Biofunctionalized берлинская лазурь Наночастицы для мультимодальных молекулярной визуализации приложений

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Мультимодальные, молекулярная визуализация позволяет визуализировать биологические процессы на клеточном, субклеточном и молекулярном уровне резолюций с использованием нескольких взаимодополняющих методов визуализации. Эти визуализации агенты облегчить оценку в режиме реального времени путей и механизмов в естественных условиях, которые усиливают как диагностическую, так и терапевтическую эффективность. Эта статья представляет протокол для синтеза biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц (Pb NPS) - нового класса веществ для использования в смешанных, приложений молекулярной визуализации. В диагностические методы, заложенные в наночастиц, флуоресценции изображений и магнитно-резонансной томографии (МРТ), имеют дополнительные функции. ПБ НП обладают дизайном ядро-оболочка, где гадолиния и марганца включены в интерстициальных пространствах Б. решетки генерировать контрастные, как в Т ₁ и Т ₂ -weighted последовательностей. ПБ НП покрыты люминесцентным авидин с помощью электростатического себя-какsembly, что позволяет флуоресцентной томографии. Наночастицы покрытые авидином модифицированы биотинилированных лигандов, которые придают молекулярные возможности ориентации на наночастицах. Стабильность и токсичность наночастиц измеряются, а также их relaxivities МРТ. Мультимодальных, молекулярные возможности визуализации этих biofunctionalized PB НП затем продемонстрировали, используя их для флуоресценции изображений и молекулярной МРТ в пробирке.

Молекулярная визуализация является неинвазивным и направлены визуализации биологических процессов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях ^1. Молекулярная визуализация позволяет образец, чтобы оставаться в своем родном микросреды в то время как эндогенные пути и механизмы оцениваются в реальном времени. Как правило, молекулярная визуализация включает введение экзогенного агента для получения изображения в виде небольшой молекулы, макромолекулы, или наночастицы для визуализации, целевой, и проследить соответствующие физиологические процессы изучаемого ^2. Различные методы визуализации, которые были изучены в молекулярной визуализации включают МРТ, КТ, ПЭТ, ОФЭКТ, ультразвук, фотоакустика, спектроскопии комбинационного рассеяния света, биолюминесценции, флуоресценции, и прижизненный микроскопии ^3. Мультимодальные изображения является сочетание двух или более методов визуализации, где комбинация повышает способность визуализировать и охарактеризовать различные биологические процессы и события ^4. Multimodaл изображений использует сильные стороны отдельных методов визуализации, компенсируя при их индивидуальных ограничений ^3.

Эта статья представляет протокол для синтеза biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц (Pb NPS) - нового класса мультимодальных, молекулярных агентов визуализации. ПБ НП используются для флуоресценции изображений и молекулярной МРТ. PB является пигмент, состоящий из чередующихся железа (II) и (III) атомы железа в ГЦК-сети (рисунок 1). PB решетка состоит из линейных цианистых лигандов в Fe ^II - CN - Fe ^III связи, которая включает катионы, чтобы сбалансировать расходы в пределах своей трехмерной сети ^5. Способность ПБ включить катионы в его решетке эксплуатируется отдельно загрузке гадолиний и ионы марганца в ПБ НП для контрастные.

Основанием для преследуя дизайн наночастиц для контрастные из-заПреимущества Такая конструкция обеспечивает относительно текущих МРТ контрастных агентов. Подавляющее большинство FDA США, утвержденных МРТ контрастных агентов являются хелаты гадолиния, которые парамагнитного в природе и обеспечивают позитивные контраст спин-решеточной механизм релаксации ^6,7,8. По сравнению с одной гадолиния-хелата, что обеспечивает низкую интенсивность сигнала по себе, включение нескольких ионов гадолиния в пределах PB решетки наночастиц обеспечивает повышенную интенсивность сигнала (положительный контраст) ^3,9. Кроме того, наличие нескольких ионов гадолиния в ПБ решетки увеличивает общую спиновой плотности и величины пара- наночастиц, которая нарушает локальное магнитное поле в его окрестностях, тем самым формируя негативные контраст спин-спинового механизма релаксации. Таким образом, гадолиния, содержащий наночастицы функционировать как Т ₁ (положительная) и T ₂ (отрицательная) контрастных агентов ^10,11.

В подгруппе пациентов с нарушениями функции почек, администрация гадолиния на основе контрастных агентов была связана с развитием нефрогенной системный фиброз ^{8,12, 13.} Это наблюдение побудило расследование использования альтернативных парамагнитных ионов в качестве контрастных агентов для МРТ. Таким образом, универсальная конструкция из наночастиц выполнен с возможностью включать ионы марганца в PB решетки. Подобно гадолиний-хелатов, марганец также хелаты парамагнитных и, как правило, используется для обеспечения интенсивности положительный сигнал в МРТ ^7,14. Как и гадолиния, содержащий PB НЧ, содержащее марганец PB НЧ также функционировать как Т ₁ (положительной) и T ₂ (отрицательный) контрастных агентов.

Для включения возможности визуализации флуоресценции, наночастицы "сердечники" покрыты "биофункциональный" оболочки, состоящей из флуоресцентно-меченый авидин гликопротеина (фиг.1). Авидин не только обеспечивает визуализации флуоресценции, но также служит в качестве установочной платформы для биотинилированных лигандов, которые нацелены на специфические клетки и ткани. Авидин-биотин связь является одним из самых сильных известных, не-ковалентных связей, характеризующихся крайне сильным сродством между авидин и биотин ^15. Крепление биотинилированными лигандов авидин-покрытием PB НП наделяет молекулярные возможности направления к ПБ НП.

Мотивация за проведение флуоресценции и МРТ с использованием PB NPS потому, что эти диагностические методы обладают дополнительных возможностей. Флуоресцентной томографии является одним из наиболее широко используемых оптических методов молекулярной визуализации, и позволяет одновременно визуализации нескольких объектов с высокой чувствительностью ^1,16,17. Флуоресцентной томографии является безопасным, неинвазивным модальность, но связано с малой глубине проникновения и пространственным разрешением ^1,3,16. С другой стороны, МРТ генерирует высокое временное ANд пространственное разрешение неинвазивно и без необходимости ионизирующего излучения ^1,3,16. Однако МРТ страдает от низкой чувствительности. Поэтому флуоресценции изображений и МРТ были выбраны в качестве методов молекулярной визуализации из-за их дополнительных особенностей проникновения глубины, чувствительности и пространственным разрешением.

Эта статья представляет протокол для синтеза и biofunctionalization ПБ НП, гадолиний-содержащие ДСП NPS (GdPB), и содержащий марганец PB NPS (MnPB) ^10,11. Следующие способы описаны: 1) измерение размера, заряда, и временной стабильности наночастиц, 2) оценка цитотоксичности наночастиц, 3) Измерение МРТ relaxivities и 4) использование наночастиц для визуализации флуоресценции и молекулярной MR популяции целевых клеток в пробирке. Эти результаты демонстрируют потенциал наночастиц для использования в качестве мультимодальных, молекулярных агентов визуализации в естественных условиях.

1. Синтез PB НП, GdPB и MnPB

Синтез наночастиц (PB NPS, GdPB или MnPB) достигается с помощью схемы синтеза в одном реакторе, выполнив действия, описанные ниже:

1. Получают раствор "А", содержащий 5 мл 5 мМ калия гексацианоферрата (II) в деионизированной (ДИ) воды. В зависимости от типа наночастиц синтезируется - PB НП, GdPB или MnPB, приготовить раствор 'B' следующим образом:
   1. Для PB НЧ: подготовка 10 мл раствора, содержащего 2,5 мМ железа (III) хлорида в деионизированной воде.
   2. Для GdPB НЧ: подготовка 10 мл раствора, содержащего 2,5 мМ каждого из гадолиний (III), нитрат железа (III) хлорида в деионизированной воде
   3. Для MnPB НЧ: подготовка 10 мл раствора, содержащего 2,5 мМ каждого из марганца (II), хлорид железа (III) хлорида в деионизированной воде.
2. Добавить решение 'B' в круглодонную колбу и перемешивают содержимое колбы при комнатной температуре (RT) и1000 оборотов в минуту. Добавить решение »'каплям в колбу с круглым дном раствор, содержащий" B ". Управление скоростью потока для добавления раствора 'A' до 'B' с помощью перистальтического насоса, установленного для выдачи около 10 мл / ч.
3. Продолжить перемешивание при 1000 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение дополнительных 30 мин после добавления раствора "А" до "B" будет завершена. Остановка перемешивании и собирают смесь.
4. Трансфер аликвоты смеси в микропробирок для полоскания наночастиц бесплатно непрореагировавших компонентов. Добавить 5 М NaCl (0,2 мл NaCl / мл реакционной смеси) для каждой аликвоты для оказания помощи в сборе частиц путем центрифугирования.
5. Центрифуга Каждую аликвоту наночастиц, по крайней мере, 10 минут при 20000 × г. После центрифугирования, тщательно удалите супернатант.
6. Ресуспендируют каждый наночастиц осадок в 1 мл дистиллированной воды с помощью ультразвука, используя микронаконечником (обработка ультразвуком импульс включения / выключения = 1/1 сек, амплитуда = 50%, продолжительность =5 сек, Sonicator Номинальная мощность = 125 Вт), чтобы разбить гранул.
7. Повторите шаги 1.4-1.6, по крайней мере 3 × чтобы убедиться, что наночастицы могут свободно компонентов исходной реакции и побочных продуктов реакции. После окончательного центрифугировани, ресуспендируют частиц в 1 мл дистиллированной воды.

2. Biofunctionalization ПБ НП, GdPB и MnPB

Biofunctionalization наночастиц включает покрытие из наночастиц "сердечников" с авидином и добавления биотинилированных лигандов, как описано ниже:

1. Покрытие наночастиц с флуоресцентным авидина
   Покрытие наночастиц с флуоресцентным авидин достигается с помощью электростатического самосборки, где положительно заряженный авидин (PI ~ 10.5) наносят на отрицательно заряженных наночастиц следующим ^18:
   1. Подготовка суспензии ПБ НП, GdPB или MnPB в 1 мл дистиллированной воды. Фильтр Alexa Fluor 488-меченого авидин (A488; воссоздана в деионизированной воде)через нейлоновую микроцентрифужных 0,2 мкм фильтр при 14000 х г в течение 10 мин. Добавить ≤0.2 мг наночастиц авидин / мг. Добавить каждый отфильтрованный аликвоту A488 отдельно аликвот ПБ НП, GdPB или MnPB.
   2. Контакты наночастиц с A488 в течение 2-4 ч при осторожном встряхивании или поворота при 4 ° С. Защита образцы от света, используя алюминиевую фольгу.
      Примечание: Этот шаг дает A488 с покрытием PB NPS (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), и MnPB (MnPB-A488).
2. Крепление биотинилированные антитела
   Приложение биотинилированных антител, направленных на наночастицах покрытые авидином достигается с помощью авидин-биотин взаимодействия следующим образом:
   1. Подготовка суспензии авидин покрытием наночастиц - PB-A488, GdPB-A488 и MnPB-A488 в 1 мл дистиллированной воды. Фильтр биотинилированным антителом (поставляется производителем) через микроцентрифужную фильтром 0,2 мкм из нейлона на 14000 × г в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь Настоящее исследование использует Биоinylated анти-нейрон-глиальных антигена 2 (ANG2), предназначенного NG2 избыточно экспрессируется в клетках и тканях центральной нервной системы и биотинилированного антитела против человеческого эотаксина-3 (Eot3), предназначенного рецепторы избыточно экспрессируется на эозинофилов или эозинофильных клеточных линий.
   2. Добавить каждый отфильтрованный аликвоты биотинилированного антитела по отдельности к аликвоты наночастиц покрытые авидином. Добавить биотинилированного антитела наночастиц / мг покрытые авидином ≤0.05 мг. Контакты в покрытые авидином наночастицы с биотинилированных антител (ANG2 или Eot3) в течение 2-4 ч при осторожном встряхивании или поворота при 4 ° С. Защита образцы от света, используя алюминиевую фольгу.
      Примечание: Этот шаг дает, покрытые антителами, наночастицы (например, GdPB-A488-Eot3 и MnPB-A488-ANG2).

3. Размеры Зета потенциал, и временная стабильность наночастиц

Распределение размера, заряда и стабильность наночастиц измеряется с помощью динамическогоМетоды рассеяния света (DLS), как описано ниже:

1. Размеры наночастиц
   Калибровка наночастиц достигается с помощью динамического рассеяния света следующим образом:
   1. Добавить 10 мкл образца наночастиц (1 мг / мл) к 990 мкл деионизованной воды в одноразовой пластиковой кювете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это представительное значение для хорошего сигнала DLS.
   2. Закрывают кювету и перемешивают, чтобы хорошо перемешать. Поместите кювету в системе, используемой для анализа размера частиц, чтобы измерить размер наночастиц. Провести анализ размера частиц в измерительной углом 173 °.
2. Зета потенциал наночастиц
   Зета потенциал наночастиц измеряется с помощью рассеяния света фазовый анализ следующим образом:
   1. Добавить 100 мкл образца наночастиц (1 мг / мл) к 900 мкл деионизованной воды в одноразовых пластиковых капиллярного клетки. Это значение является репрезентативным для хорошего дзета-потенциал измерения.
   2. Поместите капилляру клеток в системе, используемой для анализа дзета-потенциал для того, чтобы измерить дзета-потенциал наночастиц с использованием параметров по умолчанию при 25 ° С.
3. Временная стабильность наночастиц
   Временная стабильность наночастиц измеряется с помощью динамического рассеяния света следующим образом:
   1. Оценка стабильности наночастиц путем измерения размеров наночастиц в дистиллированной воды, а также модифицированной среде Игла Игла (DMEM), как описано в разделе 3.1.
   2. Повторите измерения размера в ДИ воды и один раз DMEM / день в течение 5 дней.

4. Цитотоксичность наночастиц

Цитотоксичность наночастиц измеряется с помощью анализа клеточной пролиферации ХТТ следующим образом:

1. Семенной 10,000-15,000 клеток / лунку каждого типа клеток изучали (Neuro2a, BSG D10, EOL-1, и OE21) в 96-луночного планшета. Убедитесь, что общий объем засеянных клеток не электроннойXceed 0,2 мл / лунку. Инкубируйте семенами клеток в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
2. Обращение наночастиц с клетками:
   1. Инкубируйте клетки с разной концентрацией наночастиц (0,01 - 0,5 мг / мл). В Таблице 1 в качестве репрезентативного таблице, описывающей количество наночастиц (в 50 мкл) добавляли к клеткам после удаления 50 мкл среды / лунку.
      1. Для учета любого мешающего поглощения наночастиц в пределах анализа, добавить заготовки, состоящей из соответствующей концентрации наночастиц (0-0,5 мг / мл, а в эквивалентности сумм добавляли к клеткам) в среде без клеток.
   2. Инкубируйте клетки с наночастицами в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2. Аспирируйте носитель из каждой лунки и промыть окрашивающего буфера, состоящего из 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в фосфатно-буферном растворе (PBS). Добавить 100 мкл среды без фенола красного и инкубировать при 37 ° C и 5% CO ₂на 16-18 часов.
3. Подготовка XTT сотовый рабочего раствора анализа пролиферации путем смешивания компонентов комплекта (XTT реагента и XTT активатор) в соответствии с указаниями изготовителя. Аспирируйте носители из колодцев и добавить 100 мкл RPMI (RPMI без фенола красного + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) или соответствующей среде для этого типа клеток учился. Добавить 50 мкл ХТТ рабочего раствора в каждую лунку и инкубировать при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 2-2,5 ч.
4. Измеряют поглощение при 490 нм, с эталонной длине волны 630 нм для коррекции пальцев или пятен. Рассчитайте скорректированную оптическую плотность каждой лунки ₍₄₉₀ -А ₆₃₀₎ и усреднить показания для повторов.
5. Вычтите пустые показания каждого значения а для расчета окончательных скорректированных значений абсорбции. Рассчитать процент выживаемости для каждого образца путем нормализации окончательный исправленный поглощения в том, что необработанных клеток без наночастиц. Участок суrvival процент в зависимости от концентрации наночастиц.

5. МРТ Relaxivities ПБ НП, GdPB и MnPB

МРТ релаксация измеряется с помощью T ₁ - и Т ₂ -weighted последовательности по подготовке «Фантом» МРТ с использованием 96-луночного планшета, содержащую наночастицы, как описано ниже:

1. Phantom Подготовка
   1. Подготовка 96-луночного планшета в каждую лунку с 100 мкл, содержащих наночастицы (Pb NPS, GdPB или MnPB) в соответствующей концентрации. Начиная с концентрацией 0,4 мм для каждого типа наночастиц, последовательно не разбавить наночастицы 2 × с помощью DI водой до концентрации 2,4 × 10 ^-5 М достигается (это требует 14 разведения и 15 скважин).
   2. Добавить 100 мкл расплавленной 1% раствора агарозы в дистиллированной воды в каждую лунку и хорошо перемешать. Разрешить гель для затвердевания при 4 ° С в течение 12 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает фантом, содержащий серийные разведениянаночастицы в затвердевшей агарозы.
   3. Поместите фантом в горизонтальном 3 T клинической магнита под твердого блока 2% агара (150 см ^3). Безопасный призрак и блок агара в центре 8-канальной HD катушки мозга. Измерение времени релаксации с помощью 0,5 мм толщиной корональных ломтики на середине высоты в 96-луночный планшет ^11.
2. Т ₁ - Т ₂ -Weighted Последовательности
   Используйте следующие представительства настройки для получения последовательности в клинической магнита.
   Примечание: Эти значения оптимизированы для наночастиц, используемых в данном исследовании:
   1. Приобретать T ₁ -weighted (T1W) МРТ, используя следующую жидкости восстановление ослабленный обращения (FLAIR) последовательности: эхо-сигналов (ET) = 8, Время повторения (TR) = 2300 мс, эхо времени (TE) = 24,4 мс, размер матрицы = 512 х 224, поле зрения (FOV) = 16 х 16 см ^2.
   2. Приобретать T ₂ -weighted (T2W) МРТ-изображений с помощью следующей быстрый Relaxaция быстро спинового эха (FRFSE) последовательность: ET = 21; TR = 3500 мс; Те = 104 мс; Размер матрицы = 512 х 224; FOV = 16 х 16 см ^2.
   3. Приобретать T1W и T2W МРТ-изображений на 127 МГц (3 T) в следующих случаях обращения: 50, 177, 432, 942, 1961 и 4000 мс.
3. Измерение МРТ Relaxivities
   1. После приобретения T1W и T2W изображения с помощью последовательности, описанные в разделе 5.2, измерить интенсивность сигнала для каждой лунки, используя ImageJ, получившей название интересующей области (ROI), выбрав каждый ROI с помощью кнопки овальной культур, расположенный на главной панели инструментов, а затем выбрав Анализ> Измерить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: всплывающее должен отображать средней интенсивности сигнала каждого ROI на колонку под названием "Среднее".
   2. Для каждого ROI, участок интенсивность измеряемого сигнала от его специфической время инверсии. Если необходимо, инвертирование точки (показания), которые генерируют исходную "пузырь" или выбросы в начале участка (низший инверсиираза).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти показания генерируются при низких раз инверсии, потому что МРТ измеряет значение величины или абсолютной изображений, а не фактической (отрицательное) значение, которое должно быть учтено / с поправкой на ^19.
   3. Подготовка к экспоненциальному, пригодный для каждого участка интенсивности сигнала для трансформирования (СИ) в зависимости от времени обращения (T _I), как описано в разделе 5.2. Участок T _I на оси х, SI на оси ординат; ɑ и Δ постоянные, определяемые регрессии, и T ₁ или T ₂ переменная должна быть решена:
      
      где T = T _1, T _2.
   4. Решить для Т ₁ или Т ₂ с помощью приведенного выше уравнения и построить обратную вычисленных значений (1 / T ₁ и 1 / Т ₂₎ от концентрации наночастиц, используемых в каждом ROI.
   5. Рассчитайте наклон линейной графике, которыйВырабатывает relaxivities R ₁ и R _2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел протокола описывает применение наночастиц для флуоресцентного мечения и генерации контрастные в клетках-мишенях.

6. Флуоресцентная маркировка клеток-мишеней Использование наночастиц - конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: наночастицы (PB ИГ, GdPB и MnPB) могут быть использованы для флуоресцентно этикетке население клеток-мишеней (мониторинг с помощью конфокальной микроскопии) следующим образом:

1. Синтез флуоресцентного наночастиц
   1. Обобщить GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 для флуоресцентного мечения популяции клеток-мишеней, следуя инструкциям, изложенные в разделах 1 и 2.
2. Подготовка клеток для флуоресценции Ориентация
   1. Пальто нет. 1,5 микро покровные стекла погружением их в раствор 0,002% поли (L-лизина) гидробромида в течение 90 мин, Снимите крышку очки из раствора и дайте им высохнуть в течение 24 часов.
   2. Семена клетки (например, по окончании срока службы, 1, BSG D10, SUDIPG1) на покрытых покровных стеклах, помещенных в 6-луночный планшет и инкубируют при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение по меньшей мере 16 ч. Промыть клеток с раствором 1 × PBS и (необязательно) зафиксировать с помощью 10% формальдегида в нейтральном буферном растворе в течение 15 мин. Пятно клетки с 5 мкМ красно-оранжевого клеток-проникающего красителя в PBS при 37 ° С в течение 30 мин. Впоследствии, промыть клетки с PBS.
3. > Флуоресцентная маркировка клетки-мишени
   1. Добавить 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, в деионизированной воде) к клеткам, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание с клетками, и инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
   2. Инкубируйте клетки с наночастицами в 1% BSA в течение 1 часа. Для окончании срока службы-1: инкубируют с 0,2 мг / мл GdPB-A488 или GdPB-A488-Eot3; Для BSG D10 и SUDIPG1: инкубируют с 0,2 мг / мл MnPB-A488 или MnPB-A488-ANG2. Прополощите клетки с PBS 3 × удалить unbouй наночастиц.
   3. Осторожно переверните крышку стекла (клетки, содержащие и наночастиц) на предметное стекло микроскопа, гарантируя, что нет скопившийся воздух. Печать границу между покровного стекла и стекло микроскопа тщательно применения ясный лак для ногтей. Изображение клетки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

7. Флуоресцентная маркировка клеток-мишеней Использование наночастиц - проточной цитометрии

Наночастицы (Pb НЧ, GdPB и MnPB) могут быть использованы для флуоресцентно этикетке в популяцию клеток-мишеней (мониторинг с помощью проточной цитометрии) следующим образом:

1. Подготовка суспензии клеток мишенью в PBS. Для чистых культурологии, суспензии состоят из типа Single Cell (например, BSG D10); ресуспендируют осадок клеток в BSG из D10 клеток в PBS при 100000 клеток / мл (10 мл общего объема). Для смешанных исследований культуры, суспензии состоят из по меньшей мере двух типов клеток (например, по окончании срока службы-1 и OE21); аналогично BSG D10, ресуспендируют осадков клеток оконечных-1 и OE21 в PBS при 100000 клеток / мл в каждом (всего 10 мл).
   1. Подготовьте различные коэффициенты оконечных-1: OE21 1: 0 (2 мл EoL-1), 3: 1 (1,5 мл EoL-1, 0,5 мл OE21), 1: 1 (по 1 мл каждого из окончании срока службы 1 и OE21), 1: 3 (0.5 мл EoL-1, 1,5 мл OE21), 0: 1 (2 мл OE21).
2. Блок ячеек (чистые и смешанные суспензии) мишенью наночастиц с 2 мл 5% BSA, чтобы минимизировать неспецифическое связывание.
3. Добавить 1 мл (1 мг / мл) наночастиц к клеткам и инкубируют в течение 1 часа. Для BSG D10, инкубировать клетки с MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (контрольное антитело), ​​или MnPB-A488-ANG2). Для смесей оконечных-1 и OE21, инкубировать смеси с фиксированной суммы GdPB-A488-Eot3.
4. Промыть клетки свободные несвязанных наночастиц счет остановки образцов при 1000 х г в течение 5 мин по меньшей мере 3 × для удаления несвязанных частиц. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS и исправить 10% формальдегида в PBS. Пятно клетки путем инкубации с 10 мкг / мл7-D Aminoactinomytcin в PBS на льду в течение 30 мин. Промыть PBS, а затем анализируют 10000 стробированных клеток из каждого образца с использованием проточного цитометра.

8. Создание контрастные по целевым клеток с использованием наночастиц

Наночастицы (Pb ИГ, GdPB и MnPB) может быть использован для создания МРТ контраст (в обоих Т ₁ - Т ₂ и -weighted последовательностей) в популяции клеток-мишеней следующим образом:

1. Phantom Подготовка
   1. не растут клетки (например, BSG D10) в Т75 колбы до ~ 80% слияния. Используйте соответствующую среду роста и условия. Для BSG D10, растут клеток в DMEM, + 10% FBS и 1 × Pen-Strep при 37 ° С и 5% СО _2.
   2. Промыть клетки свободные среды с 5 мл PBS и блокировать клетки с 5 мл 1% BSA в PBS в течение 1 часа, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание. Добавить 5 мл (0,5 мг / мл) наночастиц к клеткам. Для BSG D10, инкубировать клетки с MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (контрольное антитело), ​​и МпРВ-A488-ANG2 в течение 1 часа.
   3. Промойте клетки 3 × с 5 мл PBS для удаления несвязанных наночастиц. Trypsinize клеток путем инкубации клеток с 2 мл трипсина ЭДТА 0,25% -ным раствором 1 × в течение 5 мин при 37 ° С и 5% CO _2, чтобы отделить их из колбы для фантомного препарата. Добавить 8 мл DMEM, чтобы утолить трипсинизации клеток.
   4. Сбор клетки центрифугированием их при 1000 х г в течение 5 мин; аспирата из супернатанта. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS и добавляют 1 мл 10% формальдегида в PBS, чтобы зафиксировать клетки. Добавить 100 мкл каждого образца в отдельной лунке 96-луночного планшета в.
   5. Добавить 100 мкл расплавленной 1% раствора агарозы в деионизированной воде в каждую лунку и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Разрешить гель для затвердевания при 4 ° С в течение 12 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает фантом, содержащий клетки с прикрепленными наночастиц в затвердевшей агарозы.
   6. Поместите фантом в горизонтальном 3 T клинической магнита рядом твердого блока 2% агара (150 см ^{3). Безопасный призрак и блок агара в центре 8-канальной HD катушки мозга. Измерьте времена релаксации с помощью 0,5-мм толщиной корональных срезов на середине высоты 96-луночного планшета 11.}
2. Т ₁ - Т ₂ -Weighted Последовательности
   Используйте следующие настройки для получения последовательности в клинической магнита МРТ:
   1. Приобретать T1W МРТ-изображений с помощью следующей спин-эхо: Эхо поезде (ET) = 1, Время повторения (TR) = 650 мс, эхо времени (TE) = 11 мсек, размер матрицы = 320 256, поле зрения (FOV) = 10 х 10 см ^2.
   2. Приобретать T2W МРТ-изображений, используя следующую последовательность FRFSE: ET = 28; TR = 3000 мс; Те = 101 мс; Размер матрицы = 384 х 288; FOV = 10 х 10 см ^2.
3. Обработка после приобретения
   1. Для удобства чтения, конвертировать исходный масштаб изображения в серых полутонах в цветовой гамме изображения, используя ImageJ: Выберите Image> Type> 8-Bit, чтобы преобразовать изображение в серое.
   2. Рассчитать нормированной интенсивности для каждого образца после вычитания вклада сигнала из агарозного раствора.

Использование схему синтеза в одном реакторе, наночастицы PB НП (средний диаметр 78,8 нм, индекс полидисперсности (PDI) = 0,230, вычисляемый путем динамического инструмента рассеяния света), GdPB (средний диаметр 164,2 нм, PDI = 0,102), или MnPB ( Средний диаметр 122,4 нм, PDI = 0,124), которые монодисперсных (как измерено с помощью DLS) могут быть последовательно синтезированный (фиг.2А). Измеренные дзета-потенциалы синтезированных наночастиц составляет менее -30 мВ (фиг.2В), что указывает на умеренную стабильность частиц в зависимости от их поверхностных зарядов. Синтезированные наночастицы обладают адекватной временной стабильности в течение 5 дней, как указано в их последовательных размеров (гидродинамических диаметра; фиг.2с).

При совместном инкубировали с клетками, наночастицы (PB ИГ, GdPB и MnPB) демонстрируют незначительное цитотоксичность в отношении клеток ниже определенных пороговых концентраций (рис 3). Цитотоксичность стуштампы PB НП на Neuro2a клеток показывают, незначительное цитотоксичность, когда совместно инкубировали с Neuro2a в более низких концентрациях, чем 0,67 × 10 ^-6 мг / элемент (рис 3а). Цитотоксичности исследования, проведенные совместно инкубации GdPB с оконечным-1 и OE21 клеток показывают, незначительное цитотоксичность GdPB на обоих типах клеток в более низких концентрациях, чем 0,25 × 10 ^-6 мг / ячейки (рис 3б). Похоже, цитотоксичность исследования показывают, незначительное цитотоксичность MnPB, когда совместно инкубировали с BSG D10 в более низких концентрациях, чем 0,25 × 10 ^-6 мг / ячейки (рис 3C). Дополнительное цитотоксичность MnPB и GdPB может быть связано с наличием дополнительных ионов (Mn ²⁺ для MnPB и Gd ³⁺ для GdPB) в ядре наночастиц.

МРТ исследования релаксивностью были проведены с использованием фантомов, состоящие из различных концентраций РВ парков, GdPB и MnPB. Исследования показывают полезность nanoparстицы, как МРТ контрастных агентов в обоих T1W и T2W последовательностей (рисунок 4). Об этом свидетельствует повышенной hyperintensities (положительный контраст) в Т ₁ -weighted последовательности и увеличение hypointensities (отрицательный контраст) в Т ₂ -weighted последовательностей с увеличением концентрации обоих GdPB (рис 4а) и MnPB (рис 4б). На основании измерений релаксация, MnPB умеренный Т ₁ агент и сильный Т ₂ агент, а GdPB сильный Т ₁ агент и умеренное Т ₂ Агент (фиг.4С). Измеренные relaxivities из GdPB и MnPB выгодно отличаются клинически утвержденных контрастных агентов ^{10, 11.}

В biofunctionalized PB НП в состоянии флуоресцентно этикетке население целевых клеток в пробирке (рис 5). Когда biofunctionalized с люминесцентными лампами авидин (A488) и биотинилированного анти-человеческого еotaxin-3 антитела (Eot3), GdPB может флуоресцентно целевой популяции по окончании срока службы-1 клеток (рис 5б). Управление GdPB наночастицы без Eot3 выставки незначительным связывания (рис 5А) Аналогичным образом, когда GdPB в biofunctionalized с люминесцентными лампами авидин (A488) и биотинилированного анти-нейронов глиальные антиген-2 (ANG2), наночастицы могут флуоресцентно целевой популяции BSG D10 и SUDIPG1 нейросферах (рис 5D и F), в то время как контроль наночастицы без таргетинга антитела не в состоянии флуоресцентно этикетке клетки (рис 5C и Е). Таким образом, эффективность таргетинга и флуоресцентные маркировки требуют присутствия как флуоресцентного авидином и биотинилированным таргетинга лиганда.

Возможность из biofunctionalized наночастиц флуоресцентно этикетке популяцию клеток, как количественно проточной цитометрии, подтверждает необходимость как флуоресцентного авидин и биотинylated таргетирования лиганд для эффективного флуоресцентных меток (рис 6). BSG D10 клетки в контакт с MnPB содержащий как A488 и ANG2 (MnPB-A488-ANG2) демонстрируют повышенную флуоресценцию (6А), и процент флуоресцентно меченных клеток (фиг 6B) по сравнению с контрольными флуоресцентные наночастицы с контрольным антителом (MnPB-A488 -abc) и без антитела (MnPB-A488). В biofunctionalized наночастицы способны флуоресцентно нацеливания на определенную субпопуляции клеток в смеси клеток (6С). Это показано в фиксированных количествах EoL-1-таргетинга, флуоресцентные GdPB (GdPB-A488-Eot3) контактируют с целевых клеток (EOL-1) и контрольных клеток (OE21). Флуоресцентные возрастает по мере пропорций EoL-1 увеличивается (увеличение интенсивности 488 сигнала Alexa Fluor, рисунок 6в) в смеси. Это указывает на специфичность наночастиц для этого суб-популяции клеток в СЕLL смесь.

В biofunctionalized PB НП увеличить контрастные в популяции клеток-мишеней (Рисунок 7). Когда BSG D10 клетки контактируют с аналогичными концентрации экспериментального (MnPB-A488-ANG2) и контроля (MnPB-A488-ABC и MnPB-A488) наночастиц, призраки демонстрируют повышенную гиперинтенсивности для клеток, контактировавших с MnPB-A488-ANG2 по сравнению с контрольной группой в T1W последовательности, и увеличение hypointensity для клеток, контактировавших с MnPB-A488-ANG2 по сравнению с контрольной группой в T2W последовательностей (7А). Анализ изображений из трансформирования в рамках фантома подтверждают эту тенденцию, где клетки писали с экспериментальными частиц проявляют значительно увеличенной интенсивности по сравнению с контрольной в последовательности T1W и значительно снизилась интенсивность по сравнению с контроля в T2W последовательностей (рис 7б).

Рисунок 1: дизайн ядро-оболочка ПБ НП. Ядро состоит из PB решетки, которая состоит из линейных цианистых лигандов в Fe ^II - CN -. Fe ^III связи Эти связи позволяют PB НП включать катионы в пределах своей трехмерной сети как средство балансирования расходов ^5. Этот катион-связывающая способность берлинской лазури используется для загрузки гадолиний и ионы марганца в решетке, который обеспечивает МРТ контраст. Сердечник, покрытый биофункциональные оболочки, состоящей из флуоресцентного авидином, с тем чтобы флуоресценции изображений и биотинилированных лигандов для того, чтобы молекулярный таргетинг.

Рисунок 2:. Размер, заряд и стабильность PB НП () Размер распределения PB (синий), GdPB (красный) и MnPB (черный) наночастицы измеряется DLS. (В ) дзета-потенциалы ПБ НП, GdPB и MnPB. (С) Временная стабильность PB (синий), GdPB (красный) и MnPB (черный) наночастицы в воде (сплошная линия) и DMEM (пунктирная) в течение пяти дней после их синтеза, измеренное с помощью DLS.

Рисунок 3:. Цитотоксичность ПБ НЧ цитотоксичности исследований с использованием различных концентраций (А) ПБ НЧ добавлен в фиксированном числе Neuro2a клеток (В) GdPB добавленной к фиксированному количеству оконечных-1 и OE-21 клетки, соответственно, и ( С) MnPB добавлен в фиксированном числе BSG D10 клеток. Выживаемость клеток рассчитывали на 24 и 48 ч. Воспроизводится с разрешения из работы 11, авторское право 2014 American Chemical Society; Ссылка 10 с разрешения Dove Press Ltd; и Ref 21 с разрешения Королевского химического общества.

Рисунок 4: МРТ и relaxivities из GdPB и MnPB на 3 Т. гиперинтенсивности в Т ₁ -weighted последовательности и hypointensity в Т ₂ -weighted последовательностей (а) GdPB и (б) MnPB в зависимости от концентрации наночастиц. (C) табулирования relaxitivies ПБ НП, GdPB и MnPB, измеренных на 3 Т. Воспроизводится с разрешения из работы 11, об авторском 2014 Американского химического общества.

Рисунок 5: Флуоресцентные маркировки клеток-мишеней с использованием biofunctionalized PB NPS, как измерено с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Изображения EOL-1 клеток, обработанных (А) управления (GdPB-A488) и (В) экспериментальные (GdPB-A488-Eot3. ) наночастиц.Изображения BSG нейросферах обрабатывают (C) управления (MnPB-A488) и (D) экспериментальные (MnPB-A488-ANG2) наночастиц. Изображения SUDIPG1 нейросферах обрабатывают (Е) управления (MnPB-A488) и (F) Экспериментальная (MnPB-A488-ANG2) наночастиц. Воспроизводится с разрешения из работы 11, авторское право 2014 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Флуоресцентные маркировки клеток-мишеней с использованием biofunctionalized PB NPS, измеренная с помощью проточной цитометрии () методом проточной цитометрии гистограмм BSG D10 клеток, обработанных с экспериментальными (MnPB-A488-ANG2) и управления (MnPB-A488-ABC и MnPB. -A488) наночастиц. (Б) Реrcentage из BSG D10 клеток из панели (А), которые являются люминесцентные (% от Alexa-Fluor положительного) при обработке экспериментальных (MnPB-A488-ANG2) и контроль (MnPB-A488-ABC и MnPB-A488) наночастицы **, р <0,05. (C) проточной цитометрии графиков разброса смеси клеток, содержащей различные пропорции EoL-1 (клетки-мишени) и OE21 (контрольные клетки) целевом наночастицами (GdPB-A488-Eot3). Воспроизводится с разрешения из работы 11, об авторском 2014 Американского химического общества и из работы 10 с разрешения Dove Press Ltd. , пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7:. Повышение МРТ контраст в клетках-мишенях с использованием biofunctionalized PB NPS () T ₁ -weighted и T <суб> 2 -weighted повышение контрастности в призраков, состоящих из фиксированного числа BSG D10 клеток, обработанных с экспериментальными (MnPB-A488-ANG2) и контроля (MnPB-A488-ABC и MnPB-A488) наночастиц. (B) нормированной интенсивности сигнала для BSG D10 клеток, обработанных с экспериментальными (MnPB-A488-ANG2) и контроля (MnPB-A488-ABC и MnPB-A488) наночастиц, ** р <0,05. Воспроизводится из работы 10 с разрешения Dove Press Ltd.

Эта статья представила методы синтеза нового класса мультимодальных, молекулярных агентов визуализации на основе biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц. Молекулярные методы визуализации, включенные в наночастицы флуоресценции изображений и молекулярная МРТ, из-за их дополнительных функций. В biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастицы имеют конструкцию ядро-оболочка. Ключевые шаги в синтезе этих наночастиц: 1) один горшок синтез, который дает ядер, которые состоят из берлинской лазури наночастиц (Pb NPS), гадолиний-содержащие ферроцинсодержащего наночастиц (GdPB), или марганецсодержащее ферроцинсодержащего наночастицы (MnPB), 2) biofunctionalization из наночастиц с использованием флуоресцентного авидин путем электростатического самосборки, и 3) крепления биотинилированных лигандов (антител) с наночастицами с использованием надежных авидин-биотин взаимодействий. И люминесцентные авидин и биотинилированные лиганды составляют biofФункциональные оболочки из наночастиц.

Синтез в одном сосуде приводит PB NPS, GdPB или MnPB, которые функционируют и как Т ₁ и Т ₂ контрастных агентов для МРТ. Количества парамагнитных ионов (гадолиния или марганца), загруженных в ядре наночастиц может быть изменена (увеличена или уменьшена) путем варьирования количества парамагнитных ионов, содержащих соли (гадолиния (III), нитрат и марганца (II), хлорид) в Синтез в одном сосуде (Шаг 1.2). Это приводит к измененным (увеличена или уменьшена) интенсивности сигнала МРТ. Тем не менее, эти изменения в схеме синтеза, может привести к нестабильной, сгруппированных наночастиц. Чтобы смягчить проблемы, связанные с агрегацией, синтез в одном сосуде, может быть модифицирован, чтобы включить размер, контролирующим укупорки агенты, такие как цитрат в процессе синтеза ^20.

Biofunctionalization ядер наночастиц достигается путем электростатического самосборки с дневным авидин, который ENABле флуоресценции изображений. Электростатический самосборка требуется противоположные заряды на поверхности наночастиц и полимера покрытия (в данной статье, флуоресцентные авидин). Чтобы изменить функциональность поверхности наночастиц, авидин может быть заменен положительно заряженных полимеров (например, полилизин или амин-группы, содержащей полиэтиленгликоль) в процессе синтеза. Однако относительные пропорции наночастиц и покрытия полимера должны быть оптимизированы, чтобы сохранить размер наночастиц и стабильности, и для предотвращения агрегации.

Добавление биотинилированных антител на наночастицы авидин покрытием придает молекулярные возможности таргетинга с наночастицами PB основе. Этот этап основан на прочном взаимодействии авидин и биотин (равновесной константой диссоциации, K _D ~ 10 ^-15). Как и в предыдущих шагах, относительные пропорции покрытые авидином наночастиц и биотинилированных лигандов должны быть опtimized таким образом, чтобы предотвратить биотинилированный лиганд от связывания одновременно два авидин покрытием наночастиц в результате агрегации наночастиц. Для молекулярной таргетинга, антитела могут быть заменены другими, направленных лигандов, таких как фрагменты антител (Fab), фрагмент одноцепочечный вариабельный (ScFv), пептиды, или аптамеров.

Основные преимущества этого метода для синтеза biofunctionalized наночастиц в качестве мультимодальных, молекулярные агенты изображений являются: 1) поверхностное один горшок (1-шаг) синтез ядер наночастиц, и 2) шагов последовательного контактирования (электростатический самосборка и avidin- биотин взаимодействия) для покрытия ядра наночастицы с Биофункциональные оболочки. Другие преимущества наночастиц включают тот факт, что берлинская лазурь (продается как Radiogardase) уже FDA утвержденных для использования человеком и что наночастицы, которые зависят от схемы синтеза в одном реакторе может быть использован в качестве МРТ контрастного вещества как в T ₁ ( положительный) и T _{2 <}/ SUB> (отрицательные) -weighted последовательности, которые не так легко достичь, используя другие контрастные агенты или наночастиц платформы без сложных схем синтеза или специализированных химических веществ для синтеза контрастных агентов. Ограничением метода является то, что синтез может привести к полидисперсных наночастиц с агрегатами, если относительные пропорции реагентов в шагах как основной наночастиц синтеза и биофункциональный оболочки покрытия не строго оптимизированы для реагентов, используемых в этих конкретных шагов. Например, относительные пропорции для нанесения наночастиц ядра с авидином, не может быть распространен на покрытие наночастиц с полилизин без предшествующих исследований по оптимизации.

После овладения техникой для синтеза biofunctionalized ферроцинсодержащего наночастиц, описанные здесь, это универсальная конструкция может быть модифицирована для молекулярных методов визуализации в естественных условиях. Это потребует ПЭГилирование наночастиц для нижней Immunogenicity и более длинные периоды циркуляции в естественных условиях. Как и в описанной конструкции здесь, ПБ НП может быть biofunctionalized с антителами ранее в естественных условиях администрации. Другие исследования включают в себя использование biofunctionalized PB НП для theranostic (одновременного терапия + диагностика) приложений в естественных условиях. Исследования, изучающие использование берлинской лазури наночастиц для фототермической терапии (на основе их поглощения характеристик при ближней инфракрасной длин волн) являются в настоящее время ^21.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).