Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

Этот отчет описывает способ биоинженерии на проектирование и строительство новых искусственных сплайсинг факторов (ASFs), которые специфически модулируют сплайсинг генов-мишеней в клетках млекопитающих. Этот метод может быть дополнительно расширен инженером различных искусственных факторов, манипулировать другие аспекты метаболизма РНКА.

Обработка большинства эукариотических РНК опосредуется РНК-связывающими белками (RBP) с модульными конфигурациями, включая модуль распознавания РНК, который специфически связывает мишень пре-мРНК и эффекторный домен. Раньше мы использовали уникальный способ связывания РНК PUF-домена в человеческом Pumilio 1 для генерации программируемого RNA binding scaffold, который использовался для разработки различных искусственных RBP для манипулирования метаболизмом РНК. Здесь описывается подробный протокол, чтобы построить Engineered Splicing Factors (ESF), специально предназначенные для модуляции альтернативного сплайсинга целевых генов. Протокол включает в себя то, как спроектировать и построить настраиваемый PUF-каркас для конкретной целевой РНК, как построить плазмиду экспрессии ESF, сплавляя дизайнерский PUF-домен и эффекторный домен, и как использовать ESF для манипулирования сплайсированием целевых генов. В репрезентативных результатах этого метода мы также описали общие анализыАктивности ESF с использованием сплайсинга репортеров, применения ESF в культивируемых клетках человека и последующего эффекта изменений сплайсинга. Следуя подробным протоколам в этом отчете, можно разрабатывать и генерировать ESF для регулирования различных типов альтернативного сплайсинга (AS), предоставляя новую стратегию изучения регуляции сплайсинга и функции различных сплайсинговых изоформ. Более того, путем слияния различных функциональных доменов с разработанным доменом PUF, исследователи могут создавать искусственные факторы, которые нацелены на конкретные РНК для манипулирования различными этапами обработки РНК.

Большинство генов человека подвергаются альтернативного сплайсинга (AS) , чтобы произвести несколько изоформ с различными деятельности, что значительно увеличило сложность кодирования генома ^{1, 2.} AS обеспечивает большую механизм для регулирования функции гена, и он жестко регулируется посредством различных путей в различной клеточной и развитии стадии ^{3, 4.} Поскольку сращивание misregulation является частой причиной заболевания человека ^{5, 6, 7, 8,} нацеливание регулирования сплайсинга становится привлекательным терапевтическим маршрутом.

В соответствии с упрощенной модели регулирования сплайсинга, как в основном контролируется сращивания регуляторной цис - элементы (SRES) в пре-мРНК , которые функционируют в качестве усилителей сплайсинга или глушителей альтернативных экзонов. ThESE SRES специально набирать различный транс -Актерских белковые факторов (т.е. факторы сплайсинга) , которые способствуют или подавляют реакцию сплайсинга ^{3, 9.} Большинство факторов сплайсинга транса -Актерских имеют отдельный РНК последовательности специфической связывающие домены для распознавания их целей и эффекторных доменов для управления сплайсингом. Наиболее известные примеры являются членами серина / аргинин-богатых (SR) семейства белков , которые содержат N-концевой РНК Признание Мотивы (РРС), которые связываются exonic энхансеров сплайсинга, и С-концевые RS доменов, которые способствуют экзону включения ¹⁰ , С другой стороны , hnRNP А1 связывается с exonic сплайсинга глушителей через RRM доменов и ингибирует включение экзона через C-концевой глицин-богатых доменов ^11. Использование таких модульных конфигураций, исследователи должны иметь возможность проектировать искусственные факторы сплайсинга путем объединения специфической РНК-связывающий домен (RBD) с различными эфКоторые активируют или ингибируют сплайсинг.

Ключом такой конструкции является использование RBD, который распознает заданные цели с программируемой специфичностью связывания РНК, что аналогично режиму связывания ДНК домена TALE. Однако большинство родных факторов сплайсинга содержат RRM или K гомологичные (KH) домены, которые распознают короткие элементы РНК со слабой аффинностью и, следовательно, не имеют прогностического «кода» распознавания РНК-белка. RBD повторных белков PUF ( т.е. PUF-домен) обладает уникальным режимом распознавания РНК, что позволяет редизайн доменов PUF специфически распознавать разные мишени РНК ^{13 , 14} . Канонический домен PUF содержит восемь повторов трех α-спиралей, каждый из которых распознает одно основание в мишени 8-nt РНК. Боковые цепи аминокислот в определенных положениях второй α-спирали образуют специфические водородные связи с краем Уотсона-Крика tон РНК базы, которая определяет РНК специфичность связывания каждого повтора (рис 1А). Код РНК базового признания ППУ повтора на удивление прост (Фигура 1А), что позволяет для генерации ППУ доменов , которые распознают любую возможную 8-базовую комбинацию (обзор Wang Wei и ^15).

Этот модульный принцип конструкции позволяет генерацию Engineered сращивания фактора (ФЭБ) , который состоит из настраиваемой ППЫ области и области сплайсинга модуляции (т.е. домена SR или Кли-богатого домен). Этот ESFS может функционировать либо как сплайс - активаторы или ингибиторы , как управлять различными типами сплайса событий, и они оказались полезными в качестве средств для манипулирования сплайсинга эндогенных генов , связанных с заболеванием человека ^{16, 17.} В качестве примера, мы построили ESFS ППУ-Гли-типа специфически изменить сплайсинг гена Bcl-X, Превращая антиапоптозную длинную изоформы (Bcl-XL) в проапоптотическую короткую изоформы (Bcl-Xs). Сдвиг отношения Bcl-X изоформы было достаточно , чтобы привлечь внимание несколько раковых клеток в нескольких химиотерапевтических препаратов против рака ^16, предполагая , что эти искусственные факторы могут быть полезны в качестве потенциальных терапевтических реагентов.

В дополнение к управлению сращивание с известными сплайсинга эффекторных доменов (например, RS или Gly-богатых доменов), сконструированные ППУ факторы также могут быть использованы для изучения деятельности новых факторов сплайсинга. Например, при использовании этого подхода, мы показали , что С-концевой домен из нескольких SR белков может активировать или ингибировать сплайсинг при связывании с различными пре-мРНК областей ^18, что аланин-богатый мотив RBM4 может ингибировать сплайсинг ^19, и что пролин-богатый мотив DAZAP1 может усилить сплайсинг ^{20, 21 <}/ Sup>. Эти новые функциональные домены могут использоваться для построения дополнительных типов искусственных факторов для точной настройки сплайсинга.

1. Строительство ППЫ строительных лесов с настраиваемым РНКОМ-специфичности связывания с помощью перекрывающего ПЦРА

1. Дизайн серии ПЦР - праймеров , содержащих PUF последовательности , которые специфически распознают различные нуклеотиды РНК в каждой позиции ¹² (см таблицу 1 для последовательностей праймеров и рисунок 1 А для РНК: ППУ код распознавания). Для каждого ППУ повтора, дизайн четыре различных праймера, чтобы распознать другую базу на каждой позиции.
   Примечание: Эти праймеры будут использованы в серии из четырех раундов ПЦР - реакций для генерации PUF фрагментов , которые соединены друг с другом (фиг.1 B).
2. Выберите сайт узнавания гена-мишени вблизи альтернативного сайта сплайсинга.
   Примечание: Этот сайт может быть принято пользователем, и обычно выбирается в пределах 10 - 50 нт от альтернативных сайтов сплайсинга.
3. Раунд 1: Генерация кодирующих последовательностейДля 4 повторов PUF, универсальных фрагментов моста и фрагментов крышки.
   1. Используйте целевой сайт, чтобы определить код распознавания для каждого повторения настроенного PUF. Выберите набор праймеров ПЦР для повторов PUF 1-8. Проведите четыре последовательных цикла ПЦР для получения настроенного домена PUF, как описано ниже ( Рисунок 1 B ).
   2. В первом цикле ПЦР устанавливают стандартные реакционные смеси ПЦР (содержащие 2,5 мкл 10х буфера, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 0,5 мкл 10 мкМ прямых и обратных праймеров, 50 нг ДНК-матрицы (человеческая кДНК или экспрессирующий вектор Домена WT PUF) и ДНК-полимеразу с высокой точностью 0,5 U в 25 мкл конечного объема).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти реакции будут продуцировать последовательности ДНК, соответствующие каждому повторному PUF, универсальным фрагментам мостика и двум фрагментам каппа с различными сайтами рестрикции ( фиг. 1B). Краткий список шаблонов, праймеровИ генерируемые ПЦР - продукты , используемые на этой стадии , приведены в таблице 2.
   3. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 15 с при 72 ° С; и 5 мин инкубации при 72 ° С. Используйте высококачественную ДНК-полимеразы, чтобы минимизировать точечные мутации в процессе ПЦР.
4. Этап 2: Генерация кодирующие последовательности для R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) и R5 / R6 / R7 / R8 (R 5 - 8).
   1. Отдельные продукты ПЦР, полученные на этапе 1.3.3 с помощью электрофореза с 1,5% агарозном геле (25 мин при постоянном напряжении 120 В). Гель-очистить все продукты ожидаемого размера с использованием набора для очистки геля. Используйте другую смесь этих продуктов в качестве матрицы в следующих раундах ПЦР.
      Примечание: Смешайте три продукта ПЦР в примерно в соотношении 1: 1: 1. Они, как правило, не должны быть определены количественно, пока интенсивность каждого продукта похожа на геле.
   2. Смешайте около 5% очищенных продуктов ПЦР в качестве ПЭМпластина в следующий раунд ПЦР. В качестве альтернативы, количественно очищенные продукты ПЦР с использованием UV-VIS спектрофотометр и использовать 15 нг каждого ПЦР-продукта в матричной смеси.
   3. Используйте очищенные ПЦР-продукты R1 / R2, R3 / R4, и мост 2/3 в виде смешанных шаблонов и R1-F и R4-R в качестве праймеров. Настройка реакции PCR, как описано на стадии 1.3, чтобы получить перекрывающийся ПЦР продукт R1 - 4.
   4. Используйте очищенные ПЦР - продукты R5 / R6, R7 / R8, и мост 6-7 в качестве смешанных шаблонов и R5-F и R8-R в качестве праймеров для получения перекрывающего ПЦР - продукта R5-8 (рисунок 1 В). Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 30 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С. Гель очищают R1-4 и R5-8.
5. Этап 3: Генерировать кодирующие последовательности для R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 без крышек).
   1. В третьем раунде ПЦР с использованием очищенного R1-4, R5-8, и Мост 4/5, как смешанные шаблоны и R1-F иR8-R, в качестве праймеров, настроить реакцию PCR, как описано на стадии 1.3, чтобы получить перекрывающего ПЦР продукта R1-8 без крышек.
   2. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 55 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С. Гель очищает R1-8 без шапок.
6. Round 4: Генерация кодирующих последовательностей для полных ППЫ доменов.
   1. В последнем раунде ПЦР с использованием очищенного R1-8 без крышек и 5'-конца и 3'-концевыми крышками как смешанные шаблоны и Cap-F и Cap-R в качестве праймеров, созданной ПЦР-реакции, как описано на стадии 1.3 для получения конечных мутированные домены PUF.
   2. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 1 мин при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С.
   3. Гель-очистки продуктов ПЦР конечных репрограммированных доменов ППУ. Используйте эти продукты для построения экспрессии плазмиды ФЭБА в последующих стадиях. SequENCE окончательной конструкции с целью проверки перепрограммировать последовательности ППУ доменов.
      Примечание: Крышка-F кодирует NLS (PPKKKRKV) между BamH I и сайтами Xba I и Cap-R кодирует стоп - кодон и сайт Sal I (сайты рестрикции были разработаны для построения экспрессии векторов ESFS, рисунок 1 С).

2. Построение функционального модуля из ESFS

1. Две стратегий обычно используется для клонирования функциональных модулей ESFS (RS доменов или Кли-богатые домены): чтобы усилить эти домены с помощью ПЦРА с использованием общей кДНК человека в качестве матрицы (этап 2.2) или непосредственно синтезировать фрагменты ДНК, которые кодируют различные RS или Gly-богатые домены (этап 2.3).
2. С помощью ПЦР для клонирования RS домены из остатков 123 - 238 из 9G8 (NP001026854), остатков 180-272 из SRP40 (NP008856), или остатки 117 - 221 SC35 (NP003007). Клон Gly-богатых доменов из остатков 195 - 320 hnRNP A1 (NP_002127), остатокс 203 - 353 hnRNP A2 (NP112533), или остатки 211 - 378 из hnRNP A3 (NP919223).
   1. Используйте NCBI праймер дизайн инструмента (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) или Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) для разработки праймеров для клонирование RS доменов или Кли-богатые домены (функциональный модуль ESFS).
      Примечание: Прямой праймер содержит N-концевой FLAG тег после сайта Nhe I. Обратный праймер содержит сайт BamHI - I для клонирования в векторы экспрессии (Рисунок 1 С).
   2. Настройка стандартной реакции ПЦР, как описано на стадии 1.3, для усиления RS или Gly-богатых доменов. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 30 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С.
3. Клон RS-домены или Gly-богатых доменов путем прямого синтеза ДНК. Вместо того чтобы генерировать ПЦР-продукты, которые кодируют эффекторные домены на шаге 2.2, СЕНТРазмер олигонуклеотид, который кодирует короткий фрагмент-домен RS (RSRSRSRSRSRS) или Gly-богатый домен (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG), используя коммерческий источник ДНК-олигонуклеотидов.

3. Построение ESF экспрессирующих плазмид

1. Построить ESF плазмиды экспрессии, используя любой вектор экспрессии,.
   Примечание: Выражение построить PGL-Gly-MS2 (подарок от доктора Р. Breathnach из Института де Biologie-CHR ¹¹⁾ был первоначально использован, который кодирует от N- к С-концевой FLAG, с эпитопом, в Gly -богатый домен hnRNP А1, и белок MS2, шерсть. Таким образом, это выражение конструкция использует в качестве примера в следующем шаге.
   Примечание: Другие векторы экспрессии с несколькими сайтами клонирования может быть также использованы и стандартные шаги по клонированию будет применяться для соединения фрагментов вместе.
2. Дайджест 1,5 мкг плазмид экспрессии (PGL-Гли-MS2), указанных в пункте 3.1, чтобы удалить фрагмент белка оболочки MS2. Используйте ОГРАНИЧЕНИЯЭндонуклеаз BamH I и Sal I в течение 1 ч при 37 ° С. Переварить модуль распознавания ESF (кодирующий NLS и перепрограммированные PUF-домены, сгенерированные на шаге 1.5) с BamH I и Sal I в том же состоянии.
3. Добавляли 5х красящий краситель к реакциям рестрикционного переваривания и медленно электрофорезировали общий объем с 1,5% агарозным гелем, содержащим пятно ДНК-геля в течение 40 мин при 120 В. Гель-очищают переваренные продукты.
4. Подготовьте 10 мкл реакций лигирования с очищенным модулем узнавания вставками ESF и ДНК вектора экспрессии в соотношении 3: 1, 1 мкл ДНК-лигазы и 1 мкл буфера 10 лигирования. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С; Результирующая конструкция экспрессирует ESF Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) под контролем промотора CMV ( фиг. 1 C ).
5. Удалите фрагмент, кодирующий домен FLAG / Gly-rich, с помощью переваривания Nhe I и BamH I в течение 1 ч при 37oC. Замените его фрагментом, который кодирует домен RS (сгенерированный на этапе 2.2, также перевариваемый Nhe I и BamH I); Результирующая конструкция выражает ESF RS-PUF-типа (фиг.1С).

4. Строительство сплайс-репортера

1. Синтезируют олигонуклеотиды, содержащие последовательности-кандидаты ( т.е. последовательности-мишени PUF-доменов), фланкированные сайтами Xho I и Apa I или сайтами Xho I и EcoR I. Отжиг олигонуклеотидов в течение 5 мин при 55 ° С с получением двухцепочечных вставок, содержащих сайты узнавания доменов PUF, фланкированных сплоченными концами участков Xho I и Apa I или Xho I и EcoR I.
2. Начните с ранее описанного модульного сплайсингового репортера ²² , pGZ3, который содержит два экзона GFP, разделенных тестовым экзоном (экзон 12 человеческого IGF2BP1, Ensemble ID ENSG00000159217) и его фланговые интронов.
   Примечание: Тест экзон был разработан с сайтами Xho I и Apa I, которые могут быть использованы для вставки синтезированных олигонуклеотидов , содержащих последовательности - кандидатов (целевые последовательности доменов ППЫ). Этот модульный сплайсинга репортер (pGZ3) обеспечивается с помощью плазмиды хранилище Add-гена.
3. Дайджест базовый репортер pGZ3 (полученного на стадии 4.2) с эндонуклеаз рестрикции Xho I и Apa I в течение 1 ч при 37 ° С.
4. Гель-очистить переваренные продукты, как описан на стадии 3.3.
5. Готовят 10 мкл лигирования реакций с двухцепочечных вставками, генерируемых на этапе 4.1 и переваренного вектора pGZ3, генерируемых на этапе 4.4 в 3: молярном соотношении 1, 1 мкл ДНК-лигазы и 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С, чтобы получить конструкционный сплайсинг репортера вектор pGZ3.
6. Вставьте вкладыши двухцепочечной, сгенерированные на этапе 4.1 в ранееОпубликованных репортеров, pEZ-1B (с использованием сайтов Xho I и EcoR I) и pEZ-2F (с использованием сайтов Xho I и Apa I) ²³ , для получения конкурирующего репортера 5 и репортера 3-го участника, как описано в шагах 4.3-4.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Оба типа репортеров сплайсинга будут доступны через Add-gene.

5. Конструирование векторов экспрессии лентивирусов для ESF

1. Настроить стандартную реакцию ПЦР, как описано в шаге 1.3, для амплификации полноразмерных ESF из исходных векторов экспрессии (pGL-Gly-PUF или pGL-RS-PUF) с праймерами, содержащими сайты Mlu I / Spe I. Установите программу PCR следующим образом: 5 мин при 95 ° C; 28 циклов 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 1,5 мин при 72 ° С; И 5 мин при 72 ° C.
2. Через реакцию пищеварения, гелевую очистку и реакцию лигирования, интегрируют ESF в лентивирусный вектор экспрессии pWPXLd между Mlu I / сайтов Spe I, как описано в пунктах 3.2-3.4.
3. С помощью стандартного метода осаждения фосфата кальция, как сообщалось ранее ^24, чтобы генерировать лентивирусы от cotransfecting HEK293T клеток путем упаковки векторов, psPAX2 и pMD2.G, либо с pWPXLd-Гли-ППА (Bcl-X), pWPXLd-Гли-ППА ( по массе) (в качестве контроля специфичности) или pWPXLd-GFP (макет).
   1. Семенной 5x10 ⁶ HEK293T клеток в 10 см чашки и выращивают клетки в течение ночи в 10 мл Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , на чашку в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ , Выполните трансфекции, когда клетки 70 - 90% сплошности.
   2. Готовят смесь плазмиды путем добавления трех плазмид (7,5 мкг вектора упаковки, psPAX2; 2,5 мкг pMD2.G и 10 мкг либо pWPXLd-Гли-ППУ (Bcl-X), pWPXLd-Гли-ППУ (вес) или pWPXLd-GFP), в 2 мл пробирку.
   3. Добавьте 560 мкл 0,25 М CaCl2 и 560 мкл раствора 2x BBS к трубе 2-мл. Осторожно перемешать несколько раз и инкубировать ее в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы приготовить смесь для трансфекции.
   4. Добавьте все трансфекции смесь с 10-см чашек. Вихревой посуду мягко и инкубировать их в течение ночи при 3% CO ₂ и 37 ° С.
   5. Извлеките носитель, добавьте 10 мл свежей среды DMEM с 2% FBS в каждую чашку, и инкубируют их при 10% CO ₂ и 37 ° CO / N.
   6. Собирают первый супернатант из блюд. Добавьте 10 мл свежей DMEM с 2% FBS к каждому блюду. Инкубируйте блюда O / N в 10% CO ₂ и 37 ° С. Хранить супернатант при 4 ° С.
   7. Собрать второй супернатант из блюд. Бассейн супернатант из первого и второго урожая. Очистить супернатант клеточного дебриса путем ее фильтрации через фильтр 0,4 мкм. Используйте очищенную надосадочную жидкость непосредственно или хранить его при температуре -80 ° С.
4. Определить титр лентивирусов путем заражения HEK293T с серийными разведениями вирусного препарата, как сообщалось ранее ²⁵ .

6. Конкретная модуляция включения экзонов и альтернативное использование сайтов сплайсинга с ESF

1. Семена 2 × 10 ⁵ клеток HEK293T в каждую лунку 24-луночного планшета. Выращивают клетки в течение ночи в 500 мкл DMEM с добавлением 10% FBS в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ .
2. Смешайте липосомальный трансфекционный реагент, осторожно переворачивая бутылки перед использованием. Разбавьте 2 мкл липосомного трансфекционного реагента в 50 мкл уменьшенной сывороточной среды. Тщательно перемешайте и инкубируйте их в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Разбавляют 0,04 мкг экспрессирующих векторов pGL-Gly-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pGZ3 в 50 мкл среды с пониженной сывороткой в ​​стерильной пробирке. Разбавляют 0,4 мкг экспрессирующих векторов pGL-RS-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pGZ3 в 50 мкл среды с пониженной сывороткой в ​​стерильной пробирке. D0,4 мкг экспрессирующих векторов pGL-RS-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pEZ-1B или pEZ-2F в 50 мкл восстановленной сывороточной среды в стерильной пробирке.
4. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре осторожно перемешивают разбавленный липосомный трансфекционный реагент, полученный на стадии 6.2, с разбавленными плазмидами, полученными на стадии 6.3. Инкубируйте смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Добавьте в каждую лунку все трансфекционные смеси, содержащие векторы экспрессии и трансфекционный реагент, приготовленные на стадии 6.4, и инкубируйте в течение, по меньшей мере, 12 ч в увлажненном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО ₂ .
6. Через 12 часов в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ отбросьте среду из каждой лунки и промойте их 500 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) / лунку.
7. Отбросьте PBS и добавьте 200 мкл трипсина в каждую лунку. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO _{2 в} течение 5 минут. Добавьте 1 мл среды, чтобы остановить диGestion и передачи клеток в стерильную пробирку на 1,5 мл.
8. Центрифуга пробирки в течение 3 мин при 5000 мкг и отбросить среду. Добавить 0,5 мл буфера для экстракции РНК на пробирку, чтобы лизировать клетки от повторяющихся пипетированием. Инкубируйте гомогенизированные образцы в течение 5 мин.
9. Для каждой экстракции РНК-буфера обработанной пробы, добавляют 0,1 мл хлороформа в 0,5 мл буфера для экстракции РНК. Invert пробирки в течение 15 с и инкубировать их в течение 3 мин при комнатной температуре.
10. Центрифуга пробирки в течение 15 мин при 12000 х г и 4 ° С. Передача водной фазы в новую пробирку. Добавьте 0,25 мл изопропанола в 0,5 мл буфера для экстракции РНК, используемых для начальной гомогенизации.
11. Смешайте встряхиванием и инкубировать их при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга пробирки при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. После центрифугирования осадок РНК обычно виден в нижней части трубы.
12. Удалите супернатант и промыть осадок РНК с помощью 0,5 мл 75% этанола в 0,5 мл буфера для экстракции РНК.
13. Вихревой энергично и центрифуге это при 7500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и сухой осадок РНК. Растворить РНК в 50 мкл РНКазы свободной воды.
14. Добавьте 2 мкл 5U / мкл ДНКазы I, 7 мкл 10 - кратного буфера и 11 мкл H ₂ O к каждому раствору 50-мкл РНК. Инкубировать пробирки при 37 ° С в течение 1 ч. Тепло их при 70 ° С в течение 15 мин для инактивации ДНКазы.
15. Для каждого образца, добавьте следующие компоненты в 0,2 мл нуклеазы без трубки: 1 мкл 50 мкМ олиго дТ, 5 мкл 400 нг / мкл РНК (2 мкг), 1 мкл 10 мМ дНТФ, и 3 мкл H ₂ О. Выполните обратный ПЦР.
    1. Смесь нагревают до 65 ° С в течение 5 мин и инкубировать ее на льду в течение по меньшей мере 2 мин, чтобы предотвратить повторное образование вторичной структуры. Добавьте следующие компоненты в одной и той же трубке: 4 мкл 5х первой цепи буфера, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл 200 ед / мкл обратной транскриптазы, и 4 мкл H _{2 <}/ Sub> O. Смешайте пипеткой осторожно вверх и вниз и инкубируйте при 50 ° C в течение 60 минут. Остановите реакцию, нагревая ее при 70 ° C в течение 15 минут.
16. Для каждого образца добавьте следующие компоненты в пробирку для ПЦР, чтобы завершить меченную телом ПЦР: 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, 0,5 мкл 10 мМ раствора dNTP, 1 мкл 10 мкМ прямого праймера, 1 мкл 10 мкМ Обратный праймер, 0,25 мкл 5 U / мкл Taq ДНК-полимеразы, 0,5 мкл 25 нМ Cy5-dCTP и 2 мкл кДНК, полученной на стадии 6.15.
    1. Нагреть реакцию до 94 ° С в течение 2 мин для денатурирования молекул, провести 25 циклов ПЦР (94 ° С в течение 30 с, 60 ° С 30 с и 72 ° С 30 с), поддерживать реакцию при 72 ° С для 7 мин, а затем оставьте его при 4 ° C.
17. Растворить продукты ПЦР путем электрофореза через 10% полиакриламидный гель с 1x основанием Tris, борной кислотой и EDTA (TBE). Выполните сканирование с помощью флуоресцентного сканера. ИзмерьтеКоличество каждой изоформы сплайсинга с использованием денситометрического программного обеспечения.

7. Используйте ESF для модуляции эндогенного сплайсинга Bcl-x и измерения его влияния на апоптоз

1. Пластину 2 х 10 ⁵ клеток HeLa в каждую лунку 24-луночного планшета. Выращивают клетки в течение ночи в 500 мкл DMEM, дополненной 10% FBS, в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ .
2. Через 12 часов трансфектируют клетки 2 мкг pGL-Gly-PUF (WT) или 0,2 мкг, 1 мкг и 2 мкг pGL-Gly-PUF (531) (перепрограммированный PUF-домен, который распознает преклинический Bcl- МРНК с высоким сродством, см . Фиг. 2A ).
3. Через 24 часа собирают клетки. 1/3 клеток для выделения РНК и ПЦР-анализа (этапы 6.8-6.17) и 2/3 предназначены для выделения белка.
4. Для анализа методом вестерн-блоттинга кипятите полные гранулы клеток в загрузочном буфере 2X додецилсульфат-полиакриламидный гель для электрофореза (SDS-PAGE) в течение 10 мин, А затем решить протеины в 12% геле SDS-PAGE. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.
5. Блок мембраны с 5% молока в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировать мембраны O / N с каспазы-3 (1: 1,000), PARP (1: 1,000), или бета-актина (1: 5000), первичные антитела (разбавленный в 5% молока) при 4 ° С.
6. Промывают мембрану с ФБР, содержащим 0,1% Tween 20 (PBS-T) в течение 5 мин при RT 3x на ротационном шейкере. Инкубируйте мембрану с ПМ-связанными антителами (1: 5000, разбавленную в 5% молоке) в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Промывают мембраны с PBS-T 3x при комнатной температуре, а затем разрабатывает мембрану с помощью ECL-реагентов западных промокательного обнаружения.
8. Добавьте 250 мкл поли-L-лизин (PLL) на покровные, инкубировать их в течение 15 мин при комнатной температуре, а также откачивать жидкость. Промывают ФАПЧ-покрытием покровные стекла с PBS 3 раза в течение 5 мин каждый. Для измерения иммунофлюоресценции анализа апоптоза, семян 5 х 10 ⁵ HeLa клеток на поли-лизин-покрытием покровные стекла в 6-луночный планшет. трансфекцию рGL-Гли-ППА (WT) или PGL-Гли-ППА (531) плазмиды в клетки HeLa с использованием липосомального реагента для трансфекции (см шагов 6.1 - 6.5).
9. Через 24 часа после трансфекции, клетки фиксируют на покровные с 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: ПФ токсичен; обращаться с осторожностью в вытяжном шкафу.
10. Осторожно промыть клетки на покровные путем добавления 2 мл 1x PBS. Выдержите их в течение 5 мин. Удалить PBS с пипеткой. Повторите промывку 3x.
11. Клетки проницаемыми с 0,2% Тритона Х-100 в 1x PBS в течение 10 минут, а затем промыть их 3x с 1x PBS.
12. Блок-клетки с 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS 1x в течение 10 мин и промыть их 3x с 1x PBS.
13. Развести FLAG антитела 1: 1000 в 3% BSA / PBS и пипеткой 30 мкл разведенного антитела FLAG на парафильмом листа.
14. Вынуть покровное с клетками, тщательно высушить избыток буфера с лабораторными салфетками, и поставить его вверх-вниз (клетка на стороне вниз) на 30 мкл анти-FLAG секolution. Выдержите его в течение 1 ч при комнатной температуре.
15. Добавляет приблизительно 500 мкл PBS 1x в сторону покровного инкубировали с первичным антителом до тех пор, пока покровные плавает на поверхности раствора. Возвращение его к 6-луночного планшета с 1x PBS в лунки.
16. Промыть это 3x с 1x PBS в течение 5 мин каждый.
17. Развести анти-мыши вторичного антитела (1: 500) в 3% BSA / PBS; опять же, использовать 30 мкл каждого покровное. Поместите покровное вверх-вниз на растворе вторичного антитела и инкубировать ее в течение 15 мин при комнатной температуре.
18. Удалить покровную от парафина, как описано в шаге 7.15. Поместите его обратно в 6-луночный планшет и промыть его с 1x PBS 3x в течение 5 мин каждый.
19. Установить покровные с монтажной средой (с DAPI), удалить избыток среды, и запечатать края с лаком для ногтей.
20. Визуализация клеток с помощью флуоресцентного микроскопа (при 100-кратном увеличении) и сфотографировать их с помощью цифровой камеры.
    Примечание: Выражение ESF визуализируются с помощью флуоресцентных этикетокд вторичное антитело против FLAG тега, а ядерная фрагментация визуализировали с использованием DAPI окрашивания.

8. Измерьте апоптоз различных раковых клеток, экспрессирующих ESF

1. Split 2 х 10 ⁶ HeLa клетки, клетки MDA-MB-231 и А549 клеток в 60-мм чашки с 4 мл среды DMEM с добавлением 10% FBS в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО ₂ для обнаружения апоптоза с Пропидиум йодид (PI) окрашивание.
2. Через 24 часа обновить среду и подготовить лентивирусы, как сообщалось ранее ^24.
3. Развести 10 х 10 ⁶ Лентивирус pWPXld-Гли-ППУ (WT), pWPXld-Гли-PUF (531), или pWPXld-GFP запасов в 4 мл свежей среды , чтобы соотношение количества вируса к числу клеток , равным 5.
4. Изменение среды в пластинах 4 мл вируса , содержащей среду , полученной на стадии 8.3 , и инкубируют планшеты в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO _2. 12 ч после заражения, изменения среды.
5. Через 24 ч после инфекции, сбора и окрашивания клеток в течение 5 мин в растворе PBS, содержащем конечную концентрацию 2 мкг / мл PI.
6. Анализ PI-окрашенных клеток с проточной цитометрии, как описано ранее ^16.

Этот отчет описывает полный протокол для проектирования и строительства ESFS и сращивания репортеров. Он также описывает дальнейшее применение ESFS в манипулировании AS эндогенных генов ^16. Чтобы проиллюстрировать типичные результаты ФЭБ-опосредованные изменения сплайсинга, мы используем данные из нашей предыдущей работы в качестве примера. В ESFS с различными функциональными доменами может быть использован для содействия или ингибировать включение целевой кассеты экзона (Рисунок 1 D & Е). ESFS может также влиять на использование альтернативных сайтов 5' и 3' сплайса в системе репортера (Рисунок 1 F & G).

Альтернативный сплайсинг эндогенного гена также может быть специально регулируются с дизайнером ESFS. Мы показали это приложение по спецификацииifically ориентации Bcl-X, которые могут быть соединены на две антагонистические изоформ с альтернативными сайтов 5' сплайсинга. Мы разработали ESF, Gly-ППУ (531), который распознает РНК элемент 8-нта между альтернативными 5' сайтами сплайсинга. Этот Гли-ППА (531) специфический сдвинут сплайсинг к производству Bcl-Xs (Рисунок 2 A). После трансфекции Gly-ППУ (531) в клетки HeLa, уровень Bcl-Xs изоформ и Bcl-Xs белков увеличился в зависимости от дозы, тогда как в контрольной ESF, Гли-ППУ (WT), не влияет на соотношение из Bcl-Xs с Bcl-XL (Рисунок 2 B & C). Кроме того, разработчик ФЭБ может вызвать расщепление каспазы 3 и поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP), два хорошо известных молекулярных маркеров апоптоза (Рисунок 2 D). Как и следовало ожидать, дизайнер ESFS преимущественно локализованы в ядрах трансфецированных клеток, демкиnstrated с помощью иммунофлюоресценции микроскопии (рис 2 Е). Последовательно, сдвиг сплайсинга с помощью Gly-ППУ (531) в результате фрагментации ядерной ДНК, что свидетельствует о том , что эти клетки претерпевают апоптоз (рисунок 2 E). Увеличение апоптотических клеток было дополнительно подтверждено путем изучения более 200 клеток из произвольно выбранных полех и количественной оценки процента клеток с фрагментированной ядерной ДНК (рисунок 2 F).

Рисунок 1: Проектирование ESFS и их активность в модулирующем пропуске экзонов. (А) Специфическое связывание между доменом и РНК мишеней ППУ иллюстрируется с РНК-ППУ структуры и принципиальной схемы. ППУ связывания кода для каждого изЧетыре основания РНК, показаны справа с разными цветами, используется для проектирования PUF мутации. (В) Блоке - схему для получения заказной домен ППЫ. ППА, который признает «UGUAUAUA» была использована в качестве примера. 4-круглая стратегия ПЦР используют для сборки ППУ леску с настраиваемым РНК-связывающего специфичности (цвет кодируется так же, панель А). В первом раунде, серия ПЦР-праймеров, которые включают желаемые коды РНК-распознавания для двух соседних ППУ повторов используются для генерирования четырех фрагментов, которые включают восемь РНК-распознавания кодов полного ППУ белка (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6 и R7 / R8). Фрагменты Cap, кодирующие сигнал ядерной локализации N-концевой, С-концевой стоп-кодон, и фрагменты моста также производятся отдельно (5'-конец и 3'-концевой колпачок, мост 2/3, 4/5 мост, и мост 6 / 7). Во втором туре, новые шаблоны генерируются путем смешения перекрывающихся фрагментов , кодирующих смежные повторы с соответствующим мостом (например, перемешивание R1 / R2,R 3 / R 4, и мост 2/3 генерирует шаблон для R1 - 4), а затем расширение с помощью ДНК-полимеразы, чтобы заполнить пробелы. Точно так же, третий раунд присоединяется к R1-4, R5-8, и мост 4/5. Наконец, четвертый раунд добавляет 5'-конца и 3'-концевых колпачки домена ППЫ вместе с клонированием сайтами для последующего клонирования в экспрессирующие векторы. (C) Модульная организация домена ESFS. ESFS управляются ЦМВ промоторов (стрелки) и кодируют, от N- к С-концу: а ФЛАГ эпитоп (для обнаружения ESFS), функциональный модуль (а Gly-богатых доменов или домена RS), с ШПС (содействие ядерной локализации ESFS) и домен РНК-распознавание (а ППА домен). Nhe I и BamHI - я предназначены для вставки функционального модуля, в то время как Xba I и Sal I предназначены для вставки домен РНК-распознавания. (D) , К-ППА ESFS является совместной экспрессией с экзоном пропуском репортерами, и картину сплайсинга анализировал с помощью RT-PCR. Модифицированная ППА и ППА ^б специфически связывается с 8-членными мишенями А и В, соответственно (в одних и тех же цветах). Все комбинации используются, так что ППА-мишень пар разного цвета служит в качестве контрольных. Эффекты RS-ППУ на пропуск экзонов (E), конкурирующий сайта сплайсинга (F), или конкурирующий 3' сплайс сайт репортер (G) , 5' анализировали методами , сходными с панелью D. Данные RT-PCR взяты из Wang и др. ^16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Регулирование эндогенного Bcl-X пре-сплайсинга мРНК с ESFS. (А) Схема альтернативного сплайсинга эндогенного BcLx пре-мРНК. Два альтернативных 5'-сайтов сплайсинга в экзоне 2 Bcl-x используются для генерации двух изоформ разных размеров, Bcl-xL и Bcl-xS. Последовательность UGUGCGUG между двумя 5'-сплайс-сайтами выбрана в качестве цели ESF, и WT PUF повторяет 1, 3 и 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S), перепрограммированы (звездочки), чтобы распознать эту целевую последовательность. Полученный ESF, содержащий Gly-богатый домен, ингибирует использование нисходящих 5 's (обозначенных красной стрелкой). ( B ) Модуляция использования Bcl-x 5. Различные количества экспрессирующей конструкции Gly-PUF (531) трансфицируют в клетки HeLa. В качестве контроля используется Gly-PUF (WT). Две изоформы Bcl-x обнаруживают с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, соответствующих экзонам 1 и 3 гена Bcl-x. Процент изоформы Bcl-xS количественно определяют и показывают внизу. ( C ) ESF влияют на уровни экспрессии Bcl-xL и Bcl-xS. Образцы загружаются в том же порядке, что и на панели B, и все белки arе детектируется вестерн-блоттинга. Выражение ESFS детектируют с помощью анти-FLAG антитела, а уровень тубулина используются в качестве контроля. (D) , различные количества экспрессирующих конструкций ФЭБ трансфицировали в клетки HeLa, что приводит к расщеплению PARP и каспазы 3. Образцы обнаруживаются с помощью Вестерн - блот 24 ч после трансфекции. Уровень актина обнаруживается в качестве контроля. (E) субклеточная локализация ESFS в трансфицированных клетках HeLa обнаруживается иммунофлюоресценция микроскопия с анти-FLAG антителом. Клетки совместно окрашивали DAPI, чтобы показать ядра. Некоторые ядра, особенно в клетках, трансфицированных Gly-ППУ (531), раздроблены вследствие апоптоза. Шкала бар: 5 мкм. (F) Процент апоптотических клеток (т.е. клеток с фрагментированной ядерной ДНК) измеряется от случайно выбранных полей флуоресцентной микроскопии изображений. Столбики показывают среднее значение, в то время как точки указывают данные из двух экспериментов. цифраS изменены из нашего предыдущего отчета Wang et al. ¹⁶ в соответствии с политикой издательской группы Nature. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Этот отчет содержит подробное описание для проектирования и строительства искусственных факторов сплайсинга, которые могут специально манипулируют альтернативный сплайсинг гена-мишени. Этот метод использует преимущества уникальной РНК связывающим режиме ППУ повторяет для получения РНК-связывающие помост с настраиваемым специфичностью. Он может быть использован либо активировать или подавлять сплайсинг.

Важный шаг в этом протоколе является генерацией reprogramed ППУ домена, который определяет специфичность ESFS. Протокол сшивания ПЦР был разработан и оптимизирован для быстрой генерации каркаса ППУ. Ключ для его успеха регулировать соотношение различных перекрывающихся шаблонов до 1: 1: 1. Очистки продуктов ПЦР после каждого раунда также имеет важное значение, так как неочищенные продукты могут иметь грунтовочного загрязнение от последнего раунда. Еще один важный шаг для анализа соотношение сплайсинга с использованием полуколичественного ОТ-ПЦР. В общем, тоже человекциклов амплификации у следует избегать, так как они могут насытить реакции ПЦР. В наших экспериментах с коэкспрессией сплайсинга репортера, 20 - 25 циклов обычно используются, но это может варьироваться в зависимости от избытка мРНКа при измерении сплайсинга эндогенных генов. При количественной оценке сплайсинга изоформы с использованием новой пары праймеров, мы предлагаем калибровки эксперимент ПЦР каждый раз, как описано выше ^16.

Потенциальным ограничением с дизайнером ESFS является их вне целевых эффектов, поскольку специфичность определяется количеством повторов в ППУ эшафот. Дикий тип ППА распознает сайт 8-нта, что сравнимо со спецификой с миРНК, который признает свою цель через «матч семян.» Однако, поскольку любая последовательность 8-нт может произойти один раз случайно в стенограмме 65000 нт длиной (4 ⁸ = 65536), будут и другие транскрипты офф-мишени , распознаваемые дизайнерского ППУ. Офф-мишень эффЭСТ может быть уменьшена с помощью ФОП с дополнительными повторами; Однако, это еще полезно, чтобы оценить специфичность и внедорожной цели эффекты ESFS. Для того, чтобы свести к минимуму возможные пределы целевых эффектов, выражение комбинации нескольких ESFS дизайнера на более низком уровне, также может быть осуществлен. В таком случае, отходящие-целевые гены не могут влиять на низком количестве ESFS, в то время как сращивание реальной цели будет зависеть от множества ESFS, которые функционируют синергический. Это решение аналогично тому, что исследователи использовали в генной глушителей с RNAi, где объединенные миРНК (каждый при пониженной концентрации), которые нацелены на множественные сайты одной мРНК может уменьшить вне целевых эффектов.

Другой основной способ манипулировать AS заключается в использовании антисмысловых олигонуклеотидов, что пары с определенными регионами пре-мРНК. По сравнению с этим существующим способом, то ESFS может вызвать длительное воздействие в стабильно трансфецированных клетках. Кроме того, в естественных условиях доставки ESF может воспользоваться увеличением арсенала векторов генной терапии, в то время как в естественных условиях доставки антисмысловых олигонуклеотидов очень трудно контролировать. Кроме того, этот метод может избежать сложных и дорогостоящих модификаций олигонуклеотидов. Используя различные индуцируемые промоторы, более точный контроль экспрессии ФЭБА в правильных типах клеток и в правильное время также может быть достигнут. Основным недостатком этого способа является относительно низкая специфичность (сайт узнавания 8-нт по сравнению с сайтом распознавания с 16- до 20-нт в типичных антисмысловых олигонуклеотидов).

Дисрегуляция альтернативного сплайсинга приводит к развитию многих заболеваний, в том числе рака ^{26, 27.} Геномная шириной исследование показало более 15000 опухолеассоциированных варианты сплайсинга в различных типах рака ^{28, 29, 30.} Например, интронныеМутации участка сплайсинга генов-супрессоров опухолей часто вызывают события пропуска экзона и производят аберрантные белки, которые могут способствовать возникновению опухоли ^{26 , 31 , 32} . Более того, некоторые факторы сращивания оказываются сверхэкспрессируемыми во многих типах рака, что способствует трансформации клеток ^{33 , 34} , что указывает на то, что факторы сращивания также могут играть важную роль в биогенезе рака. Таким образом, помимо предоставления полезного инструмента для модуляции функции гена, манипуляции сплайсинга с дизайнерскими ESFs могут восстановить нерегулируемые события сплайсинга при раке, таким образом обеспечивая потенциальный терапевтический инструмент. Кроме того, путем слияния домена PUF-дизайнера с различными функциональными доменами можно разработать несколько искусственных факторов, которые манипулируют различными процессами метаболизма РНК. Например, слияние трансляционного активатора (GLD2) или трансляционного представителяressor (CAF1) с доменом ППУ производства новых факторов , которые могут активировать или ингибировать мРНК перевода ^27. Используя ту же самую основную дизайн, мы объединили неспецифический домен РНК - эндонуклеазы (PIN) с серией конструктора ППУ доменов , чтобы генерировать искусственный сайт-специфические эндонуклеазы РНК (ASREs) , которые функционируют аналогично ограничению ДНК ферментов ^17.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантом NIH R01-CA158283 и грантом 31400726 NSFC для ZWYW, финансируется Программой талантов молодых тысяч и Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 31471235 и 81422038). XY финансируется научным фондом постдокторантов Китая (2015M571612).