혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

신경 전구 세포에 마우스 배아 줄기 세포가 분화하는 능력 (ESC)는 신경 사양뿐만 아니라, 더 깊은 연구 성숙한 신경 세포 유형의 발생을 제어하는​​ 메커니즘의 연구를 허용한다. 이 프로토콜에서 우리는 무 혈청, 단층 문화를 사용하여 신경 전구 세포에 ESC의 분화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 효율성, 확장 성 및 4 내 70 %의 신경 전구 세포 ~의 생산 결과 - 6 일. 이것은 다양한 조건 하에서 성장 다양한 균주에서 ESC에인가 될 수있다. 신경 전구 세포는 현미경으로 기능적 뉴런 및 신경교 또는 분석으로 더 분화 세포 계측법 또는 분자 기법을 흐르게 할 수있다. 분화 과정은 시간 경과 현미경에 순종하며 신경 특정 처리를 모니터링하는 리포터 라인의 사용과 결합 될 수있다. 우리는 프로세스가 ㄱ 할 수 있도록 미디어 준비 및 세포 밀도 최적화에 대한 자세한 지침을 제공E는 가장 ESC 라인 및 세포 배양 용기의 다양한 적용.

배아 줄기 세포는 동계 또는 면역 호스트로 (키메라를 형성하여) 적절한 단계 배아 내로 재 도입 다음 모든 성인 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력, 주입을 유지하면서 시험 관내에서 무기한 증식 용량 초기 배아 유래의 다 능성 세포이다 (기형 종 형성에 의해) 또는 해당 큐 ¹ 체외 주제에. 신경 계통에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화는 1995 년에 처음 설명과 morphogen 레티노 산 ^2-4 보충 혈청 함유 미디어에서 다세포 서스펜션 집합체의 형성 (배아 체, EBS을 (를)) 참여했다. 이후 다양한 프로토콜 신경 분화 ^5를 허용하도록 개발되어왔다. 여전히 응집을 이용하는 많은 다른 세포 유형으로 유도 배양 공동 여러 혈청이없는 배지의 사용을 포함한다. 모든 프로토콜은 장점을 가지고차 단점과 신경의 정확한 특성 또는 신경 세포는 또한 사용되는 프로토콜에 따라 달라집니다 생산.

이상적인 프로토콜, 강력한 확장 성이 완벽하게 정의 된 미디어와 기판을 활용, 분화 과정의 비 침습적 모니터링 의무가하고 수 신경 전구 세포의 순수한 인구의 발생을 초래할 외부 단서에 의해 구별하는 패턴 할 것 상대적으로 짧은 시간에 높은 효율과 수율 모든 신경 세포와 교세포 하위 유형으로. 지난 12 년에 우리는 저밀도, 무 혈청 접착 단층 배양 ^6-10 ESC 마우스에서 신경 전구 세포 및 신경 세포를 생성하는 방법을 사용하고있다. 이 프로토콜은 위에 명시된 기준 중 많은 충족 : 우리 손에 분화의 효율이 상당히 오랜 세월에 걸쳐 일관되고 다양한 세포주왔다가 상하 또는 축소 될 수있다 (우리는 성공적으로 96 웰 플레이트에서 용기를 사용 15cm 직경 디급히 드릴 말씀) 사용 된 미디어는 잘 정의되어 있습니다. 프로세스 (도파민 뉴런 ⁶ 예, 쉬와 Fgf8) 신경 가지 유형의 서브 타입의 생성을 유도하기 위해 첨가 될 수 분화의 모니터링 및 패터닝 단서의 다양한 timelapse에 현미경 의무가있다.

그럼에도 불구하고,이 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램에 몇 가지 문제가있다. 주요 측면 중 하나는 미디어의주의 준비입니다. 우리는 항상 상업 대안의 가능성에도 불구하고 사내 매체를 준비합니다. 사용되는 보조제 중 하나 (N2, 프로토콜 참조)는 표준 상업적으로 이용 가능한 버전에 비해 수정이 있습니다. 마지막으로,이 방법의 성공적인 적용을위한 가장 중요한 단계 중 하나는 도금에 최적의 셀 밀도이다. 유도 신호 중 하나 (Fgf4 ^11)의 분비 자연이 필요로하는 동안 때문에 충분한 세포가 최적의 viabil을 허용 할 수 있는지 주로너무 높은 밀도의 분화에 성만과 차별화, (인해 LIF ^(12)의 분비 생산 가능한 부분) 손상된다. 그것은 두 매체 준비와 세포 도금 신중하게 수행하고 지속적으로 최적의 결과를 보장하는 것이 중요하다.

1. 미디어 준비

참고 : 1 비율 : 일반적으로 1, B27 보충제로 보충 수정 N2 보충과로 Neurobasal 보충 DMEM / F12 : 프로토콜은 두 개의 별도의 미디어 믹스의 사용에 의존한다.

1. 15 ㎖의 튜브에 성분을 혼합함으로써 변성 N2 보충제를 준비한다. 소용돌이 나이를 필터링하지 마십시오; 용액이 깨끗해질 때까지 튜브를 반전시켜 혼합한다.
   1. 다음 (0.01 M 염산에서 만든) 25 ㎎ / ㎖ 인슐린 1 ㎖를 추가하고 튜브를 반전하여 잘 혼합, DMEM / F12의 7.2 ml의 피펫 팅으로 시작합니다. 이 솔루션은 분명하다 때까지 몇 분 정도 걸립니다.
   2. (물에 만든) 100 mg을 1 ㎖ / ml의 아포 트랜스페린, ml의 progesternone (에탄올에 만든) / 0.6 mg을 33 μL, 160 ㎎ / ㎖ (1 M) 퓨 트레 신 (putrescine)의 100 μl를 추가 (물에서 만든 ), 물 (10)에 만들어진 3 mM의 나트륨 셀레 나이트 () 및 7.5 % 소 혈청 알부민의 666 μL의 μL 잘 튜브를 혼합한다. -20 °에서 2.5 ml의로 나누어지는 및 저장최대 2 개월 동안 C.
2. 미디어를 준비합니다.
   1. DMEM / F12 250 ml의 N2의 2.5 ml를 추가합니다. 잘 섞는다하지만 흔들거나 필터가 없습니다.
   2. 로 Neurobasal 250 ml의 미디어는 B27 보충 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 잘 섞는다하지만 흔들거나 필터가 없습니다.
   3. : 1의 비율로 1 단계 1.2.1과 1.2.2에서 미디어를 섞는다. 1 일부의 경우 : 3 혼합이 요구 될 수있다 (단계 : 1.2.4 1 혼합 1로 보충).
   4. 혼합 L- 글루타민 (최종 농도 0.2 mM의) 및 2- 머 캅토 에탄올 (최종 농도 0.1 mM)을 3.5 μL의 0.5 ml에 추가하고 흔들림없이 잘 섞는다. 최대 3 주 동안 4 ℃에서 미디어를 저장하고 빛에 노출시키지 마십시오. 이 마지막 믹스 N2B​​27이라고합니다.
3. 젤라틴 용액을 준비합니다.
   1. 15 분 동안 121 ° C, 15 psi에서 초순수 및 오토 클레이브 1 % 젤라틴 용액을 준비한다. 그것은이 사용 세제 병 살균제 완전히 깨끗 것이 중요하므로 새로운 병 것이 좋다이 사용하고 오직 용도 사이 초순수 세정. 50 ㎖ 씩에 1 % 용액을 나누어지는 달 4 ℃에서 보관하십시오.
   2. 용해 될 때까지 37 ° C의 수조에 1 % 젤라틴 분취 따뜻한 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS) 500㎖의 추가. 잘 섞는다 잘 또는 플레이트 각의 바닥을 커버하기에 충분 피펫. 적어도 30 분 동안 코트에 젤라틴을 표면을 허용합니다.

2. 도금 세포

참고 :이 프로토콜은 백혈병 억제 인자 (LIF), LIF 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4) 또는 MEK와 GSK3 억제제 (2I 미디어)와 LIF 또는 혈청이없는 매체와 혈청 교체와 10 %의 혈청에서 재배 마우스 ESC에 동일하게 적용 또는 LIF없이. 그러나, 분화의 타이밍 및 효율 미디어 세포 (설명을 참조)에 따라 달라질 수있다. 여기에 표시된 실험을 위해 우리는이 EGFP 기자는 O에 노크가 (46C 마우스 ESC 라인을 사용10 % 혈청 및 LIF로 GMEM 재배 Sox1 내인성 대립 유전자의 NE). 최적의 결과는 세포가 해리와 N2B27 미디어에 플레이 팅하는 것이 중요하다; N2B27 항상 세포 replating에 비해 감소 된 분화 효율 결과를 단순히 GMEM / 혈청 / LIF의 용지 변경.

1. 10 % 혈청, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산 GMEM에서 세포를 성장 0.1 M 2- 머 캅토 에탄올, 100 유닛 / ㎖ LIF ^(13). 마우스 ESC, 판의 subconfluent 문화를 얻으려면 2 걸릴 것 T25 문화 플라스크에 넣고 1 × 10 ⁶ 세포 - 3 일.
2. 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰한다. 세포가 통로 subconfluent과 준비가되면, PBS로 두 번을 씻어. 세포 분리 시약 1 ㎖를 추가하고 2 인큐베이터로 돌아 - 5 분​​. 트립신 및 다른 효소는 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 도금 밀도가 될 필요가 있으므로, 그들은 adju 세포 부착에 부정적인 영향을 미칠 수있다다네.
3. 세포는 플레이트로부터 리프트 시작되면, 단일 세포 현탁액으로 그들을 이동시키다 용기를 탭. 15 mL의 원심 분리 튜브에 용지 및 세포 분리 및 시약 피펫 10 ㎖의 전체에 세포를 수집.
4. RT에서 3 분 동안 300 XG에 세포를 스핀.
5. 조심스럽게 뜨는을 대기음 아래 3로 pipetting에 의해 미리 예열 N2B27 10ml에 펠렛을 재현 탁 - 5 회. 아래 현탁액을 피펫 팅 할 때, 튜브의 측면에 대한 피펫은 거품을 만들지 않도록합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 세포를 세어 농도를 기록한다.
6. 단위 부피 당 세포의 수를 포함하는 세포 현탁액은 미리 예열 N2B27에 웰 당 도금 될 준비한다. 6 잘 접시에 cm ² 당 10,500 세포의 밀도는 (즉, 6 잘 요리 잘 당 1 × 10 ⁵ 세포)에 최적입니다. CM ² 괞 찮아 당 세포의 제안 수는 표 1을 참조하십시오세포 배양 용기의 다양한 팅 매체 볼륨.
7. 배양 용기로부터 젤라틴 대기음 표 1에 제시 및 부피 밀도에 따라 세포 현탁액을 접시.이 셀 중앙에 집중되므로 플레이트 소용돌이 마십시오. 37 ℃, 5 % CO _2에 습기가 인큐베이터에서 문화를 놓습니다.
8. 신선한 N2B27 모든 미디어를 대체하여 2 일 - 매 1 미디어를 변경합니다. 부드럽게 피펫 밀도에 영향을 다음 날에 분화 효율을 줄일 수있는 세포를 플러싱 등. 도금 후 초기 생존이 나쁜 경우, 하나의 셀을 판 : N2와 B27-보충 미디어의 3 믹스 처음 두 일 후에 N2B27로 변경. 세포 분화하기 시작하고 4 내에서 (여기에 사용 된 46C 세포주에서 기자의 녹색 형광으로 표시) Sox1 식 표시해야합니다 - 6 일.

3. 면역 형광 염색법

아니TE는 : 어떤 프로토콜 타입 용기에 적용될 수있다. 각 시약의 부피는 6 웰 플레이트 잘마다 설명하고 표면 영역을 확장 할 수 있습니다. Replating 나중에 낮은 가능성으로 인해 사용하지 않는 것이 좋습니다.

1. 차별화 매체를 제거하고 4 %의 500 μL (v / v)의 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정, 15 분 동안 둡니다.
2. 워시 ((v / v)의 트윈 20 0.5 %와 인산염 완충 식염수)을 두 번 PBS-T의 2 ml의 세포를 Permeabilize 하시려면. 세포를 4 ℃에서 최대 2 개월 동안 PBS-T에서 유지 될 수있다.
3. 10 % (이차 항체와 같은 종) (v / v)의 혈청과 PBS-T의 1 ml의 PBS-T를 교체합니다. 비 특이 적 결합을 차단하는 RT에서 로커 플레이트에 1 시간 부화.
4. 1 시간 후, PBS-T 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 βIII - tubulin에 대한 500 μL 마우스 IgG의에서 부화 (10 % 혈청 PBS-T에서 1000 1 희석). 판 로커에 넣고 4 ℃에서 O / N 두십시오.
5. 이 단계에서, 항상 용기를 보호빛에서. 다음, (10 % 혈청 PBS-T에서 2 μg의 / ㎖로 희석) 형광 표지 항 마우스 IgG 항체 500 ㎕를 추가, T-PBS로 두 번 세포를 씻어. 실온에서 1 시간 동안 판 로커에 넣어.
6. 다음 DAPI의 500 μl를 추가, PBS-T로 두 번 세포를 씻어 (PBS-T에서 0.5 ㎍ / ml의 희석)과 5 분 동안 둡니다.
7. 다시 세포를 세척하고, PBS-T에 보관하십시오. 세포는 촬영 준비가 4 ° C에서 최대 2 주 동안 유지 될 수있다. 그것은 고정 생균 또는 다른 시간에 고정 된 세포의 GFP 강도를 비교하는 부적절한 그래서 GFP 신호가 시간이 지남에 따라 페이드 참고.

이 실험에서, 우리는 신경 분화를 추적하기 위해, 내인성 Sox1-GFP 리포터와 마우스 배아 줄기 세포를 46C 세포주 ^(14)를 사용했다. Sox1, 신경 전구 세포에 대한 마커의 세포주, 식을 사용하여 녹색 형광으로 검출 할 수있다. 밀도 도금하여 신경 분화를 달성하는 중요한 요인이다. 마우스 배아 줄기 세포 / cm ² 10,500 88,500 개의 세포로부터 다양한 다른 밀도로 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다.도 1a는 6 웰 플레이트에 다른 도금 밀도에 의해 달성 분화 효율을 나타낸다. 차별화의 날 6 일, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고, 신경 세포 마커 βIII - tubulin에 대한 스테인드. 최적의 밀도 (10,500 세포 ^/ ㎠)에서 세포를 신경 전구 세포 및 신경 세포로 분화. 이는 신경 세포 마커, βIII - tubulin에 대한 Sox1-GFP 기자와 면역에서 녹색 형광 신호에 의해 관찰되었다. LOWER 도금 밀도 3 일 내에 세포 사멸되었다. 그러나, 너무 높은 밀도로 도금 (> 36,500 세포 / cm ²⁾ 녹색 셀 βIII-tubulin에 양성 세포의 감소 비율 결과.도 1b는 약 10 배 높은 세포 밀도를 필요 96- 웰 플레이트에서 수행되는 실험을 도시 최적 (155,000 세포 ^/ ㎠)와 (362500 세포 ^/ ㎠) 수준이 너무 합류에 도달합니다.

최적 밀도는 미디어 제제, 미디어 구성 요소 및 셀 배치, 세포 유형, 또는 이전의 배양 조건과 상이 할 수있다. 이것은 각각의 실험을 위해 도금 밀도를 최적화하는 것을 권장한다. 표 1은 최적화 단계에 포함되어야하는 다양한 플랫폼 효과적 도금 밀도 범위를 제공한다. 6 일 -,이 범위 내에서, (4) 내에서 분화 좋은 효율을 제공 밀도를 얻을 수 있어야한다.

차별화 E 중점차적으로. 자신의 형태를 변경 그림 2 SC하면 10,500 세포 ^/ ㎠에서 6 웰 플레이트에 도금 후 하루 6 일 1 셀과 식민지 형태를 보여줍니다. 세포 분화 조건에서 배양 매일 촬영. 기인 배양 조건의 변화에​​ 극도 처음 며칠에 중요한 세포 죽음을 볼 드문 일이 아니다. 그러나, 나머지 세포는 여전히 구별 할 수있다. 4 일에, 세포는 먼저 등장 Sox1-GFP 기자에서 녹색 형광 신호로 신경 전구 세포가되기 시작했다. 그러나, 6 일째에, 모든 세포는 Sox1 양성이다. 일부 비 신경 세포의 존재는 그럼에도 불구하고, 적당한 조건에서, 세포의 대부분은 신경 것, 예상된다.

도 1 분화 효율에 도금 밀도의 효과. 두 가지Sox1-GFP 기자 세포 (46C)의 밀도를 6 일 동안 프로토콜에 따라 도금과 차별화했다. 6 웰 플레이트 (A) 차별화. 96 웰 플레이트 (B)의 분화. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분화 과정에서 그림 2. 세포 형태학. 46C ESC를 6 웰 배양 판에 cm ² 당 10,500 세포에서 분화 및 세포 형태의 변화를 관찰하기 위해 매일 사진을 찍었다. 스케일 바 :. 300 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1은 상이한 크기의 용기에 대한 밀도 및 매체 볼륨 도금 제안했다.이 표에 도금 밀도 46C 세포주를 사용하여 측정 하였다. 최적의 결과를 위해 각 라인의 도금 밀도는 adj가되어야 할 수도usted.

단층 신경 분화 프로토콜은 십 년 ⁶ 이상 사용되어왔다. 프로토콜 한정 배지 구성되며, 전임상위한 시스템이 더 적용될 수 단층 시스템에서 수행, 고도로 효율적인 (예, 약물 스크리닝)을 사용한다. 그러나 분화 효율을 결정하는 몇 가지 중요한 요소가있다. 이 문서에서는 이러한 요인과 각 장애물에 대한 솔루션을 지적한다.

분화 조건 도금 후 세포 밀도는 아마도 가장 중요한 인자이다. 너무 낮은 밀도로 도금하면 죽음 셀에 이르게하는 동안 너무 높은 밀도로 도금하면 세포 분화 효율을 감소시킨다. 이러한 현상으로 인해자가 분비 성장 인자 시그널링 쉽다. Fgf4는 MAPK 캐스케이드를 활성화하고 ESC 차별화 ^(11)를 구동하는자가 분비 성장 인자이다. LIF는 ESC에 의해 생성 된 다른 사이토 카인이다. 그것은 15. 이 프로토콜은 N2B27의 사용은 신경 세포를 만들 수 있습니다. N2B27는 ESC 생존을 허용 다양한 요소를 포함하고 신경 세포 성장을 촉진하고 신경 분화 ^(6)을 억제 LIF 또는 BMP4를 포함하지 않습니다. 적절한 밀도, Fgf4 및 LIF 신호의 적절한 균형은 ESC 차별화 할 수 있다고 주장한다. 고밀도, 분비 LIF와 BMP 금지 차별화를 초과하는 금액. 반대로 너무 낮은 밀도 세포 이러한 비교적 최소 배지에서 생존을 손상했다. 분화하지 않고 세포의 다수가 나타날 때 현저한 세포 사멸이 관찰되는 경우, 도금 세포 수의 증가가 요구되는 반면에 따라서, 도금 수는 감소한다.

셀 번호 외에 간접적 도금 밀도에 영향을주는 다른 요인들이있다. 첫 번째 인자는 균일 표면 위에 세포를 배포하는 데 사용되는 기술에 의존 지방 세포 농도이며지역. 우리는 웰의 중앙에 세포를 농축하고 주위에 밀도가 너무 낮아지는 반면, 너무 높은 중앙에 밀도있게 때문에 잘 소용돌이 것은 좋지 않은 것으로 나타났다. 도금 또는 플레이트 좌우 요동하기 전에 세포 매체를 혼합, 예를 들어 기타 혼합 기술이 권장된다. 또한, 용기는 배양기에 배치되는 경우, 매체의 불균일 한 가열은 동심 링 패턴 셀들의 분포의 결과로, 웰의 중앙에 세포를 무 대류 력을 야기한다. 도금 날에 하단 미디어 볼륨이 효과를 감소하는 것이 좋습니다. 30 분 동안 인큐베이터 외부 판을두면 세포는 균일 한 도금 밀도를 달성하는 데 도움이 있습니다 혼합하기 전에 매체를 워밍업뿐만 아니라, 첨부 할 수 있습니다.

둘째, 선종 또한 명확 해 도금 밀도.도 1에 영향을 미치는 / 웰의 세포 수는 직선 SCA 수 없다는 것을 보여준다다른 용기의 표면적되었다 (즉, 셀 / 표면적 동일한 번호는 모든 용기 형으로 적용 할 수 없다). (큰 체적 / 면적 비율)은 더 작은 용기 매체, 소위 메 니스 커스의 오목면을 만든다 매체의 표면 장력에 의해 더 영향을 받는다. 표면 장력은 웰의 가장자리로 세포를 밀어 중심 밀도가 감소한다. 작은 용기 내의 매체 볼륨이 낮기 때문에 또한, 매체는 대류 력을 줄여 빠르게 데워. 따라서, 작은 용기에 세포를 메 니스 커스에 의해 효과 가장자리로 이동할 것이며, 대류 세력에 의해 중심으로 이동하지 않을 것이다. 중앙에서 최적 밀도를 얻기 위해 필요한 도금 밀도 높은 용기 따라서, 이하이다.

셋째, 세포의 상태는 도금에 앞서 간접적 도금 밀도 및 분화 효율에 영향을 미친다. 우리는 몇 가지 실험에서 최적의 밀도의 변화를 발견했다. 실험과첫 날에 더 높은 사망률 효율적인 분화 높은 밀도를 필요로했다. 혈청 및 LIF에서 ESC 배양 나이브 다 능성 세포의 이종 집단, 프라이밍 능성 세포 및 분화 된 세포의 ^16도 작은 숫자로 구성된다. 이러한 유형의 세포 생존 및 분화 조건에서 분화하는 다른 능력을 가지고있다. 프로토콜 번호가 아닌 셀들의 상태를 지시하기 때문에, 일부 실험은 예상했던 것보다 낮은 밀도를 초래 처음 ​​며칠에 죽을 더 분화 된 세포와 함께 시작할 수있다. 이 변화를 방지하기 위해, ESC의 일관된 문화는 각 상태 사이의 일정한 비율이 유지되어 있는지 확인해야합니다.

그렇다 밀도에서, 타이밍은 효율적인 분화를 달성하는 또 다른 요인이다. 이 책에서는 6 일 이내에 신경 전구 세포의 생성을 설명합니다. 그러나, 시간의 상태에 따라 달라질 수있다시작 ESC 문화. 상술 한 바와 같이, ESC 배양 분화 조건에 다르게 응답 할 수 혼합 집단이다. 세포 생존뿐만​​ 아니라 분화의 타이밍뿐만 배양 조성에 의해 영향을받을 것이다. 이 프로토콜은 LIF 및 BMP4, 또는 2I 및 LIF를 함유 N2B27 매체에서는 대부분의 ESC 배양 조건의 예에 적용될 수있다. 더 순진 세포가 문화가있는 경우, 더 긴 기간을 효율적으로 차별화를 위해 필요할 수 있습니다. 나이브 세포 프라이밍 상태로 전환하기 위해 더 많은 시간을 필요로하고 신경 전구 세포로 분화 할 수 있기 때문이다.

The authors have nothing to disclose.

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.