Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

Este relatório descreve um método de bioengenharia para conceber e construir novos factores de splicing artificial (ASFS) que modulam especificamente a splicing de genes alvo em células de mamífero. Este método pode ser expandido para manipular vários fatores artificiais para manipular outros aspectos do metabolismo do ARN.

O processamento da maioria dos ARNs eucarióticos é mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) com configurações modulares, incluindo um módulo de reconhecimento de ARN, que se liga especificamente ao alvo pré-ARNm e a um domínio efector. Anteriormente, tomamos vantagem do modo de ligação de ARN único do domínio PUF em Pumilio 1 humano para gerar um andaime de ligação de ARN programável, que foi utilizado para criar várias RBPs artificiais para manipular o metabolismo de ARN. Aqui, descreve-se um protocolo detalhado para construir Factores de Splicing Engineered (ESFs) que são especificamente concebidos para modular o splicing alternativo de genes alvo. O protocolo inclui como conceber e construir um andaime PUF personalizado para um alvo de ARN específico, como construir um plasmídeo de expressão de ESF fundindo um domínio PUF de design e um domínio efector, e como utilizar ESFs para manipular o empalme de genes alvo. Nos resultados representativos deste método, descrevemos também os ensaios comunsdas actividades do FSE utilizando repórteres de splicing, a aplicação de FSE em células humanas em cultura, e o subsequente efeito de alterações de splicing. Ao seguir os protocolos detalhados neste relatório, é possível projetar e gerar ESFs para a regulação de diferentes tipos de splicing alternativo (AS), proporcionando uma nova estratégia para estudar regulação do splicing ea função de diferentes isoformas de splicing. Além disso, através da fusão de diferentes domínios funcionais, com um domínio PUF concebidos, os investigadores podem engendrar fatores artificiais que têm como alvo RNAs específicos para manipular vários passos de processamento do ARN.

A maioria dos genes humanos sofrer splicing alternativo (AS) para produzir múltiplas isoformas com actividades distintas, o que tem aumentado grandemente a complexidade de codificao do genoma ^{1, 2.} AS fornece um importante mecanismo para regular a funo do gene, e que é fortemente regulada através de diversas vias celulares em diferentes estágios de desenvolvimento e ^{3, 4.} Porque splicing desregulação é uma causa comum de doenças humanas ^{5, 6, 7, 8,} segmentação regulação de splicing é a tornar-se um percurso terapêutico atractivo.

De acordo com um modelo simplificado de regulação de splicing, como é controlada principalmente por splicing Regulatory cis -Elements (SRE) em pré-ARNm que funcionam como intensificadores de splicing ou silenciadores de exs alternativos. ºEstas SREs recrutam especificamente vários fatores de proteína de transação ( isto é, fatores de splicing) que promovem ou suprimem a reação de splicing ^{3 , 9} . A maioria dos fatores de splicing em trans tem domínios de ligação de ARN específicos de seqüência separados para reconhecer seus alvos e domínios efetores para controlar splicing. Os exemplos mais conhecidos são os membros da família de proteínas ricas em serina / arginina (SR) que contêm Motivos de Reconhecimento de RNA N-terminais (RRMs), que se ligam a intensificadores de empasamento exónico e domínios RS C-terminais, que promovem a inclusão de exões ¹⁰ . Inversamente, o hnRNP A1 liga-se a silenciadores de empacotamento exónico através dos domínios RRM e inibe a inclusão do exão através de um domínio rico em glicina C-terminal ¹¹ . Usando tais configurações modulares, os pesquisadores devem ser capazes de criar fatores de splicing artificial combinando um domínio de ligação a RNA específico (RBD) com diferentes efetor domínios que activam ou inibem a splicing.

A chave de um tal desenho é a utilização de um RBD que reconhece dado alvos com especificidade de ligação de ARN programável, que é análogo ao modo de ligação do ADN do domínio história. No entanto, a maioria dos factores de splicing nativas conter RRM ou K Homologia (KH), que reconhecem os domínios elementos de ARN curtos com afinidade fraca e, portanto, carecem de um "código de" reconhecimento de ARN-proteína de previsão ^12. O RBD de proteínas de repetição de PUF (isto é, o domínio PUF) tem um modo de reconhecimento de RNA original, permitindo a remodelação de domínios de PUF para reconhecer especificamente ARN de diferentes alvos ^{13, 14.} O domínio PUF canónica contém oito repetições de três hélices a, cada um reconhecendo um único base num alvo de ARN 8-nt. As cadeias laterais de aminoácidos em certas posições das ligações de hidrogénio específicas segunda forma α-hélice com a borda de Watson-Crick de tele ARN base, que determina a especificidade de ligao de ARN de cada repetição (Figura 1A). O código de reconhecimento de ARN de base da repetição PUF é surpreendentemente simples (Figura 1A), permitindo a geração de domínios de PUF que reconhecem qualquer combinação de 8-base de possível (revisto por Wei Wang e ^15).

Este princípio de construção modular permite a geração de um Factor de Splicing Engineered (FSE) que consiste de um domínio PUF personalizado e um domio de modulao de splicing (isto é, um domínio SR ou um domínio Gli-rico). Estes ESF pode funcionar como activadores de splicing ou como inibidores para controlar vários tipos de eventos de splicing, e que provaram ser úteis como ferramentas para manipular o splicing de genes endógenos relacionados com a doença humana ^{16, 17.} Como um exemplo, nós construímos ESF-Gli-tipo PUF para alterar especificamente o splicing do gene de Bcl-x, Convertendo a isoforma longa anti-apoptótica (Bcl-XL) ao curto isoformas pró-apoptótica (Bcl-XS). Mudando a relação entre a Bcl-x isoforma foi suficiente para sensibilizar várias células cancerosas a múltiplas drogas de quimioterapia anti-cancro ^16, sugerindo que estes fatores artificiais podem ser úteis como reagentes terapêuticos potenciais.

Além de controlar o splicing com domínios splicing efectoras conhecidos (por exemplo, um cabo RS ou domínio Gli-rica), os factores de PUF modificados também podem ser utilizados para examinar as actividades dos novos factores de splicing. Por exemplo, utilizando esta abordagem, que demonstraram que o domínio C-terminal de vias proteas SR pode activar ou inibir o splicing quando se ligarem a diferentes regiões pre-mRNA ^18, que o motivo rico em alanina de RBM4 pode inibir o splicing ^19, e que o motivo rico em prolina de DAZAP1 pode melhorar splicing ^{20, 21 <}/ Sup>. Estes novos domínios funcionais podem ser utilizados para construir os tipos adicionais de fatores artificiais para afinar o splicing.

1. Construção de um andaime de PUF com especificidade de ligação a ARN personalizada por sobreposição de PCR

1. Desenhar uma série de iniciadores de PCR contendo as sequências de PUF que reconhecem especificamente diferentes nucleótidos de ARN em cada posição ¹² (ver Tabela 1 para as sequências de iniciadores e ver a Figura 1A para o código de reconhecimento RNA: PUF). Para cada repetição de PUF, projete quatro primers diferentes para reconhecer uma base diferente em cada posição.
   NOTA: Estes iniciadores serão utilizados numa série de quatro rondas de reacções de PCR para gerar fragmentos de PUF que estão ligados entre si ( Figura 1 B ).
2. Selecione o local de reconhecimento do gene alvo próximo ao local de emenda alternativo.
   NOTA: Este site pode ser decidido pelo usuário, e ele geralmente é escolhido dentro de 10 - 50 nt dos sites alternativos de emenda.
3. Rodada 1: Gerar seqüências de codificaçãoPara 4 repetições de PUF, fragmentos de ponte universal e fragmentos de tampa.
   1. Use o site de destino para definir o código de reconhecimento para cada repetição do PUF personalizado. Selecione o conjunto de iniciadores de PCR para repetições de PUF 1 - 8. Realize quatro rodadas consecutivas de PCR para produzir um domínio PUF personalizado, conforme descrito abaixo ( Figura 1B ).
   2. Na primeira fase de PCR, preparou-se misturas de reacção de PCR padrão (contendo 2,5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de dNTP 10 mM, 0,5 μL de iniciadores directos e inversos 10 μM, 50 ng do molde de ADN (cDNA humano ou vector de expressão De domínio PUF de WT) e ADN-polimerase de alta fidelidade de 0,5 U num volume final de 25 μL).
      NOTA: Estas reacções irão produzir sequências de ADN correspondentes a cada repetição de PUF, a fragmentos de ponte universal e a dois fragmentos de tampão com diferentes locais de restrição ( Figura 1B ). Uma breve lista de modelos, primers, E os produtos de PCR gerados utilizados nesta etapa são mostrados na Tabela 2 .
   3. Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 15 s a 72 ° C; E 5 min de incubação a 72 ° C. Use polimerase de DNA de alta fidelidade para minimizar as mutações pontuais durante a PCR.
4. Rodada 2: Gerar sequências de codificação para R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) e R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
   1. Separar os produtos de PCR obtidos no passo 1.3.3 utilizando electroforese com um gel de agarose a 1,5% (25 min a uma tensão constante de 120 V). Gel-purificar todos os produtos do tamanho esperado usando um kit de purificação de gel. Use uma mistura diferente destes produtos como o modelo nas seguintes rodadas de PCR.
      NOTA: Misture os três produtos de PCR em uma proporção aproximadamente 1: 1: 1. Eles normalmente não precisam ser quantificados, desde que a intensidade de cada produto pareça semelhante no gel.
   2. Mistura-se cerca de 5% dos produtos de PCR purificadosplaca no próximo ciclo de PCR. Alternativamente, quantificar os produtos de PCR purificados usando um espectrofotómetro de UV-Vis e empregar-se 15 ng de cada produto de PCR na mistura molde.
   3. Use produtos de PCR purificados R1 / R2, R3 / R4, e ponte 2/3 modelos mistos ou R1-R4 e F-R como iniciadores. Defina-se a reacção de PCR tal como descrito no passo 1.3 para obter produto de PCR de sobreposição R1 - 4.
   4. Use produtos de PCR purificados R5 / R6, R7 / R8, e Ponte 6-7 como modelos mistos e R5-R8-F e R como iniciadores para PCR de sobreposição obter produto R5-8 (Figura 1 B). Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, e 30 s a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C. Gel-purificar R1-4 e R5-8.
5. Ronda 3: Gerar sequências de codificação para R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 sem tampas).
   1. No terceiro ciclo de PCR, utilizando o R1-4 purificada, R5-8, e Ponte 4/5 modelos mistos ou R1-F eR8-R como iniciadores, configurar a reacção de PCR como descrito no passo 1.3 para obter o produto de PCR sobreposto R1-8 sem tampas.
   2. Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 55 s a 72 ° C; E 5 min a 72 ° C. Gel-purificar o R1-8 sem tampas.
6. Rodada 4: Gerar seqüências de codificação para domínios PUF completos.
   1. Na última ronda de PCR, utilizando o R1-8 purificado sem tampas e as tampas de extremidade 5 'e 3' como modelos misturados e Cap-F e Cap-R como iniciadores, configurar a reacção de PCR como descrito no passo 1.3 Para obter os domínios PUF mutados finais.
   2. Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; E 5 min a 72 ° C.
   3. Purificar com gel os produtos de PCR dos domínios de PUF reprogramados finais. Utilize estes produtos para a construção do plasmídeo de expressão de ESF nas etapas subsequentes. Sequrência a construo final para verificar as sequências de domínios reprogramadas PUF.
      NOTA: Cap-F codifica NLS (PPKKKRKV) entre BamH I e Xba I e Cap-R codifica um codão de terminação e local Sal I (os locais de restrição foram concebidos para a construo de vectores de express de ESF, a Figura 1 C).

2. Construção de um módulo funcional de ESFs

1. Duas estratégias são comumente usados ​​para clonar os módulos funcionais de ESF (domínios RS ou domínios Gli-ricos): para amplificar estes domios por PCR, utilizando ADNc humano total, como um molde (passo 2.2) ou para sintetizar directamente os fragmentos de DNA que codificam para diferentes RS ou domínios Gli-ricos (passo 2.3).
2. Uso de PCR para clonar domínios RS partir de resíduos de 123 - 238 de 9G8 (NP001026854), resíduos 180-272 de SRP40 (NP008856), ou os resíduos 117 - 221 da SC35 (NP003007). Clonar domínios Gli-ricas a partir de resíduos 195-320 de hnRNP A1 (NP_002127), resíduos 203-353 de PRNhn A2 (NP112533), ou os resíduos 211 - 378 da hnRNP A3 (NP919223).
   1. Use a ferramenta de design cartilha NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ou Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) para projetar primers para clonagem de domínios ou domínios RS Gli-ricos (módulo funcional de ESF).
      NOTA: O iniciador directo cont uma etiqueta FLAG N-terminal após o local Nhe I. O iniciador inverso contém um local BamHI para clonagem em vectores de express (Figura 1 C).
   2. Defina-se a reacção de PCR convencional, tal como descrito na etapa 1.3, para amplificar as RS ou domínios Gli-ricos. Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, e 30 s a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C.
3. Clone RS domínios, ou domínios Gli-ricos através da síntese directa do ADN. Em vez de gerar produtos de PCR que codificam para os domínios efectores na etapa 2.2, syntheDimensionar um oligonucleótido que codifica um domínio RS de fragmento curto (RSRSRSRSRSRS) ou um domínio rico em Gly (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) utilizando uma fonte comercial de oligonucleótidos de ADN.

3. Construção de plasmídeos de expressão do FSE

1. Construir plasmídeos de expressão de ESF utilizando qualquer vector de expressão.
   NOTA: Utilizou-se originalmente uma construção de expressão pGL-Gly-MS2 (uma dádiva do Dr. R. Breathnach do Instituto de Biologia-CHR ¹¹ ), que codifica a partir do N-terminal C-terminal, um epítopo FLAG, um Gly Ricos de hnRNP A1, e a proteína de revestimento MS2. Por conseguinte, esta construção de expressão é utilizada como um exemplo no passo seguinte.
   NOTA: Outros vectores de expressão com múltiplos locais de clonagem também podem ser utilizados, e as etapas de clonagem padrão serão aplicadas para juntar os fragmentos.
2. Digerir 1,5 μg dos plasmídeos de expressão (pGL-Gly-MS2) mencionados no passo 3.1 para remover o fragmento de proteína de revestimento MS2. Use a restriçãoção endonucleases BamHI e Sall, durante 1 h a 37 ° C. Digerir o módulo de reconhecimento de ESF (que codifica para um NLS e reprogramado domínios de PUF, gerados no passo 1.5) com BamH I e Sal I na mesma condição.
3. Adicionar corante de carga de 5x para a digestão de restrição e reacções de electroforese lentamente o volume total com um gel de agarose a 1,5% contendo uma mancha de ADN de gel durante 40 min a 120 V. Gel-purificam os produtos digeridos.
4. Preparar 10 uL reacções de ligação com um módulo de reconhecimento purificada de inserções FSE e ADN do vector de expressão, em uma proporção de 3: 1, 1 ul de DNA-ligase, e 1 uL de tampão de ligação 10x. Incubar as reacções de ligação a noite a 4 ° C; a construção resultante exprime uma PUF-Gly-tipo FSE (pGL-Gli-PUF) sob o controlo de um promotor de CMV (Figura 1 C).
5. Remover o fragmento que codifica o domínio rico Gli-FLAG / com Nhe I e BamHI digestão durante 1 h a 37 ° C. Substituí-la com um fragmento que codifica o domínio de RS (gerado na etapa 2.2, também digerido por Nhel e BamHI); a construção resultante exprime uma PUF-tipo RS FSE (Figura 1 C).

4. Construção do Reporter emenda

1. Sintetizar oligonucleótidos contendo as sequências candidatas (ou seja, as sequências alvo de domínios de PUF) flanqueadas por Xho I e Apa I locais ou sítios Xho I e Eco RI. Recozer os oligonucleótidos para 5 min a 55 ° C para se obter pastilhas de cadeia dupla contendo os sítios de reconhecimento de domínios de PUF flanqueado pelas extremidades coesivas de Xho I e Apa I ou sítios Xho I e Eco RI.
2. A partir de um repórter splicing modular anteriormente descrito ^22, pGZ3, que contém dois exões GFP, separadas por um exão de teste (exão 12 do IGF2BP1 humano, Ensembl ID ENSG00000159217) e os seus intrões flanqueadores.
   NOTA: O exão de teste foi manipulado com locais Xho I e Apa I, que podem ser utilizados para inserir oligonucleótidos sintetizados contendo as sequências candidatas (sequências alvo de domínios PUF). Este repórter de emenda modular (pGZ3) é fornecido através do repositório de plasmídeos Add-gene.
3. Digerir o repórter de base pGZ3 (preparado no passo 4.2) com as endonucleases de restrição Xho I e Apa I durante 1 h a 37 ° C.
4. Gelar-purificar os produtos digeridos como descrito no passo 3.3.
5. Preparar 10 μL de reacções de ligação com as inserções de cadeia dupla geradas no passo 4.1 e o vector pGZ3 digerido gerado no passo 4.4 numa proporção molar de 3: 1, 1 μL de ADN ligase e 1 μL de tampão de ligação 10x. Incubar as reac�es de liga�o de um dia para o outro a 4� para obter o vector rep�ter pGZ3 de empacotamento de constru�o.
6. Insira as inserções de cadeia dupla geradas no passo 4.1 norepórteres publicados, Pez-1B (usando Xho I e EcoR I locais) e Pez-2F (utilizando Xhol e Apal locais) ^23, para se obter o competindo 5' repórter ss e a competir 3' repórter SS, conforme descrito nas etapas 4,3-4,5.
   NOTA: Ambos os tipos de repórteres de emenda estarão disponíveis através de Add-gene.

5. Construção de Lentivirus vetores de expressão para ESF

1. Defina-se a reacção de PCR convencional como descrito no passo 1.3 para amplificar as ESF de comprimento completo a partir dos vectores de expressão originais (PGL-Gli-PUF ou PGL-RS-PUF) com iniciadores contendo MluI / SpeI locais. Definir o programa de PCR como se segue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 1,5 min a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C.
2. Através de uma reacção de digestão, purificação com gel, e reacção de ligação, integrar as ESF no vector de expressão de lentivírus, pWPXLd, entre o Mlu Sítios I / Spe I, conforme descrito nos passos 3.2-3.4.
3. Utilizar o método padrão de precipitação com fosfato de cálcio, conforme referido anteriormente ²⁴ , para gerar lentivírus por cotransfecção de células HEK293T por empacotamento dos vectores psPAX2 e pMD2.G, quer com pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF Pt) (como um controlo de especificidade), ou pWPXLd-GFP (mock).
   1. Semear 5x10 ⁶ células HEK293T em placas de 10 cm e fazer crescer as células durante a noite em 10 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) por placa em uma incubadora humidificada a 37 ° C e 5% . Realizar a transfecção quando as células são 70 - 90% confluentes.
   2. Preparar a mistura plasmídica adicionando os três plasmídeos (7,5 μg do vector de embalagem, psPAX2, 2,5 μg de pMD2.G e 10 μg de pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (peso) , Ou pWPXLd-GFP) a um tubo de 2 mL.
   3. Adicionar 560 μL de CaCl 0,25 M2 e 560 mL de solução 2x da BBS para o tubo de 2 mL. Misturar suavemente várias vezes e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente para preparar a mistura de transfecção.
   4. Adicionar todas as misturas de transfecção para as placas de 10 cm. Agitar suavemente as placas e incubar-los durante a noite a 3% de CO ₂ e 37 ° C.
   5. Remover o meio, adicionar 10 ml de DMEM fresco com 2% de FBS a cada prato, e incubar-los em 10% de CO ₂ e 37 ° CO / N.
   6. Recolher o primeiro sobrenadante dos pratos. Adicionar 10 ml de DMEM fresco com 2% de FBS a cada prato. Incubar os pratos de O / N a 10% de CO ₂ e 37 ° C. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C.
   7. Recolhe-se o segundo sobrenadante a partir dos pratos. A piscina do sobrenadante a partir da primeira e segunda safras. Limpar o sobrenadante de restos de células por filtração através de um filtro de 0,4? M. Utilizar o sobrenadante clarificado directamente ou armazená-lo a -80 ° C.
4. Determinar o título do lentivírus infectando HEK293T células com diluições em série da preparação de vírus, tal como previamente relatado ^25.

6. Especificamente modulação Inclusão Exon eo uso alternativo de Sites Splice com ESFs

1. Semente 2 x 10 ⁵ culas HEK293T em cada poço de uma placa de 24 poços. Crescer as células durante a noite em 500 ul de DMEM suplementado com FBS a 10% numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Mistura-se o reagente de transfeco lipossomal, invertendo suavemente os frascos antes da utilização. Diluir 2 mL de reagente de transfeco lipossomal em 50 uL de meio de soro reduzido. Misturar suavemente e incuba-se-lhes, durante 5 min à TA.
3. Dilui-se 0,04 g de vectores de expressão de PGL-Gli-PUF e 0,2 ug de plasmídeos repórter pGZ3 em 50 uL de meio de soro reduzido em um tubo estéril. Dilui-se 0,4 ug de vectores de expressão de PGL-RS-PUF e 0,2 ug de plasmídeos repórter pGZ3 em 50 uL de meio de soro reduzido em um tubo estéril. Dilute 0,4 ug de vectores de expressão de PUF PGL-RS-e 0,2 ug de Pez-1B ou Pez-2F plasmídeos repórter em 50 uL de meio de soro reduzido em um tubo estéril.
4. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente, misturar suavemente o reagente de transfeco lipossomal diluída, preparada na etapa 6.2, com os plasmídeos preparados diluídos no passo 6.3. Incubar a mistura durante 20 minutos à temperatura ambiente.
5. Adicionar as misturas de transfeco inteiras contendo os vectores de expressão e o reagente de transfecção preparado no passo 6.4 a cada poço e incubar durante pelo menos 12 h num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO _2.
6. Depois de 12 h num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO _2, descartar o meio de cada poço e lavá-los com 500 pL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) / po.
7. Descartar o PBS e adicionar 200 ul de tripsina a cada poço. Incubar a placa num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 5 min. Adicionar 1 mL do meio para parar o diTransferir as células para um tubo estéril de 1,5 mL.
8. Centrifugar os tubos durante 3 min a 5.000 xg e descartar o meio. Adicionar 0,5 mL de tampão de extração de RNA por tubo para lisar as células por pipetagem repetitiva. Incubar as amostras homogeneizadas durante 5 min.
9. Para cada amostra tratada com tampão de extracção de ARN, adicionar 0,1 mL de clorofórmio por 0,5 mL de tampão de extracção de ARN. Inverter os tubos durante 15 s e incubá-los durante 3 min à RT.
10. Centrifugar os tubos durante 15 min a 12.000 xg e 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um tubo fresco. Adicionar 0,25 mL de isopropanol por 0,5 mL de tampão de extração de ARN usado para a homogeneização inicial.
11. Mistura-se por agitação em vórtex e incuba-os à TA durante 10 min. Centrifugar os tubos a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Após a centrifugação, o precipitado de ARN é normalmente visível no fundo do tubo.
12. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de RNA com 0,5 mL de etanol a 75% por 0,5 mL de tampão de extração de ARN.
13. Vortex vigorosamente e centrifugá-lo a 7,500 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar a pastilha de RNA. Dissolver o RNA em 50 μL de água isenta de RNase.
14. Adicionar 2 μL de 5U / μL de DNase I, 7 μL de tampão 10x e 11 μL de H2O para cada solução de 50 μL de RNA. Incubar os tubos a 37 ° C durante 1 h. Aquecer a 70 ° C durante 15 min para inactivar a DNase.
15. Para cada amostra, adicione os seguintes componentes a um tubo isento de nuclease de 0,2 mL: 1 μL de oligo dT 50 μM, 5 μL de RNA 400 ng / μL (2 μg), 1 μL de dNTP 10 mM e 3 μL de H ₂ O. Realizar a PCR reversa.
    1. Aquecer a mistura a 65 ° C durante 5 min e incubá-la em gelo durante pelo menos 2 min para evitar a reforma da estrutura secundária. Adicionar os seguintes componentes ao mesmo tubo: 4 μL de tampão de primeira cadeia 5x, 1 μL de DTT 0,1 M, 1 μL de 200 U / μL de transcriptase reversa e 4 μL de H2 _</ Sub> O. Misturar pipetando suavemente para cima e para baixo e incubar a 50 ° C durante 60 min. Parar a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 15 min.
16. Para cada amostra, adicionar os seguintes componentes a um tubo de PCR para completar a PCR marcada pelo corpo: 2,5 μL de tampão de PCR 10x, 0,5 μL de mistura de dNTP 10 mM, 1 μL de iniciador directo 10 μM, 1 μL de 10 μM Iniciador reverso, 0,25 μL de 5 μL de DNA polimerase Taq, 0,5 μL de Cy5-dCTP 25 nM e 2 μL do ADNc preparado no passo 6.15.
    1. Aquecer a reacção a 94 ° C durante 2 min para desnaturar as moléculas, realizar 25 ciclos de PCR (94 ° C durante 30 s, 60 ° C 30 s e 72 ° C 30 s), manter a reacção a 72 ° C durante 7 min, e depois deixá-lo em uma espera de 4 ° C.
17. Resolver os produtos de PCR por electroforese através de um gel de poliacrilamida a 10% com um tampão Tris base 1x, ácido bórico e EDTA (TBE). Executar uma digitalização usando um scanner de fluorescência. Meça oQuantidade de cada isoforma de splicing usando um software de densitometria.

7. Use ESF para Modular Splicing Bcl-x Endógeno e Medir Seus Efeitos na Apoptose

1. Placa 2 x 10 ⁵ células HeLa para cada poço de uma placa de 24 poços. Crescer as células durante a noite em 500 μL de DMEM suplementado com FBS a 10% numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
2. Após 12 h, transfectar as células com 2 μg de pGL-Gly-PUF (WT) ou 0,2 μg, 1 μg e 2 μg de pGL-Gly-PUF (531) (um domínio PUF reprogramado que reconhece Bcl-x pré- MRNA com alta afinidade, ver Figura 2 A ).
3. 24 h depois, colher as células. 1/3 das células são para o isolamento de RNA e análise de PCR (etapas 6.8 - 6.17) e 2/3 são para o isolamento de proteínas.
4. Para a análise de Western blot, ferver os grânulos de células totais em tampão de carga de 2X Sodium Dodecil Sulfato-PolyAcrylamide Gel (SDS-PAGE) durante 10 min, E em seguida resolver as proteínas num gel de SDS-PAGE a 12%. Transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose.
5. Bloquear a membrana com leite a 5% durante 1 h à TA e incubar a ó membrana / N com a caspase-3 (1: 1000), a PARP (1: 1000), ou beta-actina (1: 5000) anticorpos primários (diluído em 5% de leite) a 4 ° C.
6. Lava-se a membrana com PBS contendo 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 5 min à TA 3x num agitador basculante. Incubar a membrana com anticorpos ligado a HRP (1: 5000, diluo em leite a 5%) durante 1 h à TA.
7. Lava-se a membrana com PBS-T 3x à temperatura ambiente, e, em seguida, desenvolver a membrana usando reagentes de detecção ECL blotting ocidentais.
8. Adicionar 250 ul de poli-L-lisina (PLL) em lamelas, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente, e desviar o líquido. Lavam-se as lamelas de vidro revestidas com PLL com PBS 3x durante 5 min cada. Para a medição de apoptose ensaio de imunofluorescência, semente de 5 x 10 ⁵ culas HeLa em lamelas de vidro revestidas com poli-lisina em uma placa de 6 poços. transfecção pGL-Gli-PUF (WT) ou pGL-Gli-PUF (531) os plasmídeos para as células HeLa, utilizando um reagente de transfeco lipossomal (ver passos 6.1 - 6.5).
9. 24 h após a transfecção, as células fixar sobre as lamelas com 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x durante 20 min à TA. CUIDADO: PFA é tóxico; segurá-lo com cuidado em um exaustor.
10. Lavar suavemente as células nas lamelas de cobertura através da adição de 2 mL de PBS 1x. Incubar-los, durante 5 min. Remover o PBS com pipetas. Repetir a lavagem 3x.
11. Permeabilizar as células com 0,2% de Triton X-100 em PBS 1X durante 10 minutos, e, em seguida, lavá-los 3x com PBS 1x.
12. Bloquear as células com 3% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS, durante 10 min e lavá-los 3x com PBS 1x.
13. Diluir o anticorpo FLAG 1: 1000 em 3% de BSA / PBS e pipeta de 30 uL do anticorpo FLAG diluída para uma folha de parafilme.
14. Retire a lamela com as células, secar cuidadosamente o excesso de tampão com toalhetes de laboratório, e colocá-lo de cabeça para baixo (do lado célula para baixo) em 30 uL de anti-FLAG sOlução. Incubar durante 1 hora à TA.
15. Adicionar cerca de 500 μL de 1x PBS ao lado do lamínula incubado com o anticorpo primário até que o lamela flutue no topo da solução. Retornar para a placa de 6 poços com 1x PBS nos poços.
16. Lavar 3x com 1x PBS durante 5 min cada.
17. Diluir o anticorpo secundário anti-ratinho (1: 500) em BSA a 3% / PBS; Novamente, use 30 μL para cada lamínula. Colocar a lamela de cabeça para baixo na solução de anticorpos secundários e incubar durante 15 min à RT.
18. Remova a lamela do parafilme, como descrito no passo 7.15. Colocá-lo de volta na placa de 6 poços e lave com 1x PBS 3x por 5 min cada.
19. Monte os lamínulas com suporte de montagem (com DAPI), remova o excesso de meio e selar a borda com esmalte.
20. Visualize as células usando um microscópio de fluorescência (com uma ampliação de 100X) e fotografe-as usando uma câmera digital.
    NOTA: A expressão de ESF é visualizada pela fluorescência-labeleanticorpo secundário d contra o marcador FLAG, e a fragmentação nuclear é visualizada utilizando coloração com DAPI.

8. Medir a apoptose de células diferentes de cancro expressando FSE

1. Dividir 2 x 10 ⁶ culas HeLa, células MDA-MB-231, e células A549 em placas de 60 mm com 4 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ para detectar a apoptose com propio iodeto de (PI) coloração.
2. 24 h mais tarde, refrescar o meio e preparar o lentivírus, como previamente relatado ^24.
3. Diluir pWPXld-Gli-PUF (WT), pWPXld-Gli-PUF (531), ou pWPXld-GFP estoques 10 x 10 ⁶ lentivírus em 4 mL de meio fresco para fazer a proporção de vírus para o número de células igual a 5.
4. Alterar o meio em que as placas 4 mL do meio contendo o vírus, preparado no passo 8.3 e incuba-se as placas em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2. 12 h após a infecção, mudar o meio.
5. Após 24 h de infecção, recolher e colorir as células durante 5 min numa solução de PBS contendo uma concentração final de 2 μg / mL de PI.
6. Analisar as células coradas com PI com um citómetro de fluxo, conforme descrito anteriormente ¹⁶ .

Este relatório descreve o protocolo completo para a concepção e construção de ESFs e repórteres de splicing. Ele também delineia a aplicação de ESFs na manipulação da AS de genes endógenos [ ^16] . Para ilustrar os resultados típicos de alterações de emenda mediadas por ESF, usamos os dados de nosso trabalho anterior como um exemplo. Os ESF com diferentes domínios funcionais podem ser utilizados para promover ou inibir a inclusão do exão de cassete alvo ( Figura 1 D & E ). Os ESFs podem também afectar o uso de locais de emenda alternativos 5 'e 3' no sistema repórter ( Figura 1 F & G ).

O splicing alternativo do gene endógeno pode também ser regulado especificamente com ESFs de design. Temos demonstrado esta aplicação por especificaçãoVisando Bcl-x, que pode ser empalmada em duas isoformas antagonistas com locais de emenda 5 'alternativos. Nós projetamos um ESF, Gly-PUF (531), que reconhece um elemento de RNA de 8 nt entre os locais de emenda alternativos de 5 '. Este Gly-PUF (531) deslocou especificamente o empalme para a produção de Bcl-xS ( Figura 2A). Após a transfecção do Gly-PUF (531) em células HeLa, o nível de isoformas Bcl-xS e proteínas Bcl-xS aumentou de um modo dependente da dose, enquanto que o FSE de controlo, Gly-PUF (WT), não afectou a proporção De Bcl-xS para Bcl-xL ( Figura 2 B & C ). Além disso, o criador ESF pode induzir a clivagem da caspase 3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), dois marcadores moleculares bem conhecidos da apoptose ( Figura 2D ). Como esperado, os ESFs de design são predominantemente localizados nos núcleos de células transfectadas, como demoPor microscopia de imunofluorescência ( Figura 2E). Constantemente, a mudança de splicing por Gly-PUF (531) causou a fragmentação do DNA nuclear, indicando que estas células estão passando por apoptose ( Figura 2E). O aumento das células apoptóticas foi ainda confirmado através do exame de mais de 200 células de campos seleccionados aleatoriamente e pela quantificação da percentagem de células com ADN nuclear fragmentado ( Figura 2F).

Figura 1 : Desenho de ESFs e sua atividade na modulação do salto de Exon. ( A ) A ligação específica entre o domínio PUF e os alvos de ARN é ilustrada com a estrutura RNA-PUF e um diagrama esquemático. O código de ligação PUF para cada um dosQuatro bases de ARN, mostradas à direita com diferentes cores, são usadas para projetar mutações PUF. ( B ) Fluxograma para obter um domínio PUF personalizado. O PUF que reconhece "UGUAUAUA" foi usado como um exemplo. Uma estratégia de PCR de 4 rondas é utilizada para montar um andaime de PUF com uma especificidade de ligação a ARN personalizada (codificada por cores de forma semelhante ao painel A). Na primeira fase, são utilizadas uma série de iniciadores de PCR que incorporam os códigos de reconhecimento de ARN desejados para duas repetições de PUF adjacentes para gerar quatro fragmentos que incluem os oito códigos de reconhecimento de ARN de uma proteína PUF completa (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6 e R7 / R8). Os fragmentos tampão que codificam um sinal de localização nuclear N-terminal, um codão de terminação C-terminal e fragmentos de ponte são também produzidos separadamente (extremidade 5 'e extremidade 3', ponte 2/3, ponte 4/5 e ponte 6 / 7). No segundo ciclo, são gerados novos modelos misturando fragmentos sobrepostos que codificam repetições adjacentes com a ponte apropriada ( por exemplo, misturando R1 / R2,R3 / R4 e ponte 2/3 gera o molde para R1 - 4) e depois se estende com polimerase de ADN para preencher as lacunas. Da mesma forma, a terceira rodada junta R1-4, R5-8 e ponte 4/5. Finalmente, a quarta ronda adiciona as tampas de extremidade 5 'e 3' do domínio PUF em conjunto com os locais de clonagem para subsequente clonagem a vectores de expressão. ( C ) Organização do domínio modular dos FSE. Os ESFs são conduzidos por promotores de CMV (seta) e codificam, do N para o terminal C: um epítopo FLAG (para a detecção de ESFs), um módulo funcional (um domínio rico em Gly ou um domínio RS), um NLS (Facilitando a localização nuclear de ESFs), e um domínio de reconhecimento de ARN (um domínio PUF). Nhe I e BamH I são projetados para inserir um módulo funcional, enquanto Xba I e Sal I são projetados para inserir um domínio de reconhecimento de RNA. ( D ) Os ESF de Gly-PUF são co-expressos com repórteres de salto de exão, e o padrão de splicing é ensaiado por RT-PCR. O PUF modificado e PUF ^b ligam-se especificamente a alvos 8-mer A e B, respectivamente (nas mesmas cores). Todas as combinações são usadas, então os pares PUF-alvo de cor diferente servem como os controles. Os efeitos de RS-PUF sobre o salto de exão ( E ), o sítio de emenda 5 'concorrente ( F ) ou o repórter de sítio de empalhamento ( G ) concorrente foram ensaiados por métodos semelhantes ao painel D. Os dados da RT-PCR São de Wang et al. ¹⁶ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Regulação de Bcl-x endógena de pré-mRNA Splicing com ESFs. ( A ) Esquemático do splicing alternativo de Bc endógenoLx pré-mRNA. Dois locais de ligação em 5 'alternativos no exão 2 de Bcl-x são utilizados para gerar duas isoformas de diferentes tamanhos, Bcl-xL e Bcl-xS. A sequência UGUGCGUG entre os dois locais de corte em 5 'é seleccionada como alvo ESF e as repetições 1, 3 e 5 de WT PUF (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) são reprogramadas (asteriscos) para reconhecer esta sequência alvo. O ESF resultante contendo um domínio rico em Gly inibe a utilização dos 5 'ss a jusante (indicados pela seta vermelha). ( B ) Modulação do uso de Bcl-x 5 'ss. Quantidades diferentes da constru�o de express� Gly-PUF (531) s� transfectadas em c�ulas HeLa. Utiliza-se Gly-PUF (WT) como controlo. Duas isoformas de Bcl-x são detectadas com RT-PCR utilizando iniciadores correspondentes aos exões 1 e 3 do gene Bcl-x. A percentagem da isoforma Bcl-xS é quantificada e mostrada na parte inferior. ( C ) ESFs afectam os níveis de expressão de Bcl-xL e Bcl-xS. As amostras são carregadas na mesma ordem que no painel B, e todas as proteínas sãoE detectado por Western blots. A expressão de ESFs é detectada pelo anticorpo anti-FLAG, e o nível de tubulina é utilizado como controlo. ( D ) Quantidades diferentes de construções de expressão de ESF são transfectadas em células HeLa, resultando na clivagem de PARP e caspase 3. As amostras são detectadas por Western blot 24 h após transfecção. O nível de actina é detectado como um controle. ( E ) A localização subcelular de ESFs em células HeLa transfectadas é detectada por microscopia de imunofluorescência com o anticorpo anti-FLAG. As células são co-coradas com DAPI para mostrar os núcleos. Alguns núcleos, especialmente em células transfectadas com Gly-PUF (531), são fragmentados devido à apoptose. Barra de escala: 5 μm. ( F ) Percentagem de células apoptóticas ( ie células com ADN nuclear fragmentado) são medidas a partir de campos escolhidos aleatoriamente de imagens de microscopia de fluorescência. As barras indicam a média, enquanto os pontos indicam os dados das duas experiências. A figuras são modificados do nosso relatório anterior por Wang et al. ¹⁶ de acordo com a política do Nature Publishing Group. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este relatório fornece uma descrição detalhada para o projeto e construção de fatores artificiais de splicing que podem manipular especificamente o splicing alternativo de um gene alvo. Este método tira vantagem do modo de ligação de ARN único de repetições de PUF para produzir um andaime de ligação de ARN com especificidade personalizada. Ele pode ser usado para ativar ou reprimir splicing.

A etapa crítica neste protocolo é a geração do domínio reprogramado PUF que define a especificidade dos FSEs. Um protocolo de costura de PCR foi desenvolvido e otimizado para a rápida geração do andaime PUF. A chave para o seu sucesso é ajustar a proporção de diferentes modelos sobrepostos para 1: 1: 1. A purifica�o dos produtos de PCR ap� cada ciclo tamb� �cr�ica, porque os produtos n� purificados podem ter contamina�o de iniciador a partir da �tima ronda. Outro passo importante consiste em ensaiar a proporção de splicing utilizando RT-PCR semi-quantitativa. Geralmente, também homemY ciclos de amplificação devem ser evitados, como eles podem saturar a reação de PCR. Em nossos experimentos com a co-expressão de um repórter de splicing, 20-25 ciclos foram rotineiramente utilizados, mas isso pode variar dependendo da abundância do mRNA ao medir o splicing de genes endógenos. Ao quantificar as isoformas de splicing usando um novo par de primers, sugerimos a calibração do experimento PCR cada vez, como descrito anteriormente ¹⁶ .

Uma limitação potencial com ESFs de designer é os seus efeitos fora do alvo, porque a especificidade é determinada pelo número de repetições no andaime PUF. Wildtype PUF reconhece um 8-nt site, que é comparável à especificidade de um siRNA que reconhece o seu objectivo através de "semente partida". No entanto, uma vez que qualquer sequência de 8 nt poderia ocorrer uma vez por acaso num transcrito de 65 000 nt de comprimento (4 ⁸ = 65 536), haverá outros transcritos fora do alvo reconhecidos pelo designer PUF. O efeito fora do alvoEct pode ser reduzido usando PUFs com repetições adicionais; No entanto, ainda é útil avaliar a especificidade e os efeitos fora do alvo dos FSE. Para minimizar potenciais efeitos fora do alvo, a expressão de uma combinação de vários ESFs de design a um nível inferior também pode ser realizada. Nesse caso, os genes não direccionados podem não ser afectados pela baixa quantidade de ESFs, ao passo que o splicing do alvo real será afectado pelos múltiplos ESFs que funcionam de forma sinérgica. Esta solução é semelhante ao que os pesquisadores usaram no silenciamento gênico com RNAi, onde os siRNAs agrupados (cada um com uma concentração reduzida) que se dirigem a múltiplos locais de um único mRNA podem diminuir os efeitos fora do alvo.

O outro m�odo principal para manipular AS �utilizar oligonucle�idos anti-sentido que se emparelham com certas regi�s do pr�ARNm. Em comparação com este método existente, os FSE podem causar efeitos prolongados em células transfectadas de forma estável. Além disso, a libertação in vivo de ESF pode tirar vantagem do aumento do arsenal de vectores de terapia de genes, enquanto que a entrega in vivo de oligonucleótidos anti-sentido é muito difícil de controlar. Além disso, este método pode evitar modificações complicadas e dispendiosas de oligonucleótidos. Usando vários promotores induteis, um controlo mais preciso da expressão FSE nos tipos de células correctas e nos momentos correctos pode também ser alcançado. A principal desvantagem deste método é a especificidade relativamente baixa (um sítio de reconhecimento de 8-nt em comparação com um local de reconhecimento de 16 a 20 nt de oligonucleótidos anti-sentido típicos).

A desregulação de splicing alternativo provoca muitas doenças, incluindo cancro ^{26, 27.} Estudos genome-wide revelaram mais do que 15.000 variantes de processamento associados a tumor em diversos tipos de cancros ^{28, 29, 30.} Por exemplo, intrónicaAs mutações no local de união de genes supressores de tumores causam frequentemente eventos de exon-skipping e produzem proteínas aberrantes que podem contribuir para a gênese tumoral ^{26 , 31 , 32} . Além disso, verifica-se que alguns factores de splicing são sobre-expressos em muitos tipos de cancro, o que contribui para a transformação celular ^{33 , 34} , indicando que os factores de splicing também podem desempenhar papéis importantes na biogénese do cancro. Por conseguinte, para além de proporcionar uma ferramenta útil para modular a função do gene, a manipulação de splicing com ESFs de design pode restaurar eventos de splicing errados no cancro, proporcionando assim uma ferramenta terapêutica potencial. Além disso, por fusão de um designer PUF domínio com diferentes domínios funcionais, múltiplos fatores artificiais que manipulam vários RNA metabolismo processos podem ser projetados. Por exemplo, a fusão de um activador de tradução (GLD2) ou um representante de traduçãoRESSOR (CAF1) com o domínio de PUF produzidos novos factores que podem activar ou inibir a tradução de ARNm de ^27. Usando o mesmo desenho principal, que combinado um domínio de ARN com endonucleases não específica (PIN) com uma série de domínios desenhador PUF para gerar endonucleases artificiais específicos do local de ARN (ASREs) que funcionam de modo análogo ao de restrição de ADN enzimas ^17.

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R01-CA158283 e NSFC conceder 31400726 a ZWYW é financiado pelo Programa de Jovens Mil Talentos e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (subvenções 31471235 e 81422038). XY é financiado pela fundação de ciência pós-doutoral da China (2015M571612).