Method Article
In this protocol, the synthesis of Cd-free InP/ZnS quantum dots (QDs) is detailed. InP-based QDs are gaining popularity due to the toxicity of Cd2+ ions that may be released through nanoparticle degradation. After synthesis, QDs are solubilized in water using an amphiphilic polymer for use in biomedical applications.
Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, quantum dots should be highly fluorescent and small/monodisperse in size. While commonly used cadmium-based quantum dots possess these qualities, they are potentially toxic due to the possible release of Cd2+ ions through nanoparticle degradation. Indium-based quantum dots, specifically InP/ZnS, have recently been explored as a viable alternative to cadmium-based quantum dots due to their relatively similar fluorescence characteristics and size. The synthesis presented here uses standard hot-injection techniques for effective nanoparticle growth; however, nanoparticle properties such as size, emission wavelength, and emission intensity can drastically change due to small changes in the reaction conditions. Therefore, reaction conditions such temperature, reaction duration, and precursor concentration should be maintained precisely to yield reproducible products. Because quantum dots are not inherently soluble in aqueous solutions, they must also undergo surface modification to impart solubility in water. In this protocol, an amphiphilic polymer is used to interact with both hydrophobic ligands on the quantum dot surface and bulk solvent water molecules. Here, a detailed protocol is provided for the synthesis of highly fluorescent InP/ZnS quantum dots that are suitable for use in biomedical applications.
Квантовые точки (КТ) полупроводниковые нанокристаллы, которые проявляют флуоресцентные свойства при облучении светом 1. Из-за их небольшого размера (2-5 нм), который похож на многих крупных биомолекул и простоты biofunctionalization, КТ являются чрезвычайно привлекательным инструментом для биомедицинских применений. Они нашли применение в биологической классификации, одной молекулы живых клеток изображений, доставки лекарств, изображений в естественных условиях, обнаружение патогена, и отслеживание сотового, среди многих других целей 2-8.
Cd основе КТ были наиболее часто используется в биомедицинских применений из-за их интенсивной флуоресценции и узкий пик эмиссии шириной 9. Тем не менее, проблемы были подняты в связи с потенциальной токсичности Cd 2+ 10, которые могут просочиться через деградации наночастицы. Недавно InP на основе КТ были исследованы в качестве альтернативы КТ с компакт-диска, потому что они поддерживают многие характеристики флуоресценциикомпакт-основе КТ и могут быть более биологически совместимым 11. Cd основе КТ были обнаружены значительно более токсичны, чем КТ InP основе в анализах в пробирке при таких низких концентрациях, как 10 часов вечера, после всего лишь 48 часов 11.
Цвет флуоресценции квантовых точек является размер перестраиваемого 1. То есть, как от размера КТ возрастает, флуоресцентное излучение является красное смещение. Размер и размер дисперсность КТ продуктов могут быть изменены путем изменения температуры, продолжительности реакции или ее предшественника условия концентрации в ходе реакции 12. В то время как пик излучения ИЯФ КТ обычно шире и менее интенсивны, чем КТ с компакт-диска, InP КТ могут быть сделаны в большом разнообразии цветов, призванных предотвращать спектральную перекрытие, и достаточно интенсивным для большинства биомедицинских применений 12. Синтез подробно в данном протоколе дает КТ с красной пика излучения с центром при 600 нм.
Несколько шаги AFтер синтез ядер КТ поддерживать оптическую целостность КТ и сделать их совместимыми для биологических применений. Поверхность ядра QD должен быть защищен от окисления или поверхностных дефектов, которые могут привести закалки; Поэтому, оболочка ZnS покрыта вокруг сердечника для получения InP / ZnS (ядро / оболочка) КТ 13. Это покрытие было показано, чтобы защитить фотолюминесценции продукта QD. Присутствие ионов цинка, в процессе синтеза InP КТ было показано, чтобы ограничить поверхностные дефекты, а также распределение уменьшить размер 12. Даже при наличии Zn 2+ в реакционной среде, синтез InZnP являются весьма маловероятно 12. После нанесения покрытия, полученные КТ InP / ZnS покрыты гидрофобным лигандов, таких как оксид триоктилфосфина (ТОРО) или олеиламином 12,14. Амфифильный полимер может взаимодействовать с гидрофобными лигандами на поверхности КТ, а также объемных молекул воды для придания растворимости 15 воды. Амфифильных полимеров с карбоxylate химические группы могут быть использованы в качестве "химических ручками» дополнительно функциональных групп в КТ.
Этот протокол детали синтез и функционализация водорастворимых InP / ZnS КТ с очень интенсивным флуоресценции и относительно небольшой размер-дисперсности. Эти КТ являются потенциально менее токсичны, чем обычно используемых CdSe / ZnS КТ. В данном случае синтез InP / ZnS КТ обеспечивает практическую альтернативу с компакт-диска КТ для биомедицинских применений.
1. Синтез фосфида индия / сульфида цинка (InP / ZnS) квантовыми точками
2. ВодаСолюбилизация InP / ZnS квантовых точек Использование амфифильных Polymer
Непокрытые ядра InP не демонстрируют существенное видимое свечение невооруженным глазом. Тем не менее, InP / ZnS (ядро / оболочка) квантовые точки появляются флуоресцировать ярко глазом при УФ облучении. Флуоресценция InP / ZnS КТ характеризовалась использованием флуоресцентной спектроскопии. Спектр флуоресценции квантовых точек в гексане (Рисунок 1) возбуждается на 533 нм демонстрирует один основной пик с центром при 600 нм с полуширина (FWHM) 73 нм. В то время как плотность (0,2) смещения на рисунке 1 может означать КТ рассеяние света, и таким образом наличие агрегированных КТ, мигающий анализа (смотри ниже) показывают, что большинство КТ одиночные, или очень небольшими группами, КТ. После нанесения покрытия с амфифильный полимерный PMAL-й, квантовый выход InP / ZnS КТ была исследована путем сравнения интегральной интенсивности флуоресценции квантовых точек с родамина B в качестве стандартного 17. Квантовый выход КТ в гексане Determined быть 7,96% в среднем (2 измерения, 7,69% и 8,22%) и 6,03% в воде в среднем (2 измерения, 5,98% и 6,08%).
Размер водорастворимого InP / ZnS КТ характеризовалась использованием как просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и динамического светорассеяния (DLS). ПЭМ-изображения, которые только визуализировать ядро нанокристаллической и оболочку (InP / ZnS), не органических лигандов на поверхности, были захвачены при номинальном увеличении 150,000X. Изображения были проанализированы с помощью Фиджи ImageJ 18 и порог доводили дать бинарных изображений. Минимальные и максимальные диаметры Фере были усреднены, чтобы определить диаметры этих водорастворимых квантовых точек. Эти данные показали, небольшие, относительно монодисперсных КТ со средним диаметром 2,74 ± 0,72 нм (фиг.2А & B). Эффективная гидродинамическая диаметр КТ в воде при рН 7, инкапсулированных в PMAL-й, была измерена с помощью DLS. Должен бытьотметить, что эффективный гидродинамический диаметр с помощью DLS измеряет сольватированной QD, включая органическими лигандами и полимеров на поверхности КТ, а также молекул воды, которые взаимодействуют с ними. Поэтому измерения DLS, как правило, значительно больше, чем измерений, полученных в ТЕМ экспериментов. В этом измерении, считались КТ сферической и в общей сложности 30 измерений были захвачены вычислить эффективный диаметр по объему с использованием БИК программное обеспечение частичных решений. Эти значения были усреднены, обеспечивая средний диаметр 14,8 ± 6,0 нм (рис 2С).
Для того, чтобы определить, есть ли синтезированные InP / ZnS КТ были пригодны для визуализации одиночных молекул, мигает анализ проводили с использованием эпифлуоресцентной микроскопии 8. Хотя это не возможно, чтобы увидеть отдельные КТ с использованием световой микроскопии, анализ "на" и "выключено" государства флуоресценции может быть использована для идентификации секИнгл КТ Puncta в флуоресцентные изображения. Puncta представляющий одну мигающий квантовую точку проявляет состояние «включено», что отличается от "выключено" состоянии. Фильм мигающих КТ (разбавляют до примерно 100 мкм в деионизированной воде) был захвачен с помощью 63x, 1.4 NA, масло-погружение цели фицирована на качестве эпифлуоресцентной микроскопом с соответствующим куба фильтра и ПЗС-камеры. Изображения были получены с 30 мс экспозиции последовательно для 500 кадров. Мигает анализ проводили с помощью анализа среднюю интенсивность одного Puncta (примерно 4 пикселя) в каждом кадре с использованием ImageJ 19 (рис 3а). Отличие разрыв между "на" и "выкл" состояний наших КТ показать свой потенциал для одиночных молекул визуализации (рис 3B).
Взаимодействие КТ InP / ZnS с клетками также была исследована как через токсичности и сотовой интернализации. ДляОба исследования, мыши нейробластомы (n2a) клетки были использованы и все эксперименты проводились в сотовой среде (50/50 D-MEM / Opti-MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотик / противогрибковым). Анализе 20 трипанового синего токсичность проводили путем инкубации клеток в течение 24 n2a и 48 ч с различными концентрациями КТ. Полученные результаты показывают, незначительное токсичность клеток n2a при концентрациях КТ между 1-5 нМ (Рисунок 4). Для наблюдения QD интернализации, клетки n2a инкубировали с водорастворимыми КТ InP / ZnS в течение 12 ч при обоих 5 и 10 нМ. Изображения клеток, инкубированных с этих КТ, вероятно, свидетельствует локализацию лизосом КТ после 12 ч (рис 5), что согласуется с другими результатами интернализации наночастиц 21.
Рисунок 1. Поглощение и флуоресценция Характеристика InP / ZnS КТ. Поглощение и исправлены спектры флуоресценции InP / ZnS в гексане, возбуждаемых на 533 нм, показывающий максимальную оптическую плотность при 600 нм и полуширину 73 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Размер Анализ полимерным покрытием InP / ZnS КТ в воде. (А) Передача электронного микроскопа InP / ZnS КТ, растворенных в воде (Шкалы = 50 нм). (Б) Распределение размера частиц гистограмма ТЕА приводит со средним диаметром 2,74 ± 0,72 нм. (C) Динамический анализ светорассеяния InP / ZnS КТ в воде, показывая средний гидродинамический диаметр 14,8 ± 6,0 нм.large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. мигает Анализ InP / ZnS КТ. Одно флуоресцентного анализа Puncta подробно присутствие отличие "на" и "выключено" заявляет через (А) мигающим профиль InP / ZnS КТ в воде с использованием 460 нм ± 25 нм фильтра возбуждения , 500 нм фильтра длинный пас выбросов и 475 нм дихроичное зеркало, и (Б) гистограмма выставляется бимодальное распределение интенсивности пикселей от одного QD мигающим профиль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Трипановый Голубой Токсичность Количественное определение n2a клеток, обработанных InP / ZnS КТ график, изображающий жизнеспособности клеток n2a после инкубации с InP / ZnS КТ в течение 24 (черный) или 48 часов (красный) с 1 - 25 нм КТ , Незначительное токсичность наблюдается ниже 5 нМ. Столбики ошибок основаны на стандартном отклонении жизнеспособности в 3 различных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Интернализации InP / ZnS КТ в n2a клеток. Флуоресцентная микрофотография, показывающая интернализации InP / ZnS КТ после 12 ч инкубации с 0 контролем нМ (A) DIC (B) QD и (С) наложения, после 12 ч инкубации с 5 нМ КТ (D) ДВС (Е) QD и ( F) Наложение, и после 12 ч инкубации в присутствии 10 нМ КТ (G) DIC (H) QD и (I) наложения. Измерительная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Этот протокол детали синтез высоко флуоресцентных квантовых точек InP / ZnS которые могут быть использованы во многих биологических системах. КТ продукты, синтезированные здесь выставлены единственный пик флуоресценции с центром при 600 нм с полушириной 73 нм (рис 1), что сопоставимо с другими описанными ранее синтезов 12. Время реакции и температура реакции чрезвычайно важные шаги в связи с их глубокое воздействие на качество синтеза QD и повторяемости. После солюбилизации в воде, КТ предпочитала иметь квантовый выход примерно на 6%. Изменение концентрации Время реакции, температуры, или предшественника позволяет настройку размера КТ и длине волны эмиссии, который может быть использован в нескольких спектральных приложений.
Размер и поверхностный заряд чрезвычайно важными факторами, которые необходимо учитывать при использовании наночастиц в биологических системах. Чтобы свести к минимуму нарушение целевых биомолекул, КТ должны поддерживать малый, пнodisperse размер. Кроме того, поверхностный заряд КТ в растворе может быть изменено, чтобы уменьшить неспецифическое связывание направлении непреднамеренных целей. Синтез КТ представленных здесь производится КТ с диаметром 2,74 ± 0,72 нм методом просвечивающей электронной микроскопии (лишь сердцевины и оболочки видны) (Фигуры 2А и 2В). Были найдены водорастворимые КТ, чтобы иметь эффективную гидродинамический диаметр 14,8 ± 6,0 нм, что сравнимо с использованием компакт-диска КТ в настоящее время используются для биологических исследований 22. Поверхностный заряд и функциональность водных КТ может быть модифицирована путем дальнейшей реакции из карбоксилатных химических групп амфифильного полимера.
Мигает анализ был использован для изучения пригодности этих InP / ZnS для визуальных исследований одиночных молекул. Так как это не возможно, чтобы визуализировать отдельные КТ с использованием световой микроскопии, моргание отдельных КТ могут быть использованы для идентификации отдельных частиц. Это мигает явление чередование дискретно &# 34; на "и" выключено "флуоресценции 23 государств, которые могут быть исследованы с помощью средней интенсивности пикселя одного флуоресцентный QD Puncta течением времени флуоресценции следы InP / ZnS КТ Puncta продемонстрировать характеристика." На "и" выкл "государств ( Фигура 3А). Кроме того, нет никакого дублирования между "включено" и "выкл" состояний одной Puncta (фиг.3В), который был использован в предыдущих исследованиях, чтобы отличить одиночные частицы 8.
Дальнейшие эксперименты были использованы для изучения пригодности этих КТ InP / ZnS для сотовых исследований. Анализе трипанового синего токсичность проводили для оценки биосовместимости КТ InP / ZnS. После инкубации в течение 24 часов до 48 часов при концентрациях КТ, начиная от 1-5 нМ наблюдалось незначительным токсичность (рисунок 4), что сопоставимо с исследований токсичности для InP / ZnS КТ 11. Существенной токсичности не наблюдалось белвл 25 нМ; эта концентрация значительно выше, чем требуется для многих биомедицинских применений. Например, рентгеновские снимки, одиночных молекул часто требуют концентрации ПМ КТ зонда маркировать репрезентативного числа поверхностно-клеточных рецепторов связаны 24. Кроме того, n2a клетки инкубировали с КТ при 5 нМ или 10 нМ в течение 12 часов в сотовых СМИ указывают, что КТ усваиваются с помощью эндоцитоза, т.е. КТ продемонстрировать образец точечные окрашивания в клетках (рисунок 5). Эти результаты указывают на пригодность этих InP / ZnS КТ для исследования клеточных процессов.
Этот протокол детали синтез и функционализация водорастворимых КТ InP / ZnS с интенсивным флуоресценции, относительно небольшой размер-дисперсности и биологической совместимости. Высокое качество этих продуктов КТ обозначается визуализации одиночных КТ в флуоресцентной микроскопии, который демонстрирует, что они подходят для одной-moleculе изображений. Предполагается, что эти CD-фри КТ являются потенциально гораздо менее токсичны для биологических систем, изучаемых, а также исследователей, изучающих их. Как таковой, использование этих КТ В основе за биомедицинских применений является разумным альтернативой КТ на компакт-дисках.
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Авторы благодарят химический факультет и выпускник колледжа в Государственном университете штата Миссури за поддержку этого проекта. Мы также признаем микроскопии Лаборатория электронов при Национальной лаборатории Фредерика по исследованию рака за использование их просвечивающего электронного микроскопа и углерода покрытием сетки.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oleylamine | Acros | 129540010 | |
Zinc(II) chloride | Sigma | 030-003-00-2 | |
Indium(III) chloride | Chem-Impex | 24560 | |
Tris(dimethylamino)phosphine | Encompass | 50-901-10500 | |
1-dodecanethiol | Acros | 117625000 | |
Hexanes | Fisher Sci | H292-4 | |
Acetone | TransChemical | UN 1090 | |
Zinc Stearate | Aldrich Chem | 307564-1KG | |
Tetrahydrofuran | Acros | 34845-0010 | |
Molecular Water | Fisher Sci | BP2470-1 | |
Poly(maleic anhyrdride-alt-1-tetradecene), 3-(dimethylamino)-1-propylamine derivative | Sigma | 90771-1G | |
Boric acid | Fisher Sci | BP168-500 | |
Sodium Tetraborate Decahydrate | Fisher Sci | BP175-500 | |
Rhodamine B | Aldrich Chem | R95-3 | |
Nitrogen gas | Airgas | UN1066 | |
Trypan blue | Thermo Sci | SV30084.01 | |
3 ml plastic Luer-lock syringe | BD | 309657 | |
Luer-lock Needle | Air-Tite | 8300014471 | 4 inch, 22 gauge |
50 ml polypropyene centrifuge tube | Falcon | 352098 | |
250 ml centrifuge bottle | Thermo Sci | 05-562-23 | Nalgene PPCO |
5 ml centrifuge tubes | Argos-Tech | T2076 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Bio Plas | 4150 | |
0.1 μm Syringe filter | Whatman | 6786-1301 | Puradisc 13 mm nylon filter |
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit | Thermo Sci | 69590 | 20,000 MWCO |
Rotary Evaporator | Heidolph | ||
Centrifuge 5072 | Eppendorf | Swinging Bucket with 50 ml tube adapters | |
Lambda 650 UV/VIS Spectrometer | Perkin Elmer | UV-Vis Spectrophotometer | |
LS 55 Fluorescence Spectrometer | Perkin Elmer | Fluorometer | |
Axio Observer.A1 | Zeiss | epifluorescence microscope | |
AxioCam MRm | Zeiss | CCD Camera | |
Tecnai TF20 Microscope | FEI | Transmisison Electron Miscroscope | |
TEM Eagle CCD | FEI | TEM CCD Camera | |
NanoBrook Omni DLS | Brookhaven | Dynamic Light Scattering Instrument |
A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:
Katye M. Fichter
from:
Kathryn M. Fichter
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены