Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Способность различать мышиных эмбриональных стволовых клеток (ESC), чтобы нейронных клеток-предшественников позволяет изучение механизмов, контролирующих нейронной спецификации, а также генерацию зрелых нервных типов клеток для дальнейшего исследования. В этом протоколе мы опишем метод для дифференциации ESC на нейронных клеток-предшественников с использованием бессывороточной, однослойной культуры. Метод является масштабируемым, эффективным и приводит в производстве ~ 70% нервных клеток-предшественников в течение 4 - 6 дней. Это может быть применен к ESC от различных штаммов, выращенных в различных условиях. Нейронные предшественники могут быть разрешены, чтобы дифференцировать далее в функциональных нейронов и глии или анализировали с помощью микроскопии, проточной цитометрии или молекулярных методов. Процесс дифференциации поддается покадровой микроскопии и могут быть объединены с использованием репортерных линий для мониторинга нейронный процесс спецификации. Мы предоставляем подробные инструкции по подготовке СМИ и оптимизации плотности клеток, чтобы процесс бе применяться для большинства ЭСК линий и различных культур клеток сосудов.

Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентные клетки, полученные из ранних эмбрионов со способностью размножаться неопределенно в пробирке при сохранении способности дифференцироваться во все типы клеток взрослого следующих реинтродукции в соответствующей стадии эмбриона (путем формирования химеру), инъекции в сингенных или иммунодефицитами (путем формирования тератомы) или в пробирке субъекта к соответствующим сигналам ^1. Дифференциация в пробирке мышиных эмбриональных стволовых клеток в нервных линий была впервые описана в 1995 году и предусматривал формирование многоклеточных подвески агрегатов (эмбриональных органов, EBS) в сыворотке крови, содержащей среде с добавлением морфогена ретиноевой кислоты ^2-4. С тех пор множество протоколов были разработаны, чтобы позволить нервной дифференциацию ^5. Многие до сих пор используют агрегацию, другие совместного культивирования с индукции типов клеток и несколько включают использование сыворотки среде. Все протоколы имеют преимуществай недостатки и точный характер нервной или нейрональные клетки продуцировали также варьируется в зависимости от используемого протокола.

Идеальным протоколом будет надежная, масштабируемая и использовать в полной мере, определенных СМИ и субстратов, поддаваться неинвазивного мониторинга процесса дифференцировки и в результате генерации чистых популяций нервных клеток-предшественников, способных быть с рисунком внешних сигналов и дифференцировать во всех нейрональных и глиальных подтипов с высокой эффективностью и выходом за относительно короткое время. В последние двенадцать лет мы используем метод для генерации нейронных клеток-предшественников и нейроны от мыши ESC в низкой плотности, свободной от сыворотки приверженцем монослоя культуры ^6-10. Этот протокол отвечает многим критериям, изложенным выше: в наших руках эффективность дифференциации была вполне согласуется в течение многих лет, и разнообразие клеточных линий, его можно масштабировать вверх или вниз (мы успешно использовать сосуды из 96-луночных планшетах с 15 см диаметр диShes) и средства массовой информации, используемые хорошо определены. Процесс поддается ИНТЕРВАЛ микроскопии для мониторинга и дифференциации различных паттерна сигналы могут быть добавлены, чтобы вызвать генерацию различных типов нейрональных подтипов (например, Shh и Fgf8 для дофаминергических нейронов ^6).

Тем не менее, есть некоторые проблемы для успешного применения этого протокола. Одним из ключевых аспектов является тщательная подготовка средств массовой информации. Мы всегда подготовить СМИ в доме, несмотря на наличие коммерческих альтернатив. Один из добавок, используемых (N2, см Protocol) имеет модификации по сравнению со стандартной, коммерчески доступные версии. Наконец, один из самых важных шагов для успешного применения этого метода является оптимальная плотность клеток в обшивке. Это происходит главным образом из-за в то время как природа аутокринная одного из индуцирующих сигналов (Fgf4 ¹¹⁾ требует, чтобы достаточные клетки присутствуют для оптимального viabilность и дифференциации, при слишком высокой плотности дифференциации ухудшается (возможно, частично из-за аутокринном производства LIF ^12). Поэтому важно, что препарат обе среды и клеточной обшивки выполнены тщательно и последовательно, чтобы обеспечить оптимальные результаты.

1. Подготовка СМИ

Примечание: Этот протокол основан на использовании смеси двух отдельных средств массовой информации: DMEM / F12, дополненной модифицированным N2 добавки и Neurobasal с добавлением B27 добавки, как правило, в соотношении 1: 1.

1. Подготовка модифицированный N2 дополнение смешением компонентов в 15 мл пробирку. Не вихрь или фильтровать это; перемешать переворачивая пробирку, пока раствор не станет прозрачным.
   1. Начните с помощью пипетки 7,2 мл DMEM / F12, а затем добавить 1 мл 25 мг / мл инсулина (в 0,01 М HCl) и хорошо перемешать путем обращения трубку. Это займет пару минут, пока раствор не станет прозрачным.
   2. Добавить 1 мл 100 мг / мл апо-трансферрина (приготовлен в воде), 33 мкл 0,6 мг / мл progesternone (составленные в этаноле), 100 мкл 160 мг / мл (1 М) путресцина (приготовлен в воде ), 10 мкл 3 мМ селенита натрия (приготовлен в воде) и 666 мкл 7,5% бычьего сывороточного альбумина и смешать трубки хорошо. Алиготе в 2,5 мл и хранят при -20 °С в течение 2 месяцев.
2. Подготовка информации.
   1. К 250 мл DMEM / F12 добавить 2,5 мл N2. Все хорошо перемешать, но не трясите фильтр.
   2. Для 250 мл Neurobasal СМИ добавить 5 мл B27 дополнения. Все хорошо перемешать, но не трясите фильтр.
   3. Смешайте СМИ от шагов 1.2.1 и 1.2.2 в соотношении 1: 1. В некоторых случаях 1: могут потребоваться 3 смесь (дополнено как смесь 1: 1 в шаге 1.2.4).
   4. К смеси добавляют 0,5 мл L-глутамина (конечная концентрация 0,2 мМ) и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (конечная концентрация 0,1 мМ) и хорошо перемешать без встряхивания. Храните носители при 4 ° С на срок до 3-х недель и не подвергать на свет. Это финальный микс называется N2B27.
3. Подготовка раствора желатина.
   1. Приготовьте 1% раствора желатина в сверхчистой воде и автоклаве при 121 ° C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 15 мин. Важно, что бутылка для этого используется полностью очистить от моющих средств или дезинфицирующих средств, поэтому рекомендуется, что новый бутылкаДля этого используется и только когда-либо промыть в сверхчистой воды между использования. Алиготе 1% раствора в 50 мл аликвоты и хранить при температуре 4 ° С в течение месяца.
   2. Теплый аликвоту 1% желатина в водяной бане при 37 ° до полного растворения и добавить к 500 мл теплой фосфатно-солевом буфере (PBS). Все хорошо перемешать и пипетки достаточно, чтобы покрыть дно каждой лунки или пластины. Разрешить желатин, чтобы покрыть поверхность, по крайней мере 30 мин.

2. Покрытие клетки

Примечание: Этот протокол равной степени применимо к мыши ESC, выращенного в 10% сыворотки с ингибирующий лейкоз фактор (LIF), сыворотки замены LIF или бессывороточной среде с LIF и костного морфогенетического белка 4 (BMP4) или МЕК и GSK3 ингибиторов (2i сред) с или без LIF. Тем не менее, сроки и эффективность дифференциации может варьироваться в зависимости от носителя и клеток (см обсуждения). Для экспериментов, показанные здесь мы использовали линию 46C мыши ESC (который имеет репортер EGFP постучал в одной из эндогенных аллелей Sox1), выращивают в GMEM с 10% сыворотки и LIF. Для получения оптимальных результатов важно, чтобы клетки диссоциируют и пересевали в средствах массовой информации N2B27; простым изменением сред из GMEM / сыворотка / LIF, чтобы N2B27 всегда приводит к снижению эффективности дифференцировки по сравнению с replating клетки.

1. Выращивают клетки в GMEM с 10% сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 1 несущественных аминокислот, 0,1 М 2-меркаптоэтанола и 100 ЕД / мл LIF ^13. Чтобы получить субконфлюентные культуру мыши ESC, плиты 1 х 10 ⁶ клеток в T25 культуры колбу, которая состоится 2 - 3 дней.
2. Соблюдайте клетки под ярко-поле микроскопа. Когда клетки субконфлюентные и готовы к прохождению, промойте их в два раза PBS. Добавить 1 мл клеточной диссоциации реагента и возврата в инкубаторе в течение 2 - 5 мин. Несмотря на то, трипсин и другие ферменты также могут быть использованы для клеточной диссоциации, они могут оказать негативное влияние на прикрепление клеток, так плотность обшивки должны быть AdjuSTED.
3. Как только клетки начинают поднимать от пластины, нажмите на судно, чтобы сместить их в суспензии отдельных клеток. Сбор клеток в общей сложности 10 мл средства массовой информации и диссоциации клеток реагентом и пипетки в 15 мл центрифужную пробирку.
4. Спин клетки при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
5. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл подогретого N2B27 пипетированием вверх и вниз 3 - 5 раз. При пипетки подвески вниз, пипетки к стенке трубки, чтобы избежать образования пузырьков. Граф клеток с автоматизированной счетчика клеток или гемоцитометре и записывать концентрацию.
6. Приготовьте суспензию клеток, содержащий желаемое количество клеток на единицу объема, чтобы быть покрыты на лунку в подогретого N2B27. Плотность 10500 клеток на см ² в чашке 6-луночный (т.е., 1 × 10 ⁵ клеток на лунку в чашке с 6-а) является оптимальным. В Таблице 1 рекомендуемое количество клеток на см ² и плаTing объемы средств массовой информации для различных клеточных культур судов.
7. Аспирируйте желатин из культуральной судна и пластины клеточной суспензии в соответствии с предложенной плотности и объема в таблице 1. Не водоворот пластин, так как это будет сконцентрировать клетки к центру. Поместите культур во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО _2.
8. Изменить СМИ каждые 1 - 2 дня, заменив все СМИ со свежими N2B27. Внесите мягко, как промывка клеток может повлиять на плотность и уменьшить эффективность дифференциации в последующие дни. Где начальная жизнеспособность после посева плохое, плиты клетки в 1: 3 смеси СМИ N2 и B27-дополненных и изменить это N2B27 после первых двух дней. Клетки начинают дифференцироваться и должны показать Sox1 выражение (видимый зеленой флуоресценции репортера в клеточной линии 46C используется здесь) в течение 4 - 6 дней.

3. Окрашивание Иммунофлуоресцентное

НЕТТЕ: Протокол может быть применен к любому типу резервуара. Объем каждого реагента описано на лунку 6-луночного планшета и можно масштабировать до любого площади поверхности. Replating не рекомендуется из-за низкой жизнеспособности после этого.

1. Удалить дифференциации среды и фиксации клеток добавлением 500 мкл 4% (объем / объем) параформальдегида, оставить на 15 мин.
2. Мытье и клетки проницаемыми с 2 мл PBS-T (фосфатным буферным раствором с 0,5% (об / об) Tween-20) в два раза. Клетки можно хранить в PBS-T в течение 2 месяцев при 4 ° С.
3. Заменить PBS-T 1 мл PBS-T с 10% (об / об) сыворотки (от того же вида, что и вторичного антитела). Инкубируют 1 час на пластине качалке при комнатной температуре, чтобы блокировать любые неспецифическое связывание.
4. После 1 часа, промыть клетки дважды по 2 мл PBS-T, и инкубируют в 500 мкл мышиного IgG против βIII-тубулина (разведенного 1: 1000 в PBS-T с 10% сыворотки). Положите на пластине рокера, и оставить O / N при 4 ° С.
5. Из этой стадии всегда защитить судноот света. Промыть клетки дважды PBS-T, затем добавить 500 мкл флуоресцентно-меченного антитела против мышиного IgG антитела (разведенного до 2 мкг / мл в PBS-T с 10% сыворотки). Положите его на тарелку рокера в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Промыть клетки дважды PBS-T, затем добавить 500 мкл DAPI (разбавляют до 0,5 мкг / мл в PBS-T) и оставить на 5 мин.
7. Вымойте клетки раз и держать их в PBS-T. Клетки готовы быть сфотографирован и может быть сохранена в течение 2 недель при 4 ° С. Обратите внимание, что GFP сигнал затухает с течением времени, так что неуместно сравнивать интенсивность GFP фиксированной и живых клеток или клеток фиксированных в разное время.

В этом эксперименте мы использовали клеточную линию 46C ^14, мышиных эмбриональных стволовых клеток с эндогенным Sox1-GFP репортер, чтобы отслеживать нейронную дифференциацию. С помощью этой линии клеток, экспрессию Sox1, маркера нейронов предшественников, могут быть обнаружены с помощью зеленой флуоресценции. Покрытие плотность является критическим фактором для достижения дифференцировку нейронов. Мышиных эмбриональных стволовых клеток высевали в 6-луночный планшет при различных плотностях колеблется от 10500 до 88500 клеток / см ^2. 1А показывает эффективность дифференцировки, достигнутые различной плотности металлизации в 6-луночный планшет. На 6-й день дифференциации, клетки фиксировали в 4% параформальдегида и окрашивали для нейронального маркера βIII-тубулина. При оптимальной плотности (10500 клеток / см ^2), клетки дифференцируются в нейронных клеток-предшественников и нейронов. Это наблюдалось зеленого флуоресцентного сигнала от Sox1-GFP репортер и иммунофлуоресцентного против нейронов маркер, βIII-тубулина. ВотWER плотность покрытия привело к гибели клеток в течение 3 дней. Тем не менее, покрытие при слишком высокой плотности (> 36500 клеток / см ²⁾ привело к снижению доли зеленых клеток и βIII-тубулина положительных клеток. 1В показывает эксперимент проводили в 96-луночный планшет, который требуется около 10 раз более высокую плотность клеток, чтобы достичь оптимального (155000 клеток / см ²⁾ и слишком сливающийся (362500 клеток / см ²⁾ уровень.

Оптимальная плотность может отличаться от препаратов массовой информации, составляющей медиа и мобильные партий, типов клеток, или предыдущих условий культивирования. Рекомендуется для оптимизации обшивки плотность для каждого эксперимента. Таблица 1 дает диапазон эффективных плотностей покрытий в различных платформ, которые должны быть включены на этапе оптимизации. В пределах этого диапазона, она должна быть возможность получить плотность, что дает хорошую эффективность дифференциации в течение 4 - 6 дней.

Во время дифференцировки ESC постепенно менять их морфологию. Рисунок 2 показывает клеток и морфологии колоний от 1 дня до 6 день после посева в 6-луночного планшета на 10500 клеток / см ^2. Клетки культивировали в условиях дифференцировки и фотографировали каждый день. Это не является необычным, чтобы увидеть значительную гибель клеток на первые несколько дней из-за сильного изменения в условиях культивирования. Тем не менее, оставшиеся клетки все еще в состоянии отличить. На 4-й день, клетки начали становиться нейронных клеток-предшественников, как зеленый флуоресцентный сигнал от Sox1-GFP репортер первых появились. Тем не менее, даже на 6-й день, не все клетки Sox1-положительным. Наличие некоторых не-нейронных клеток, как ожидается, тем не менее, в определенных условиях, большинство клеток будет нейронная.

Рисунок 1. Влияние плотности покрытия на эффективность дифференциации. Два разныхплотности Sox1-GFP репортер клеток (46C) высевали и дифференцированы в соответствии с протоколом в течение 6 дней. (А) Дифференцирование в 6-луночный планшет. (Б) дифференциация в 96-луночный планшет. Масштабная линейка:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Сотовые морфологии в процессе дифференцировки. 46C ESC были дифференцированы в 10500 клеток на см ² в культуральной пластины 6-а и фотографировали ежедневно наблюдать изменения в морфологии клеток. Масштабная линейка:. 300 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Предлагаемые покрытие плотность и объем носителя для различных размеров сосудов. Плотности обшивки в этой таблице, были определены с использованием клеточной линии 46с. Для получения оптимальных результатов плотность покрытия из каждой отдельной линии, возможно, придется прилUsted.

Нейронная дифференциация протокол монослоя была в использовании на протяжении более десяти лет ^6. Протокол является высокоэффективным, состоит из определенной среде, и сделано в системе однослойного что делает систему более применимой для доклинических (например, скрининг лекарств) использует. Тем не менее, есть некоторые критические факторы, определяющие эффективность дифференциации. Эта статья указывает те факторы и решение для каждого препятствия.

Плотность клеток после посева в условиях дифференциации, пожалуй, самым важным фактором. Покрытие клеток при слишком высокой плотности снижает эффективность дифференцировки, в то время как покрытие при слишком низкой плотности приводит к гибели клеток. Это явление, скорее всего, из-за аутокринной сигнализации фактора роста. Fgf4 является аутокринная фактор роста, который активирует каскад МАРК и приводит ESC дифференцировки ^11. LIF является другой цитокин, продуцируемый ESC. Это активирует STAT3 путь и способствует самообновлению ^{15. Этот протокол позволяет использование N2B27 сделать нервные клетки. N2B27 содержит различные факторы, которые позволяют выживание ESC и способствует росту клеток нервной и не содержит ни LIF или ВМР4, которые ингибируют нейронную дифференциацию 6. В правильной плотности, подходит баланс FGF4 и LIF сигнализации поддерживается, что позволяет ESC, чтобы дифференцировать. При высокой плотности, избыточного количества аутокринном LIF и BMP ингибируют дифференцировку. В противоположность этому, клетки при слишком низкой плотности имеют нарушенную выживание в этих довольно минимальной среде. Таким образом, когда появляется большое количество клеток без дифференцировки количество покрытия должна быть уменьшена, в то время как увеличение числа клеток обшивки требуется, если наблюдается значительное гибель клеток.}

В дополнение к числу клеток есть и другие факторы, которые косвенно влияет на плотность обшивки. Первым фактором является локальная концентрация клеток, зависит от используемого метода, чтобы равномерно распределить клетки по поверхностиплощадь. Мы обнаружили, что закрученной скважины не является идеальным, поскольку она концентрирует клетки в центре скважины и делает плотность в центре слишком высокой, в то время как на периферии плотность становится слишком низким. Другие методы смешивания, например, перемешивания сред с клетками, прежде чем покрытие или раскачивание пластины из стороны в сторону, рекомендуется. Кроме того, когда судно находится в инкубаторе, неравномерный нагрев среды приводит к конвекции сила, которая всасывает клетки к центру скважины, в результате чего распределение клеток в концентрической кольцевой узор. Меньший объем информации на день покрытия рекомендуется уменьшить этот эффект. Оставив пластины вне инкубатора в течение 30 мин, чтобы позволить клетки приложить, а также разогрев среду перед смешиванием также может помочь в достижении однородной плотности металлизации.

Во-вторых, судно типа также влияет на плотность обшивки. На рисунке 1 видно, что количество клеток / лунку не могут быть линейно SCAпривела к площади поверхности различных сосудов (другими словами, то же самое количество клеток / площадь поверхности не может быть применен к любому типу судна). Меньший сосуд (с соотношением больший объем / площадь) в большей степени влияют на медиа поверхностное натяжение, которое делает вогнутую поверхность среды, так называемой мениска. Поверхностное натяжение толкает клетки к краю колодца и уменьшает плотность в центре. Кроме того, поскольку объем носителя в небольшом сосуде низкий, носитель разогреть быстро, уменьшая силу конвекции. Таким образом, клетки в небольшой сосуд будет двигаться к краю в мениска эффект, и не будет двигаться к центру конвекционными сил. Таким образом, чем меньше судно, тем выше плотность покрытия требуется, чтобы получить оптимальную плотность в центре.

В-третьих, состояние клеток до посева также косвенно влияет плотность покрытия и эффективность дифференциации. Мы нашли изменение оптимальной плотности в некоторых экспериментах. Эксперименты сболее высокий уровень смертности в первый день необходимо более высокую плотность для эффективного дифференциации. ESC культур в сыворотке и LIF состоят из гетерогенной популяции наивных плюрипотентных клеток, грунтованный плюрипотентных клеток, и даже небольшого количества дифференцированных клеток ^16. Клетки этих типов имеют различное способность к выживанию и дифференциации в условиях дифференциации. Поскольку протокол диктует по количеству, но не государственной клеток, некоторые эксперименты могут начать с более дифференцированных клеток, которые умрут в первые несколько дней, что приводит к более низкой плотности, чем ожидалось. Чтобы избежать этого изменения, в соответствии культура ESC требуется, чтобы убедиться, что постоянная пропорция между каждым государством сохраняется.

Помимо плотности, времени еще один фактор для достижения эффективного дифференциации. В этой публикации мы опишем поколения нейронных клеток-предшественников в течение 6 дней. Однако время может быть различным в зависимости от состоянияначиная ESC культура. Как описано выше, ESC культуры смешанные популяции, которые могут по-разному реагировать на состояние дифференцировки. Не только выживание клеток, но также времени дифференцирования будет зависеть от состава культуры. Этот протокол может быть применен к большей ESC условиях культивирования, например, в средах, содержащих N2B27 LIF и ВМР4 или 2I и LIF. Однако, если есть более наивные клетки в культуре, более длительный срок может потребоваться для эффективного дифференциации. Это потому, что наивные клетки понадобится больше времени, чтобы перейти на загрунтованную состоянии, а затем дифференцироваться в нейронных клеток-предшественников.

The authors have nothing to disclose.

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.