentada para resolver complexos distintos de proteína RNA e discriminar estes de substrato de ARN não ligado.

1. Preparação do Gel de Poliacrilamida Nativo Horizontal ⁴ .

1. Preparação dos materiais necessários.
   1. Para o aparelho de gel horizontal, use uma caixa de gel (37 cm x 24 cm) com uma bandeja de 27 cm x 21 cm e uma capacidade para dois pentes de 24 poços. Esta configuração fornece um total de 48 amostras que podem ser analisadas simultaneamente.
   2. Prepare os seguintes reagentes: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (persulfato de amônio).
2. Geração de um gel de acrilamida nativo a 10%.
   1. Num balão de 500 mL, adicione 80 mL de TBE 5x, 100 mL de acrilamida a 40% e água até um volume final de 400 mL.
   2. Adicione 4 mL de APS a 10% e 400 μL de TEMED. Misture bem.
   3. Despeje a mistura na bandeja de fundição horizontal e deixe o gel polimerizar por 30 min. O gel terá aproximadamente 2 cm de espessura.
      NOTA: Os géis podem lançar uma exaustão para acelerarAté a polimerização. Após a polimerização, uma fina camada de líquido permanecerá no topo do gel.
   4. Despeje o líquido e lave com tampão corrente. Remova o (s) pente (s) com cuidado e enxágue os poços com tampão corrente usando uma seringa.
3. Preparação do buffer de operação.
   1. Prepare 2 L de buffer de corrida 1x TBE para a caixa de gel. Diluir 400 mL de 5XTBE com 1600 mL e misturar. Coloque 1x tampão TBE na sala fria para esfriar.
4. Pre-Running the gel
   1. Adicione 2 L de tampão de funcionamento a frio na caixa de gel e insira o gel.
   2. Antes de executar o gel a 120 V por 1 h a 4 ° C em uma sala fria. Durante esse período, prepare a reação de ligação.

2. Reação de encadernação ⁸

1. 2.1.Prepare os seguintes componentes de reação.
   DTT 20 mM
   BSA 10 mM
   TRNAs de levedura 10 mM
   Tampão de ligação 5X (HEPES 50 mM pH 8,0, EDTA 5 mM, 25KCl 0 mM, Tween-20 a 0,2%)
   RNA marcado com fluoresceína 100 nM adquirido comercialmente
   Proteína Bicaudal-C concentrada
   50% de glicerol em H ₂ O tratado com DEPC
   H ₂ O tratado com DEPC
2. Monte os componentes de reação de ligação em um tubo de microcentrífuga sem RNase.
   1. Ao tubo, adicione 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNAs de levedura 10 mM, 10 μL de tampão de ligação 5x.
3. Adicionar proteína a uma concentração final de 250 nM em 50 μL. Adicione água a um volume final de 45 μL.
4. Adicione 5 μL de substrato de ARN marcado fluorescentemente. Use um substrato de 32-nucleotídeos marcado com fluoresceína de 3 'adquirido comercialmente.
5. Misturar e incubar no escuro durante 30 min à temperatura ambiente.

3. Análise de Amostras no Gel Nativo de Poliacrilamida Horizontal

1. A cada reação, adicione 15 μL de glicerol a 50% e misture suavemente.
2. CarefuAdicione 30 μL de cada reacção ao gel. A quantidade de amostra que pode ser carregada num único poço varia dependendo da espessura do gel e do tamanho dos poços. Carregamos volumes tão pequenos quanto 15 μL e até 45 μL em um único poço de géis criados com um pente de 24 po e despejados até uma espessura de 2 cm.
3. Depois de conectar a fonte de alimentação ao aparelho de gel, ligue a alimentação e ajuste a tensão. Execute o gel a 4 ° C a 120 V.
   NOTA: Para o aparelho de gel horizontal, isso acaba sendo de aproximadamente 5 V / cm. Para o aparelho de gel vertical, isto é 16 V / cm.
   1. Para evitar danos ou branqueamento do ARN marcado de forma fluorescente, realize eletroforese no escuro.
   2. Vários tempos de eletroforese dependendo dos detalhes do complexo RNA-proteína que está sendo analisado.
      NOTA: Uma grande vantagem da análise EMSA horizontal é que a eletroforese pode ser interrompida, a imagem em gel e depois a gePosso voltar para o aparelho e a eletroforese pode continuar por tempos mais longos.

4. Imaging the Gel

1. Execute análise com qualquer instrumento projetado para detecção e imagens de substratos fluorescentes.
2. Coloque o gel na imagem.
3. Ajuste as configurações da imagem. Para os ligandos de ARN marcados com fluoresceína, use as seguintes configurações: FAM (comprimento de onda 473 nm), 750 Tensão de fotomultiplicador (PMT), tamanho de pixel de 100 μm.
4. Digitalize o gel para capturar a imagem.

Para demonstrar o poder e a versatilidade da eletroforese em gel nativo horizontal, analisamos a ligação da proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a um ARN marcado fluorescentemente contendo um local de ligação Bicc1. As proteínas Bicc1 funcionam como repressores translacionais específicos de mRNA para controlar as decisões do destino das células durante os estádios maternos do desenvolvimento animal ^{9 , 10 , 11 , 12} , bem como as funções dos órgãos específicos em adultos ^{13 , 14} . Nosso trabalho em Xenopus identificou o primeiro local de ligação para uma proteína Bicc1 ⁸ : uma região de 32 nucleótidos a partir do 3'UTR do mRNA ^{8 , 12} de Cripto-1. Este site vinculativo foi definido usando uma combinação de técnicas: proteção RNaseEnsaios de íons e pegadas, experiências de ligação in vivo e ensaios de EMSA in vitro ⁸ .

A proteína Xenopus Bicc1 purificada foi misturada com um ARN de 32 nucleótidos marcado fluorescentemente; O local de ligação de Bicc1 do mRNA ^{8 de} Cripto-1. Numa reacção separada, a proteína Bicc1 foi misturada com um ARN de 32 nucleótidos marcado fluorescentemente derivado do 3'UTR do ARNm da ciclina B1. Bicc1 não se liga ao ARNm ^{8 , 12} da ciclina B1 e este RNA serve como um controle negativo. Metade de cada reação foi analisada em um gel de poliacrilamida nativo vertical ( Figura 1A ) enquanto a outra porção foi analisada em paralelo usando gel nativo horizontal ( Figura 1B ). É facilmente aparente usando qualquer método que Bicc1 se liga ao RNA Cripto-1 RNA e forma um complexo específico aE não liga o ARN de controle negativo de ciclina B1. No entanto, os complexos Bicc1-Cripto-1 são significativamente mais distintos quando analisados ​​com o gel horizontal, ambos facilitando a sua detecção e permitindo a discriminação dos complexos proteína-ARN do ARN não ligado. Após a imagem, o gel foi colocado de volta no aparelho de gel e submetido a eletroforese por mais três horas e meia. Após a re-imagem do gel, os complexos haviam migrado mais e ainda eram facilmente detectáveis, indicando sua estabilidade ( Figura 1C ). Essa capacidade de continuar a eletroforese e análise após a imagem inicial seria desafiadora, se não impossível, com o formato de gel vertical.

Figura 1: Comparação dos géis nativos verticais e horizontais para análise da ligação do RNA Bicc1 ao Cripto1. BiAs experiências de ligação a cc1 foram conduzidas com um controlo negativo de ARN Ciclina B1 de 32 nucleótidos ou um controlo positivo de ARN cripto1 de 32 nucleos fluorescentes. Cada reacção continha 0 nM ou 250 nM de N-terminal SUMO-Bicc1 e analisou-se num gel nativo de poliacrilamida vertical ( A ) executado durante 30 min a 120 V a 4 ° C ou como amostras duplicadas no gel nativo de poliacrilamida horizontal para ( B ) 2 h a 120 V a 4 ° C ou ( C ) 5,5 h a 120 V a 4 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os géis nativos de poliacrilamida são uma ferramenta inestimável para investigar as interações proteína-ARN e, tradicionalmente, esses géis são submetidos a eletroforese verticalmente ^{2 , 3} . Utilizamos uma modificação do protocolo que substitui géis de poliacrilamida nativos criados e submetidos a eletroforese horizontalmente ^{1 , 4 , 6 , 7 , 15} . Estas alterações utilizadas em combinação com substratos de ARN marcados com fluorescência proporcionam inúmeras vantagens para a análise bioquímica das interações de ligação proteína-ARN. Estas vantagens incluem o seguinte: a mistura de buffers é simplificada em comparação com um aparelho vertical que requer uma bomba para transferir o tampão da câmara inferior para o superior, os géis horizontais podem ser gerados com poços maiores que proporcionam uma capacidade aumentada para analisar larAs amostras ger, a eletroforese em géis horizontais geralmente proporcionam uma resolução aprimorada de complexos de RNA-proteína em comparação com géis verticais, e a eletroforese horizontal de gel proporciona a capacidade de experiências de imagem em vários pontos de tempo durante a análise.

Outra vantagem importante é que o formato horizontal se presta a criar géis com um grande número de poços que fornece a capacidade de analisar múltiplas amostras em paralelo ¹ . Este recurso amplia significativamente seu uso como uma ferramenta bioquímica para analisar as interações RNA-proteína. Por exemplo, a capacidade de analisar amostras múltiplas facilita a investigar os parâmetros quantitativos da formação do complexo proteína-RNA, através da utilização de experiências de competição ^15, _koff análise ^15, bem como experiências concebidas para definir a estequiometria dos componentes do complexo de ligação ^15. Além disso, o uso de umOs substratos de ARN fluorescentes permitem realizar análises múltiplas, tais como ensaios de ligação de polarização de fluorescência a partir de uma única reação e obter dados de ligação quantitativos e qualitativos ^{5 , 15} .

Para obter resultados ótimos da configuração de gel horizontal, há uma variedade de parâmetros que podem ser ajustados para melhorar a qualidade dos complexos para imagens. Estes incluem a alteração da percentagem de acrilamida do gel, a fim de facilitar a manipulação e aumentar a separação dos complexos proteína-ARN do ARN livre mais. No entanto, pode ser difícil lidar com baixos percentuais de géis de acrilamida devido ao tamanho. Achamos mais fácil usar géis que tenham uma concentração de acrilamida de 7,5% ou superior. Além disso, se necessário, as condições de eletroforese podem ser alteradas para melhorar a estabilidade dos complexos proteína-ARN; Ajustando a tensão de eletroforese, executando o gel à temperatura ambienteAnúncio de 4 ° C e ajuste das condições de pré-execução.

Apesar das muitas vantagens, existem também algumas limitações dos ensaios de eletroforese em gel nativo horizontal. Por exemplo, sua utilidade é maximizada usando substratos de ARN fluorescentes. Dependendo do fluoróforo escolhido e do tamanho do ARN, a obtenção desses substratos pode ser dispendiosa. Além disso, os géis horizontais são geralmente muito maiores que os geles verticais e, portanto, exigem quantidades maiores de material, como soluções de poliacrilamida e tratadas com DEPC.

A eletroforese em gel nativo horizontal tem potencial para ser usada como ferramenta de validação para telas moleculares que buscam identificar compostos que visem as interações de RNA-proteína clinicamente relevantes ¹⁶ . Essas telas tipicamente usam ensaios bioquímicos de solução para identificar compostos relevantes para estudo posterior. O maior potencial de produção do formato horizontal em comparação com o formato vertical proviÉ uma oportunidade de aplicar eletroforese nativa de gel como uma ferramenta para validação secundária de potenciais candidatos.

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos a Laura Vanderploeg pela preparação de números. O trabalho no laboratório Sheets é suportado pela subvenção NSF 1050395 e pela concessão NIH (R21HD076828). O trabalho no laboratório Ryder é suportado por concessões do NIH R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle é apoiada por uma Bolsa de Oportunidades Avançadas da SciMed GRS através da Escola de Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin-Madison e do Programa de Treinamento em Biotecnologia através do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (T32GM008349).