Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Multimodale, imaging molecolare permette la visualizzazione dei processi biologici a risoluzioni cellulare, subcellulare, e a livello molecolare che utilizzano più tecniche di imaging complementari,. Questi agenti di imaging facilitano la valutazione in tempo reale dei percorsi e meccanismi in vivo, che migliorano sia efficacia diagnostica e terapeutica. Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) - una nuova classe di agenti per l'uso in applicazioni di imaging multimodali, molecolare. Le modalità di imaging incorporati nel nanoparticelle, imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica (MRI), hanno caratteristiche complementari. Le PB NP possiedono un design core-shell in cui gadolinio e ioni manganese incorporati negli spazi interstiziali del reticolo PB generano MRI contrasto, sia in T ₁ e T ₂ pesate sequenze. Le PB NP sono rivestiti con avidina fluorescente utilizzando elettrostatico auto-astaggio, che permette l'imaging di fluorescenza. Le nanoparticelle avidina rivestite vengono modificati con leganti biotinilati che conferiscono capacità di targeting molecolare ai nanoparticelle. La stabilità e la tossicità delle nanoparticelle sono misurati, così come i loro relassività MRI. I multimodali, capacità di imaging molecolare di questi biofunctionalized PB NP sono poi dimostrate utilizzandoli per imaging di fluorescenza e MRI molecolare in vitro.

L'imaging molecolare è la visualizzazione non invasiva e mirata dei processi biologici a livello cellulare, subcellulare e livello molecolare ^1. L'imaging molecolare permette un esemplare di rimanere nel suo microambiente nativa mentre i percorsi ei meccanismi endogeni sono valutati in tempo reale. Tipicamente, imaging molecolare prevede la somministrazione di un agente di imaging esogeno sotto forma di una piccola molecola, macromolecola, o nanoparticelle di visualizzare, destinazione, e tracciare processi fisiologici relativi allo studio ^2. Le varie modalità di imaging che sono state esplorate in imaging molecolare includono MRI, CT, PET, SPECT, ultrasuoni, fotoacustica, spettroscopia Raman, bioluminescenza, fluorescenza e microscopia intravitale ^3. Imaging multimodale è la combinazione di due o più modalità di imaging in cui la combinazione migliora la capacità di visualizzare e caratterizzare vari processi e ⁴ eventi biologici. Multimodal di imaging sfrutta i punti di forza delle singole tecniche di imaging, mentre compensando i loro limiti individuali ^3.

Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) - una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolare. Le PB PN sono utilizzati per imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare. PB è un pigmento costituito da un alternarsi di ferro (II) e ferro (III) atomi in un reticolo cubico a facce centrate (Figura 1). Il reticolo PB comprende ligandi cianuro lineari in un Fe ^II - CN - Fe ^III linkage che incorpora cationi per bilanciare oneri all'interno della rete tridimensionale ^5. La capacità di PB di incorporare cationi nel suo reticolo viene sfruttata caricando separatamente gadolinio e gli ioni di manganese nelle PN PB per MRI contrasto.

Il razionale per perseguire un progetto di nanoparticelle per MRI contrasto è a causa dii vantaggi questo disegno offre rispetto a mezzi di contrasto MRI attuali. La stragrande maggioranza degli agenti di contrasto MRI US FDA ha approvato sono chelati di gadolinio che sono paramagnetica in natura e forniscono contrasto positivo dal meccanismo relax ^6,7,8 spin-reticolo. Rispetto ad un singolo gadolinio chelato che fornisce bassa intensità di segnale propria, l'incorporazione di molteplici ioni gadolinio all'interno del reticolo PB delle nanoparticelle fornisce una maggiore intensità di segnale (contrasto positivo) ^3,9. Inoltre, la presenza di più ioni gadolinio all'interno del reticolo PB aumenta la densità di spin complessiva e la grandezza paramagnetismo delle nanoparticelle, che disturba il campo magnetico locale nelle sue vicinanze, generando contrasto negativo dal meccanismo di rilassamento spin-spin. Così le nanoparticelle contenenti gadolinio funzionano sia come T ₁ (positivo) e T ₂ agenti (negativo) contrasto ^10,11.

In un sottogruppo di pazienti con funzione renale compromessa, la somministrazione di mezzi di contrasto a base di gadolinio è stato collegato allo sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica ^{8,12, 13.} Questa osservazione ha spinto indagini l'uso di ioni paramagnetici alternativi come agenti di contrasto per MRI. Pertanto, il design versatile delle nanoparticelle è adattato per incorporare ioni manganese all'interno del reticolo PB. Simile al gadolinio-chelati, manganese chelati sono anche paramagnetica e sono tipicamente utilizzati per fornire intensità del segnale positivo in MRI ^7,14. Come con gadolinio contenenti PB PN, i-manganese contenenti PB NP funzionano anche come T ₁ (positivo) e T ₂ agenti (negativo) di contrasto.

Per incorporare funzionalità di imaging di fluorescenza, le nanoparticelle "core" sono rivestite con un guscio "biofunzionale" costituito dalla avidina fluorescenza marcata glicoproteina (Figura 1). Avidina consente non solo di imaging di fluorescenza, ma serve anche come piattaforma di attracco per ligandi biotinilati che colpiscono le cellule e tessuti specifici. Il legame avidina-biotina è uno dei più forti legami noti, non covalenti caratterizzati da estremamente forte affinità di legame tra avidina e biotina ^15. L'attaccamento di ligandi biotinilati al avidina rivestite PB NP conferisce capacità di targeting molecolare ai NP PB.

La motivazione per il perseguimento di fluorescenza e RM con PB NP è perché queste modalità di imaging possiedono caratteristiche complementari. Imaging di fluorescenza è una delle tecniche di imaging molecolare ottici più diffusi, e consente la visualizzazione simultanea di più oggetti ad alte sensibilità ^1,16,17. Imaging di fluorescenza è una cassetta di sicurezza, modalità non invasiva, ma è associato a basse profondità di penetrazione e risoluzioni spaziali ^1,3,16. D'altra parte, un MRI genera alta temporaled risoluzione spaziale in modo non invasivo e senza la necessità di radiazioni ionizzanti ^1,3,16. Tuttavia MRI soffre di bassa sensibilità. Pertanto imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica sono stati selezionati come le tecniche di imaging molecolare per le loro caratteristiche complementari di penetrazione di profondità, sensibilità e risoluzione spaziale.

Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi e biofunzionalizzazione delle NP PB, contenente gadolinio PB NP (GdPB), e contenente manganese PB NP (MnPB) ^10,11. I seguenti metodi sono descritti: 1) la misura di dimensioni, carica, e la stabilità temporale delle nanoparticelle, 2) valutazione della citotossicità delle nanoparticelle, 3) di misura della relassività MRI, e 4) utilizzazione delle nanoparticelle per fluorescenza e RM molecolare di una popolazione di cellule bersaglio in vitro. Questi risultati dimostrano il potenziale delle NP per l'uso come agenti di imaging multimodali, molecolari in vivo.

1. Sintesi di PB NP, GdPB, e MnPB

Sintesi delle nanoparticelle (PB NP, GdPB o MnPB) si ottiene utilizzando uno schema di sintesi one-pot eseguendo i passaggi di seguito indicati:

1. Preparare la soluzione 'A' contenente 5 ml di 5 esacianoferrato di potassio mm (II) in acqua deionizzata (DI) di acqua. A seconda del tipo di nanoparticelle essere sintetizzato - PB PN, GdPB o MnPB, preparare la soluzione 'B' come segue:
   1. Per PB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mM di ferro (III) cloruro in acqua deionizzata.
   2. Per GdPB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mm ciascuno di gadolinio (III) nitrato e ferro (III) cloruro in acqua deionizzata
   3. Per MnPB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mM ciascuno di manganese (II) cloruro e ferro (III) cloruro in acqua deionizzata.
2. Aggiungere la soluzione 'B' a un pallone da, e mescolare il contenuto della beuta a temperatura ambiente (RT) e1.000 rpm. Aggiungere la soluzione 'A' goccia a goccia nel round-bottom pallone contenente la soluzione 'B'. Controllare la portata per l'aggiunta di soluzione 'A' a 'B' da una pompa peristaltica impostato per erogare circa 10 ml / h.
3. Continuare agitazione a 1000 rpm a temperatura ambiente per altri 30 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di 'A' a 'B' è completa. Smettere di mescolare e raccogliere il composto.
4. Trasferire aliquote della miscela in tubi microcentrifuga per sciacquare le nanoparticelle libere di componenti che non hanno reagito. Aggiungere 5 M NaCl (0,2 ml NaCl miscela di reazione / ml) per ogni aliquota per facilitare la raccolta di particelle mediante centrifugazione.
5. Centrifugare ciascuna aliquota di nanoparticelle per almeno 10 min a 20.000 × g. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il surnatante.
6. Risospendere ogni pellet di nanoparticelle in acqua DI 1 ml tramite ultrasuoni utilizzando un microtip (impulso sonicazione on / off = 1/1 sec, ampiezza = 50%, la durata =5 sec, potere sonicator rating = 125 W) per rompere il pellet.
7. Ripetere i passaggi 1,4-1,6 almeno 3 × per garantire che le nanoparticelle sono privi di componenti dei sottoprodotti di reazione e di reazione iniziali. Dopo la centrifugazione finale, risospendere le particelle in acqua DI 1 ml.

2. biofunzionalizzazione di PB NP, GdPB, e MnPB

Biofunzionalizzazione delle nanoparticelle comporta rivestimento delle nanoparticelle "core" con avidina e aggiungendo ligandi biotinilati come descritto di seguito:

1. Rivestimento delle nanoparticelle con fluorescente Avidin
   Rivestimento delle nanoparticelle con avidina fluorescente viene ottenuta utilizzando elettrostatica autoassemblaggio dove caricata positivamente avidina (pI ~ 10.5) è rivestito a carica negativa nanoparticelle come segue ^18:
   1. Preparare sospensioni dei PN PB, GdPB o MnPB in acqua DI 1 ml. Filtro Alexa Fluor 488-marcato avidina (A488, ricostituito in acqua deionizzata)attraverso un filtro di nylon microcentrifuga 0,2 micron a 14.000 xg per 10 min. Aggiungi ≤0.2 mg avidina / mg nanoparticelle. Aggiungi ciascuna aliquota filtrato di A488 separatamente alle aliquote di PB NP, GdPB, o MnPB.
   2. Contattate le nanoparticelle con A488 per 2-4 ore con un leggero scuotimento o la rotazione a 4 ° C. Proteggere i campioni dalla luce con un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo A488 rese passo rivestito PB NP (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), e MnPB (MnPB-A488).
2. Allegato di Biotinylated Anticorpi
   Allegato di anticorpi rivolti biotinilati sul nanoparticelle avidina rivestite ha luogo con interazioni avidina-biotina come segue:
   1. Preparare sospensioni dei avidina rivestito nanoparticelle - PB-A488, GdPB-A488, e MnPB-A488 in acqua DI 1 ml. Filtro anticorpo biotinilato (come fornito dal costruttore) attraverso un filtro microcentrifuga 0,2 micron nylon a 14.000 xg per 10 min.
      NOTA: Qui, il presente studio utilizza biotinylated anti-neurone-gliali antigene 2 (ANG2) che gli obiettivi di NG2 overexpressed all'interno delle cellule e tessuti del sistema nervoso centrale e biotinilato eotaxina-3 anti-umano (Eot3) che gli obiettivi di recettori sovraespressi su eosinofili o linee cellulari eosinofili.
   2. Aggiungere ciascuna aliquota filtrato di anticorpo biotinilato separatamente alle aliquote delle nanoparticelle rivestite con avidina. Aggiungi ≤0.05 mg biotinilati nanoparticelle anticorpali / mg avidina rivestite. Contattate le nanoparticelle avidina rivestite con gli anticorpi biotinilati (ANG2 o Eot3) per 2-4 ore con agitando delicatamente o rotazione a 4 ° C. Proteggere i campioni dalla luce con un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo anticorpo rendimenti passo nanoparticelle rivestite (ad esempio GdPB-A488-Eot3 e MnPB-A488-ANG2).

3. Dimensionamento, Zeta potenziale, e temporale stabilità delle nanoparticelle

La distribuzione delle dimensioni, carica, e la stabilità delle nanoparticelle sono misurati usando dinamicadispersione della luce (DLS) metodi come descritto di seguito:

1. Dimensionamento delle nanoparticelle
   Il dimensionamento delle nanoparticelle è ottenuta utilizzando light scattering dinamico come segue:
   1. Aggiungere 10 ml di campione nanoparticelle (1 mg / ml) a 990 ml di acqua deionizzata in una cuvetta di plastica monouso.
      NOTA: Questo è il valore rappresentativo per un buon segnale DLS.
   2. Tappare la cuvetta e vortex per amalgamare bene. Posizionare la cuvetta in un sistema utilizzato per analizzare la dimensione delle particelle al fine di misurare le dimensioni delle nanoparticelle. Effettuare analisi granulometrica in un angolo di misura di 173 °.
2. Potenziale Zeta delle nanoparticelle
   Potenziale zeta delle nanoparticelle è misurata utilizzando dispersione analisi fase leggera come segue:
   1. Aggiungere 100 pl di campione nanoparticelle (1 mg / ml) a 900 ml di acqua deionizzata in una cella di plastica monouso capillare. Questo valore è rappresentativo di una buona misura di potenziale zeta.
   2. Posizionare il capillarey cella in un sistema utilizzato per analizzare il potenziale zeta per misurare il potenziale zeta delle nanoparticelle utilizzando parametri di default a 25 ° C.
3. Temporale stabilità delle nanoparticelle
   Stabilità temporale delle nanoparticelle è misurata utilizzando light scattering dinamico come segue:
   1. Valutare la stabilità di nanoparticelle misurando le dimensioni delle nanoparticelle in acqua DI nonché Modified Dulbecco Piano di Eagle (DMEM) come descritto nella sezione 3.1.
   2. Ripetere le misure di formato in acqua deionizzata e DMEM / die per un periodo di 5 giorni.

4. citotossicità delle nanoparticelle

La citotossicità delle nanoparticelle è misurata utilizzando un saggio di proliferazione cellulare XTT come segue:

1. Seed 10.000-15.000 cellule / e di ogni tipo di cellula studiati (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, e OE21) in una piastra da 96 pozzetti. Assicurarsi che il volume totale di cellule seminate non all'eXceed 0,2 ml / pozzetto. Incubare le cellule seminati durante la notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Come contattare nanoparticelle con le cellule:
   1. Incubare le cellule con concentrazioni variabili di nanoparticelle (0,01-0,5 mg / ml). Fare riferimento alla Tabella 1 come tavola rappresentativo che descrive la quantità di nanoparticelle (in 50 microlitri) aggiunto alle cellule dopo aver rimosso 50 ml di mezzo / pozzetto.
      1. Per tenere conto di qualsiasi assorbanza interferenza delle nanoparticelle all'interno del dosaggio, aggiungere un bianco costituito concentrazione appropriata di nanoparticelle (0-0,5 mg / ml, in equivalenza importi aggiunti alle cellule) a mezzo senza cellule.
   2. Incubare le cellule con nanoparticelle notte a 37 ° C e 5% di CO _2. Aspirare il terreno da ogni bene e sciacquare con tampone colorazione composto da 5% di siero fetale bovino (FBS) in soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 100 pl di media senza rosso fenolo e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂per 16-18 ore.
3. Preparare la soluzione di lavoro XTT cellulare proliferazione Assay mescolando i componenti del kit (XTT reagenti e XTT Activator) secondo le specifiche del produttore. Aspirare il supporto dai pozzetti e aggiungere 100 ml di RPMI (RPMI w / o fenolo rossi + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) o mezzo appropriato per il tipo di cella studiata. Aggiungere 50 ml di soluzione di lavoro XTT a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 2-2,5 ore.
4. Misurare l'assorbanza a 490 nm, con una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm per correggere le impronte digitali o macchie. Calcolare l'assorbanza corretta per ogni pozzetto (A ₄₉₀ -A ₆₃₀₎ e la media dei valori per i replicati.
5. Sottrarre le letture vuote di ogni valore e per calcolare i valori finali di assorbanza corretti. Calcolare la percentuale di sopravvivenza per ogni campione normalizzando il assorbanza corretta finale a quello delle cellule non trattate senza nanoparticelle. Trama survival percentuale in funzione della concentrazione di nanoparticelle.

5. MRI relassività dei PN PB, GdPB, e MnPB

Relassività MRI è misurata con T ₁ - e T ₂ pesate sequenze di preparazione di un "fantasma" MRI utilizzando una piastra a 96 pozzetti contenenti nanoparticelle come descritto di seguito:

1. Phantom Preparazione
   1. Preparare una piastra a 96 pozzetti con ogni ben contenenti nanoparticelle 100 microlitri (PB NPS GdPB o MnPB) alla concentrazione adeguata. Cominciando con una concentrazione di 0,4 mM per ogni tipo di nanoparticelle, serialmente diluire le nanoparticelle 2 × con acqua deionizzata fino a concentrazione di 2,4 × 10 ^-5 M è raggiunto (questo richiede 14 diluizioni e 15 pozzetti).
   2. Aggiungere 100 ml di soluzione di agarosio fuso 1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare bene. Lasciare il gel solidificare a 4 ° C per 12 ore.
      NOTA: Questo produce un fantasma contenente diluizioni seriali dile nanoparticelle in agarosio solidificata.
   3. Posizionare il fantasma in orizzontale 3 T magnete clinica sotto un blocco solido di 2% agar (150 cm ^3). Fissare la phantom e blocco di agar nel centro di una bobina di cervello HD 8 canali. Misurare tempi di rilassamento con 0,5 millimetri di spessore fette coronali a metà altezza della piastra a 96 pozzetti ^11.
2. T ₁ - e T ₂ pesate Sequenze
   Utilizzare le seguenti impostazioni rappresentativi per acquisire le sequenze nel magnete clinica.
   NOTA: Questi valori sono ottimizzati per le nanoparticelle utilizzati in questo studio:
   1. Acquisire T ₁ pesate immagini (T1W) MR utilizzando la seguente FLAIR (FLAIR) sequenza: Echo treno (ET) = 8, tempo di ripetizione (TR) = 2.300 msec, tempo di Echo (TE) = 24,4 msec, dimensioni Matrix = 512 x 224, Campo visivo (FOV) = 16 x 16 cm ^2.
   2. Acquisire T ₂ pesate immagini (T2W) MR utilizzando il seguente Relaxa velocezione rapida sequenza spin echo (FRFSE): ET = 21; TR = 3.500 msec; TE = 104 msec; Size = Matrice 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm ^2.
   3. Acquisire T1W e T2W MR immagini a 127 MHz (3 T) con i seguenti orari di inversione: 50, 177, 432, 942, 1.961, e 4.000 msec.
3. Misurare le relassività MRI
   1. Dopo aver acquisito T1W e T2w immagini utilizzando le sequenze descritte nella sezione 5.2, misurare l'intensità del segnale per ciascun pozzetto utilizzando ImageJ, d'ora in poi designata come regione di interesse (ROI) selezionando ogni ROI utilizzando il pulsante raccolto ovale trova sulla barra degli strumenti principale, quindi selezionando Analizza> Misura.
      NOTA: Un pop-up dovrebbe visualizzare l'intensità del segnale media di ciascun ROI sotto la colonna "Media".
   2. Per ogni ROI, tracciare l'intensità del segnale misurata contro il suo tempo di inversione specifico. Se necessario, i punti di inversione (letture) che generano una "bolla" iniziale o valori anomali all'inizio della trama (inversione inferiorevolte).
      NOTA: Queste letture sono generati a volte bassi inversione perché MRI misura il valore grandezza o assoluta delle immagini, piuttosto che il loro valore reale (negativo), che deve essere rappresentato / corretto per ^19.
   3. Preparare una misura esponenziale per ogni appezzamento di intensità del segnale per il ROI (SI) vs. volte inversione (T _I), come descritto nella sezione 5.2. Plot T _I sulla asse x, SI sul y; ɑ e Δ sono costanti determinate da una regressione, e T ₁ o T ₂ è la variabile da risolvere:
      
      in cui t = T _1, T _2.
   4. Risolvere per T ₁ o T ₂ usando l'equazione di cui sopra e tracciare l'inverso dei valori calcolati (1 / T ₁ e 1 / T ₂₎ contro le concentrazioni delle nanoparticelle utilizzati in ogni ROI.
   5. Calcolare la pendenza del grafico lineare cheproduce la relassività r ₁ e r _2.
      NOTA: La seguente sezione del protocollo descrive l'applicazione delle nanoparticelle per marcatura fluorescente e generando MRI contrasto nelle cellule bersaglio.

6. Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle - Microscopia confocale

NOTA: Le nanoparticelle (NP PB, GdPB, e MnPB) può essere utilizzato per etichettare fluorescente una popolazione di cellule bersaglio (monitorati mediante microscopia confocale) come segue:

1. Sintesi del fluorescente nanoparticelle
   1. Sintetizzare GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 per l'etichettatura fluorescente di una popolazione di cellule bersaglio seguendo i passaggi descritti nelle sezioni 1 e 2.
2. Preparazione di cellule per fluorescenza targeting
   1. Coat no. 1,5 micro vetrini coprioggetto per immersione in una soluzione di 0,002% di poli (L-lisina) bromidrato per 90 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione e lasciarli asciugare per 24 ore.
   2. Semi le cellule (ad es EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) sui vetrini coprioggetto rivestiti collocati in una piastra da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per almeno 16 ore. Risciacquare le cellule con una soluzione 1 × PBS e (opzionale) fissare con 10% di formaldeide in soluzione tampone neutro per 15 min. Macchia cellule con 5 mM rosso-arancio colorante cellule permeanti in PBS a 37 ° C per 30 min. Successivamente, lavare le cellule con PBS.
3. > Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio
   1. Aggiungere 1% di albumina sierica bovina (BSA; in acqua DI) alle cellule per minimizzare legame non specifico sulle cellule, e incubare a 37 ° C per 1 ora.
   2. Incubare le cellule con le nanoparticelle in 1% BSA per 1 ora. Per EoL-1: incubare con 0,2 mg / ml GdPB-A488 o GdPB-A488-Eot3; Per BSG D10 e SUDIPG1: incubare con 0,2 mg / ml MnPB-A488 o MnPB-A488-ANG2. Lavare le cellule con PBS 3 × per rimuovere unbounanoparticelle nd.
   3. Invertire con cautela il vetro di copertura (contenente cellule e nanoparticelle) su un vetrino da microscopio, assicurando che non ci siano bolle d'aria intrappolate. Sigillare il bordo tra il vetro di copertura e vetrino da microscopio applicando accuratamente smalto trasparente. Immagine le cellule utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.

7. Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle - Citometria a flusso

Le nanoparticelle (PB NP, GdPB, e MnPB) possono essere utilizzati per l'etichetta fluorescente una popolazione di cellule bersaglio (monitorato mediante citometria di flusso) come segue:

1. Preparare sospensioni delle cellule presi di mira in PBS. Per gli studi di coltura pura, le sospensioni sono costituite da un unico tipo di cellule (ad esempio BSG D10); risospendere il pellet cellulare delle cellule D10 BSG in PBS a 100.000 cellule / ml (10 ml in totale). Per gli studi di coltura mista, le sospensioni sono costituiti da almeno due tipi di cellule (ad esempio EoL-1 e OE21); simile a BSG D10, pellet cellulari risospendere di EoL-1 e OE21 in PBS a 100.000 cellule / ml ciascuna (totale 10 ml).
   1. Preparare diversi rapporti di EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml ciascuna di EoL-1 e OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
2. Bloccare le cellule (sospensioni pure e miste) nel mirino di nanoparticelle con 2 ml di 5% BSA per ridurre al minimo legame non specifico.
3. Aggiungere 1 ml (1 mg / ml) nanoparticelle alle cellule e incubare per 1 ora. Per BSG D10, incubare cellule con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo di controllo), o MnPB-A488-ANG2). Per le miscele di EoL-1 e OE21, incubare le miscele con un importo fisso di GdPB-A488-Eot3.
4. Lavare le celle libere di nanoparticelle non legate riducendo la velocità dei campioni a 1.000 × g per 5 minuti almeno 3 × per rimuovere le particelle non legate. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS e fissare con il 10% di formaldeide in PBS. Cellule Macchia di incubazione con 10 mg / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS in ghiaccio per 30 min. Risciacquare con PBS, quindi analizzare 10.000 cellule gated da ogni campione utilizzando un citofluorimetro.

8. Generazione MRI contrasto su cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle

Le nanoparticelle (PB NPS GdPB e MnPB) possono essere utilizzati per generare contrasto MRI (in entrambe T ₁ - e T ₂ pesate sequenze) in una popolazione di cellule bersaglio come segue:

1. Phantom Preparazione
   1. Crescere cellule (ad esempio BSG D10) in fusti T75 fino ~ 80% di confluenza. Usare appropriate medio e condizioni di crescita. Per BSG D10, crescere le cellule in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C e 5% CO _2.
   2. Risciacquare le cellule libera di media con 5 ml di PBS e bloccare le cellule con 5 ml di 1% BSA in PBS per 1 ora per minimizzare legame non specifico. Aggiungere 5 ml (0,5 mg / ml) nanoparticelle alle cellule. Per BSG D10, incubare le cellule con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo di controllo), e MnPB-A488-ANG2 per 1 ora.
   3. Lavare le cellule 3 × con 5 ml di PBS per rimuovere le nanoparticelle non legate. Trypsinize le cellule incubando le cellule con 2 ml di tripsina EDTA soluzione 0,25% 1 × per 5 min a 37 ° C e 5% CO ₂ per staccarle dalla muffola per la preparazione phantom. Aggiungere 8 ml di DMEM per placare la tripsinizzazione delle cellule.
   4. Raccogliere le cellule da essi centrifugazione a 1000 xg per 5 min; Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS e aggiungere 1 ml di formaldeide al 10% in PBS per fissare le cellule. Aggiungere 100 pl di ciascun campione di un pozzo separata di una piastra a 96 pozzetti.
   5. Aggiungere 100 ml di soluzione di agarosio fuso 1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare bene pipettando su e giù. Lasciare il gel solidificare a 4 ° C per 12 ore.
      NOTA: Questo produce un fantasma che contiene cellule con nanoparticelle attaccate in agarosio solidificato.
   6. Posizionare il fantasma in orizzontale 3 T magnete clinica accanto a un blocco solido di 2% agar (150 cm ^{3). Fissare la phantom e blocco di agar nel centro di una bobina di cervello HD 8 canali. Misurare tempi di rilassamento con 0,5 mm di spessore fette coronali a metà altezza della piastra a 96 pozzetti 11.}
2. T ₁ - e T ₂ pesate Sequenze
   Utilizzare le seguenti impostazioni per acquisire le sequenze nel magnete MRI clinica:
   1. Acquisire le immagini T1W RM con la seguente rotazione echo: Echo treno (ET) = 1, tempo di ripetizione (TR) = 650 msec, tempo di Echo (TE) = 11 msec, dimensione Matrix = 320 x 256, Campo visivo (FOV) = 10 x 10 cm ^2.
   2. Acquisire le immagini T2W RM utilizzando la seguente sequenza FRFSE: ET = 28; TR = 3.000 msec; TE = 101 msec; Size = Matrice 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm ^2.
3. Post-acquisizione Processing
   1. Per facilitare la lettura, convertire le immagini in scala di grigi originali in un'immagine scala di colori utilizzando ImageJ: Selezionare Immagine> Tipo> 8-Bit, per convertire l'immagine in scala di grigi.
   2. Calcolare l'intensità normalizzata per ciascun campione dopo aver sottratto il contributo del segnale dalla soluzione di agarosio.

Utilizzando lo schema di sintesi one-pot, nanoparticelle di PB NP (diametro medio 78,8 nm, indice di polidispersità (PDI) = 0,230, calcolato dallo strumento dynamic light scattering), GdPB (diametro medio 164,2 nm, PDI = 0,102), o MnPB ( diametro medio 122,4 nm, PDI = 0.124) che sono monodisperse (misurata dal DLS) può essere sintetizzato in modo coerente (Figura 2A). I potenziali zeta misurati sui nanoparticelle sintetizzati sono inferiori a -30 mV (Figura 2B), indicando moderata stabilità delle particelle in base alle loro cariche superficiali. Le nanoparticelle sintetizzati presentano un'adeguata stabilità temporale in un periodo di 5 giorni come indicato dalle loro dimensioni consistenti (diametri idrodinamici; Figura 2C).

Quando co-incubate con cellule, le nanoparticelle (NP PB, GdPB e MnPB) mostrano citotossicità trascurabile alle celle sotto determinate concentrazioni soglia (Figura 3). Citotossicità stumuore di PB NP sulle cellule Neuro2a indicano citotossicità trascurabile quando co-incubate con Neuro2a a concentrazioni inferiori a 0,67 × 10 ^-6 mg / cella (Figura 3A). Studi di citotossicità condotti da co-incubazione delle cellule con GdPB EOL-1 e OE21 indicano citotossicità trascurabile GdPB su entrambi i tipi di cellule a concentrazioni inferiori a 0,25 × 10 ^-6 mg / cella (Figura 3B). Simili, studi di citotossicità indicano citotossicità trascurabile MnPB quando co-incubate con BSG D10 a concentrazioni inferiori a 0,25 × 10 ^-6 mg / cella (Figura 3C). La citotossicità supplementare di MnPB e GdPB può essere attribuita alla presenza di ioni supplementari (Mn ²⁺ per MnPB e Gd ³⁺ per GdPB) all'interno del nucleo nanoparticelle.

Studi relassività MRI sono stati condotti utilizzando fantasmi composto da diverse concentrazioni di PB NP, GdPB, e MnPB. Gli studi indicano l'utilità della nanoparticelle come agenti di contrasto per MRI sia T1W e sequenze T2w (Figura 4). Lo dimostra l'aumento iperintensità (contrasto positivo) in T ₁ pesate sequenze e aumento hypointensities (contrasto negativo) in T ₂ pesate sequenze con concentrazioni crescenti di entrambi GdPB (4A) e MnPB (Figura 4B). Sulla base delle misure di relassività, MnPB è un moderato T ₁ agente e un forte agente T ₂ mentre GdPB è un forte agente T ₁ e T ₂ moderata agente (Figura 4C). Le relassività misurati di GdPB e MnPB reggono bene il confronto con quelli di agenti di contrasto clinicamente approvati ^{10, 11.}

Le PB PN biofunctionalized sono in grado di etichettare fluorescente una popolazione di cellule bersaglio in vitro (Figura 5). Quando biofunctionalized sia con avidina fluorescente (A488) e biotinilato e anti-umanootaxin-3 anticorpi (Eot3), GdPB può fluorescente indirizzare una popolazione di EoL-1 le cellule (Figura 5B). Nanoparticelle di controllo GdPB senza Eot3 mostra un legame trascurabile (Figura 5A) Allo stesso modo, quando si GdPB biofunctionalized sia con avidina fluorescente (A488) e biotinilato anti-neuronale gliale antigene-2 ​​(ANG2), le nanoparticelle possono fluorescente indirizzare popolazioni di BSG D10 e neurosfere SUDIPG1 (Figure 5D e F), mentre le nanoparticelle di controllo senza l'anticorpo di targeting sono in grado di etichettare fluorescente cellule (Figure 5C ed E). Così, il targeting efficiente ed etichettatura fluorescenti richiedono la presenza sia avidina fluorescenti e il ligando di targeting biotinilato.

La capacità delle nanoparticelle biofunctionalized per etichettare fluorescente una popolazione di cellule, come quantificato mediante citometria a flusso, conferma la necessità per entrambi avidina fluorescenti e biotinaligando ylated-targeting per l'etichettatura fluorescente efficace (Figura 6). Cellule D10 BSG contatto con MnPB contenente sia A488 e ANG2 (MnPB-A488-ANG2) mostra un aumento della fluorescenza (Figura 6A) e la percentuale di cellule fluorescenza marcata (Figura 6B) rispetto al controllo nanoparticelle fluorescenti con un anticorpo di controllo (MnPB-A488 -abc) e senza un anticorpo (MnPB-A488). Le nanoparticelle biofunctionalized sono in grado di indirizzare fluorescente uno specifico sub-popolazione di cellule all'interno di una miscela di cellule (Figura 6C). Ciò è dimostrato come importi fissi di EoL-1-targeting, GdPB fluorescente (GdPB-A488-Eot3) vengono a contatto con le cellule bersaglio (EOL-1) e le cellule di controllo (OE21). Aumenta fluorescenza proporzioni di EoL-1 sono aumentati (aumento Alexa Fluor 488 intensità del segnale; Figura 6C) nella miscela. Questo indica la specificità delle nanoparticelle per questo sotto-popolazione di cellule all'interno della cemiscela ll.

Le PB PN biofunctionalized aumentare MRI contrasto in una popolazione di cellule bersaglio (Figura 7). Quando le cellule D10 BSG vengono contattate con concentrazioni equivalenti di sperimentale (MnPB-A488-ANG2) e di controllo (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanoparticelle, fantasmi mostra aumentato iperintensità di cellule contattati con MnPB-A488-ANG2 rispetto ai controlli in sequenze T1W, e una maggiore ipointensità per celle contattati con MnPB-A488-ANG2 rispetto ai controlli in sequenze T2w (Figura 7A). L'analisi delle immagini dei ROI all'interno fantasma confermano questa tendenza, dove le cellule contattati con particelle sperimentali esibiscono significativamente aumentati di intensità rispetto ai controlli in sequenze T1W e diminuito significativamente intensità relativa ai controlli in sequenze T2w (Figura 7B).

Figura 1: Il disegno core-shell dei NP PB. Il nucleo è costituito da un reticolo PB, che comprende ligandi cianuro lineari in Fe ^II - CN -. Fe ^III linkage Questi collegamenti consentono PB PN per incorporare cationi all'interno della rete tridimensionale come mezzo di oneri di bilanciamento ^5. Questa capacità-cazione vincolante del blu di Prussia è utilizzata per caricare gadolinio e ioni manganese all'interno del reticolo, che fornisce MRI contrasto. Il nucleo viene rivestito con un guscio biofunzionale composto avidina fluorescente per consentire fluorescenza imaging e ligandi biotinilati per consentire il targeting molecolare.

Figura 2:. Dimensioni, carica, e la stabilità delle NP PB (A) distribuzioni di dimensione di PB (blu), GdPB (rosso) e MnPB (nero) nanoparticelle misurato con DLS. (B ) Zeta potenzialità del PB NP, GdPB, e MnPB. (C) la stabilità temporale di PB (blu), GdPB (rosso) e MnPB (nero) nanoparticelle in acqua (solido) e DMEM (tratteggiata) per cinque giorni dopo la loro sintesi, misurata mediante DLS.

Figura 3:. Citotossicità delle nanoparticelle PB studi di citotossicità con varie concentrazioni di (A) PB PN aggiunto un numero fisso di cellule Neuro2a (B) GdPB aggiunto un importo fisso di EoL-1 e OE di 21 cellule, rispettivamente e ( C) MnPB aggiunto un numero fisso di celle D10 BSG. Cella tasso di sopravvivenza è stato calcolato a 24 e 48 ore. Riprodotto con il permesso di Rif 11, copyright 2014 American Chemical Society; Rif 10 con il permesso di Colomba Press Ltd; e Ref 21 con il permesso della Royal Society of Chemistry.

Figura 4: immagini RM e relassività di GdPB e MnPB a 3 T. iperintensità a T ₁ pesate sequenze e ipointensità in T ₂ pesate sequenze di (A) GdPB e (B) MnPB in funzione della concentrazione delle nanoparticelle. (C) tabulazione dei relaxitivies di PB NP, GdPB e MnPB valutate al 3 T. Riprodotto con il permesso di Rif 11, copyright 2014 American Chemical Society.

Figura 5: etichettatura fluorescente delle cellule bersaglio utilizzando le PB PN biofunctionalized, misurata in termini di scansione laser confocale Immagini di EOL-1 cellule trattate con il controllo (A) (GdPB-A488) e (B) sperimentale (GdPB-A488-Eot3. ) nanoparticelle.Immagini di neurosfere BSG trattati con il controllo (C) (MnPB-A488) e (D) sperimentali (MnPB-A488-ANG2) nanoparticelle. Immagini di neurosfere SUDIPG1 trattati con il controllo (E) (MnPB-A488) e (F) sperimentali (MnPB-A488-ANG2) nanoparticelle. Riprodotto con il permesso di Rif 11, copyright 2014 American Chemical Society. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: etichettatura fluorescente delle cellule bersaglio utilizzando le PB PN biofunctionalized, come misurato mediante citometria di flusso (A) di citometria a flusso istogrammi di cellule D10 BSG trattate con sperimentale (MnPB-A488-ANG2) e di controllo (MnPB-A488-ABC e MnPB. -A488) nanoparticelle. (B) Percentuale di cellule D10 BSG dal pannello (A) che sono fluorescenti (% di Alexa-Fluor positivo) in seguito a trattamento con sperimentale (MnPB-A488-ANG2) e di controllo (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanoparticelle, ** p <0.05. (C) Citometria a flusso grafici a dispersione di una miscela di cellule contenente vari tenori di EoL-1 (cellule bersaglio) e OE21 (cellule di controllo) mira da nanoparticelle (GdPB-A488-Eot3). Riprodotto con il permesso di Rif 11, copyright 2014 American Chemical Society e dal Ref 10 con il permesso di Colomba Press Ltd. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7:. L'aumento MRI contrasto nelle cellule bersaglio utilizzando le PB PN biofunctionalized (A) T ₁ pesate e T _{2 pesate contrast enhancement in fantasmi composti da un numero fisso di celle D10 BSG trattate con sperimentale (MnPB-A488-ANG2) e di controllo (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanoparticelle. (B) Intensità segnale normalizzato per le cellule BSG D10 trattate con sperimentale (MnPB-A488-ANG2) e di controllo (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanoparticelle, ** p <0.05. Tratto da Ref 10 con il permesso di Colomba Press Ltd.}

Questo articolo ha presentato i metodi per la sintesi di una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolari basati su biofunctionalized Prussia nanoparticelle blu. Le modalità di imaging molecolare incorporati nelle nanoparticelle sono imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare, a causa delle loro caratteristiche complementari. Le nanoparticelle di Prussia blu biofunctionalized hanno un design core-shell. I passaggi chiave nella sintesi di queste nanoparticelle sono: 1) one-pot sintesi che produce le anime che sono composti di Prussia nanoparticelle blu (PB NP), Prussia nanoparticelle blu contenenti gadolinio (GdPB) o manganese contenenti blu di Prussia nanoparticelle (MnPB), 2) biofunzionalizzazione delle nanoparticelle utilizzando avidina fluorescenti elettrostatica autoassemblaggio, e 3) di fissaggio dei ligandi biotinilati (anticorpi) verso le nanoparticelle utilizzando interazioni avidina-biotina robusti. Sia avidina fluorescenti e ligandi biotinilati costituiscono il BIOFshell unctional delle nanoparticelle.

La sintesi one-pot produce PB NP, GdPB o MnPB che funzionano sia come T ₁ e T ₂ agenti di contrasto per risonanza magnetica. Le quantità di ioni paramagnetici (gadolinio o manganese) caricati nel nucleo nanoparticelle possono essere modificati (aumentato o diminuito) variando le quantità di sali di litio contenente paramagnetici (gadolinio (III) nitrato di manganese (II) cloruro) in sintesi one-pot (passo 1.2). Ciò si traduce in alterato (aumento o diminuzione) intensità di segnale MRI. Tuttavia, queste modifiche al regime di sintesi possono provocare instabili, nanoparticelle aggregati. Per attenuare preoccupazioni associate con l'aggregazione, la sintesi one-pot può essere modificato per incorporare agenti come citrato tappatura durante la sintesi ²⁰ size-controllo.

Biofunzionalizzazione dei nuclei di nanoparticelle si ottiene elettrostatico self-assembly con avidina fluorescente, che enables imaging di fluorescenza. Elettrostatica autoassemblaggio richiede cariche opposte sulla superficie delle nanoparticelle e il polimero di rivestimento (in questo articolo, avidina fluorescente). Per modificare la funzionalità superficie delle nanoparticelle, avidina può essere sostituito da polimeri caricati positivamente (es polilisina o un'ammina contenente gruppi polietilenglicole) durante la sintesi. Tuttavia le proporzioni relative dei nanoparticelle e polimeri di rivestimento dovranno essere ottimizzati per mantenere dimensioni delle nanoparticelle e la stabilità e per prevenire l'aggregazione.

L'aggiunta di anticorpi biotinilati sul nanoparticelle avidina rivestito conferisce capacità di targeting molecolare ai nanoparticelle a base di PB. Questa fase si basa sulla robusta interazione tra avidina e biotina (costante di dissociazione di equilibrio, K _d ~ 10 ^-15). Come con passaggi precedenti, le proporzioni relative dei nanoparticelle rivestite con avidina e ligandi biotinilati devono essere optimized in modo da evitare che il ligando biotinilato da simultaneamente vincolante due nanoparticelle rivestite con avidina conseguente aggregazione delle nanoparticelle. Per il targeting molecolare, gli anticorpi possono essere sostituiti da altri ligandi di targeting come frammenti anticorpali (Fab), a catena singola frammento variabile (scFv), peptidi o aptameri.

I vantaggi principali di questo metodo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized come multimodale, agenti di imaging molecolare sono: 1) facile one-pot (1-step) sintesi dei nuclei di nanoparticelle, e 2) fasi Come contattare sequenziale (elettrostatico auto-assemblaggio e avidin- interazioni biotina) per rivestire il nucleo nanoparticelle con un guscio biofunzionale. Altri vantaggi delle nanoparticelle includono il fatto che il blu di Prussia (composto da Radiogardase) è già approvato dalla FDA per uso umano e che le nanoparticelle risultanti dal regime di sintesi one-pot può essere usato come agente di contrasto MRI sia T ₁ ( positivo) e T _{2 <}/ Sub> (negativi) sequenze pesate, che non è facilmente ottenibile con altri mezzi di contrasto o piattaforme di nanoparticelle senza schemi di sintesi complicati o prodotti chimici specializzati per la sintesi dei mezzi di contrasto. Una limitazione di questa tecnica è che la sintesi può portare a nanoparticelle polidispersi con aggregati se le proporzioni relative dei reagenti sia sintesi nucleo nanoparticelle e rivestimento biofunzionale shell passaggi non sono rigorosamente ottimizzate per i reagenti utilizzati in tali fasi particolari. Ad esempio, le proporzioni relative per rivestire i nuclei con avidina nanoparticelle non possono essere estesi a rivestire le nanoparticelle con polilisina senza ottimizzazione studi precedenti.

Dopo aver imparato la tecnica per sintetizzare biofunctionalized nanoparticelle blu di Prussia qui descritte, questo design versatile può essere modificato per studi di imaging molecolare in vivo. Ciò richiederà PEGylation delle nanoparticelle per minori immunogenicity e tempi più lunghi di circolazione in vivo. Simile al disegno qui descritto, le NP PB può essere biofunctionalized con anticorpi prima di in vivo amministrazione. Altri studi includono l'uso delle biofunctionalized PB NPS teranostico (terapia simultanea + diagnostici) applicazioni in vivo. Gli studi che indagano l'uso di nanoparticelle di Prussia blu per la terapia fototermico (in base alle loro caratteristiche di assorbanza a lunghezze d'onda nel vicino infrarosso) sono attualmente in corso ^21.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).