Генома Снимок хроматина регуляторов и государства в

Вопрос о том, хроматина регуляторы и хроматина государства влиять на геном в естественных условиях является ключевым для понимания того, как рано судьбы клеток решения принимаются в развивающемся эмбрионе. Чип-Seq-самый популярный подход к расследованию функции хроматина на глобальном уровне, что изложенные здесь для эмбрионов Xenopus.

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly^1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency³. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes⁴. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)⁵. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.

Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium⁶. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.

The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.^7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все Xenopus работа полностью соответствует Закону 1986 года, реализуемого MRC Национального института медицинских исследований в Великобритании животных (научные процедуры).

1. Подготовка

1. Оцените количество эмбрионов, необходимых для чипа эксперимента (см обсуждение).
2. Подготовьте следующие решения, которые хранятся при комнатной температуре: 500 мл 10х Марк модифицированной Рингера (MMR) без EDTA, рН доводили до 7,5 и стерилизуют в автоклаве (1 М NaCl, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl _2, 10 мМ MgSO _4, 50 мМ HEPES рН 7,5) ^10, 1 мл SDS буфера для элюции (50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1% ДСН) и 1 мл 5x ДНК загрузочным буфером (0,2% Оранжевый г, 30% глицерина, 60 мМ ЭДТА, рН 8,0).
3. Подготовьте следующие решения, которые хранили при 4 ° С: 50 мл HEG буфера (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 20% глицерина), 500 мл экстракционного буфера Е1 (50 мМ HEPES-KOH рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДTA. 10% глицерина, 0,5% Igepal СА-630, 0,25% Тритона Х-100), Е2 (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA) и Е3 (10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Igepal СА-630, 0,25% Na-дезоксихолат, 0,1% SDS), 500 мл RIPA буфере (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 500 мМ LiCl, 1 мМ ЭДТА , 1% Igepal СА-630, 0,7% Na-дезоксихолат) и 50 мл TEN буфера (10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl).
4. Оценка и клип 15 мл коническую полистирола трубки на отметке 7 мл. Используйте эту трубку, чтобы содержать экстракты ядер, проходящих ультразвуком.
5. Для анализа после секвенирования, используют операционную компьютер многоядерных Unix-стиле, по крайней мере, 8 Гб оперативной памяти и 500 Гб свободного дискового пространства. Установите следующее программное обеспечение локально большинство из которых используются в командной строке: FastQC, Illumina CASAVA-1.8 Качество фильтр, Боути ^11, SAMtools ^12, Гомер ^13, MACS2 ^14, ВНА ^15,16, Cluster3 ^17, Java TreeView, BLAST + ^18, и b2g4pipe ^{19. Проверка инструкций по установке и требования для составителей и стороннего программного обеспечения.}
6. Постройте индекс Bowtie для выравнивания короткое NGS считывает с геномом Xenopus. Пример показан здесь X. tropicalis геном v7.1 (ноябрь 2011 года), которые могут быть загружены в виде файла FASTA (genome.fa) от FTP-сервера Xenbase (/ паб / геномики / JGI). Переместите файл FASTA в подкаталог индекса Bowtie.
   1. Используйте следующую командную строку (здесь после оперативного характера>) для создания файлов xenTro7 индекс:
      > Бабочкой ремонтом /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
      > Экспорт BOWTIE_INDEXES = / путь / к / галстук-бабочка / индекс /
7. Скачать файл ген аннотацию (GTF) из браузера УСК генома или зеркального сайта на сервере NIMR для последних версий генома (genomes.nimr.mrc.ac.uk) через инструменты / Обозреватель таблицы. Используйте файл геном FASTA и файл GTF настроить HOMER для Xenopus (например, X. tropicalis геном v7.1, - назовите xenTro7).
   1. Кроме того, использование предварительно собранные пакеты Гомер для некоторых старых версиях генома Xenopus.
      > LoadGenome.pl -name xenTro7 -ORG NULL -fasta /path/to/genome.fa -gtf путь / к / genes.gtf
8. Создать генома дорожки (.genome файла) для генома браузере ВНА, загрузив индексированный файл FASTA (genome.fa с genome.fa.fai файл в той же папке,) и файл аннотации (genes.gtf). Создать индекс геном эшафот (genome.fa.fai) для генома Xenopus следующим образом:
   > Samtools faidx /path/to/genome.fa
9. Используйте BLAST + пройти Gene Онтология (ГО) термины из нескольких модельных видов (человек, мышь, данио, плодовых мух и дрожжей) на Xenopus генов следующим образом:
   1. Скачать все последовательности, кодирующие (CDS), как один файл FASTA (cds.fa) из браузера УСК генома через инструменты/ Обозреватель таблицы и обновление BLAST + с предварительно отформатирован базе данных BLAST неизбыточных белков (NR):
      > Update_blastdb.pl NR
   2. Поиск человека (txid9606), мышь (txid10090), данио (txid7955), плодовой мушки (txid7227) и дрожжи (txid4932) белки с сайта NCBI через его функцией расширенного поиска (HTTP: //www.ncbi.nlm.nih. гов / белок / продвинутый) и отправить полученный GI (идентификатор последовательности) список (sequence.gi.txt) к компьютеру.
   3. Связать Xenopus гены наиболее близки белкам из списка GI, выполнив BLASTX с определенной ожидать (E) пороговое значение (в данном случае 10 ^-20). Убедитесь, что выходной формат XML (-outfmt 5 отъезда blastx_results.xml). Используйте экономии времени нитей (-num_threads), которые коррелируют с количеством доступных компьютерных ядер.
      > BLASTX -db / путь / к / NR -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / путь / то / cds.fa -evalue 1e-20
      -outfmt 5 отъезда /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# темы]
   4. Откройте файл b2gPipe.properties папки b2g4pipe с помощью текстового редактора и обновляет свойства базы данных в Dbacces.dbname = b2go_sep13 и Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Запустите b2g4pipe из папки установки.
      > Java Xmx1000m -cp *: EXT / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -в /path/to/blastx_results.xml
      отъезда результаты / xenTro7 проп b2gPipe.properties -v -annot
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа экстракты GO условия для каждого BLAST хит и назначает их соответствующих генов Xenopus (xenTro7.annot). Наиболее обновленные настройки базы данных можно найти в разделе Сервис / Общие настройки / DataAccess настройки приложения Blast2GO Java Web Start (см 9.11.1).

2. хроматина Сшивание

1. Оплодотворите Xenopus яйца, де-желе и культуры им,bryos соответствии со стандартными протоколами ^20.
2. Передача dejellied эмбрионов (максимум 2500 X. Laevis или 10000 X. tropicalis) на стадии развития интереса к образца стекла флакона 8 мл с крышкой и промыть их кратко один раз 0.01x MMR.
3. Исправить эмбрионов с 1% формальдегида в 0.01x MMR (например, добавить 225 мкл 36.5-38% формальдегида в 8 мл 0.01x MMR) в течение 15 до 40 минут при комнатной температуре (см Обсуждение в течение времени фиксации и количества зародышей требуемой на чип эксперимента).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид вызывает коррозию и очень токсичные. Это опасно при попадании в глаза и на кожу, расстройство желудка, и ингаляции. Используйте вытяжку при добавлении формальдегида в пробирку.
4. Остановите фиксацию кратко мытья эмбрионов три раза холодным 0.01x MMR. Не позволяйте Эмбри OS контакт с поверхностью жидкости, потому что поверхностное натяжение приводит к их разрыву.
5. Алиготе эмбрионов в 2 мл микропробирок на льдус максимумом 250 эмбрионов в трубы, которые занимают объем приблизительно 250 мкл (X. tropicalis) или 600 мкл (X. Laevis) до вылупления.
6. Внесите прочь, как много 0.01x MMR, как это возможно. Пропустите следующий шаг, если вы немедленно продолжить с разделом 3.
7. Равновесие эмбрионов в 250 мкл холодного буфера Гегемон. После того, как эмбрионы осели на дно пробирки удалить столько жидкости, сколько возможно, и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить при -80 ° С.

3. хроматина Добыча

ПРИМЕЧАНИЕ: После экстракции из сшитого хроматина из эмбрионов Xenopus работает наиболее эффективно в ногу со временем фиксации указанных в пункте 2.3 и от 50 до 80 X. tropicalis или от 25 до 40 X. Laevis эмбрионов на мл буфера для экстракции E1, E2 и E3. Каждый шаг извлечения повторяется, так что два раза вычисляется объем буфера не требуется. Для укрупнения, используйте несколько 2 мл microcentriFUGE трубки или 50 мл центрифужные пробирки. Держите образцы и буферы на льду в течение хроматина добычи.

1. Дополнение адекватных объемов буферов E1, E2 и E3 1 мМ DTT и ингибиторы протеазы таблетки. При выполнении чип с фосфорно-специфические антитела еще буферов дополнения диаметром 5 мм NaF и 2 мм Na ₃ VO _4.
2. Перемешать фиксированных эмбрионов с E1 с помощью пипетки вверх и вниз. Центрифуга гомогенатах в охлаждаемой центрифуге (4 ° C) в 1000 мкг в течение 2 мин (или 5 мин в случае использования 50 мл пробирки). Аспирата супернатант и любые липиды, прикрепленные к стене.
3. Ресуспендируют гранул в E1. Хранить образцы на льду в течение 10 мин. Центрифуга и отбросить супернатанты как в шаге 3.2.
4. Ресуспендируют гранул в Е2. Центрифуга и отбросить супернатанты как в шаге 3.2.
5. Повторите шаг 3,4, но сохранить образцы на льду в течение 10 мин перед центрифугированием.
6. Ресуспендируют гранул в Е3. Хранить образцы на льду в течение не менее 10 мин. Центрифуга и отбросить суpernatants как в шаге 3.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, resuspensions должна стать достаточно прозрачной. Анионные моющие средства E3 извлечь сшитые ядра путем оказания большинство из оставшихся желтка тромбоцитов растворимых.
7. Ресуспендируйте и бассейн гранулы из сшитого ядер (обычно окрашен в коричневый от нерастворимого пигментных гранул) в общем объеме 1 мл Е3. Развести образца с Е3 2 или 3 мл, если она кажется очень вязкой и трудно пипетки. Держите на льду или при 4 ° С до переходите к шагу 4 на том же или следующий день. Snap-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С для дальнейшего использования.

4. хроматина Фрагментация

Примечание: Обработка ультразвуком используется как для растворения и сдвига сшитую хроматин. Вот параметры, которые управляют Misonix Sonicator 3000, оснащенный 1/16 дюйма конической микронаконечником и звукоизоляционного кожуха. При использовании других sonicators, следуйте рекомендациям производителей стричьсшитый хроматина или использовать от 6 до 12 Вт в течение от 4 до 8 минут в общей сложности.

1. Передача ядерного образец с шага 3,7 в специально построенном трубки для обработки ультразвуком (шаг 1,4). Хранить образец охлаждается во ультразвуком при наличии трубку, прикрепленную к 800 мл пластиковый стакан, наполненный водой со льдом с помощью короткого зажима термометром.
2. Стакан помещают на лабораторном домкрате. Отрегулируйте домкрат так, чтобы Sonicator микронаконечником погружается в образце около двух третей глубины объема и по центру, не касаясь стенок трубы.
3. Разрушать ультразвуком образца в течение 7 минут в общей сложности, сменяясь каждые 30 сек с 1 мин пауз. Установленной мощности до 1,0. Начните ультразвуком и сразу же увеличить уровень мощности (обычно от 2 до 4), чтобы достичь показания от 9 до 12 Вт Пауза немедленно, если образец начинает пениться. Повторно трубку и перезагрузите, когда пена полностью исчезла.
4. Передача стриженой хроматина в предварительно охлажденные 1,5 мл микропробирок и спина на полной скорости (> 15,000 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С.
5. Передача супернатант в предварительно охлажденный 1,5 мл микропробирок. Соберите 50 мкл супернатанта (идеально хроматина около 400 000 или более ядер), чтобы визуализировать степень хроматина фрагментации (раздел 5). Используйте остальную часть супернатанта стружки (раздел 6).
6. Магазин образцы при 4 ° С в течение до одного дня. Образцы Snap-заморозьте аликвоты (один на чип эксперимента) в жидком азоте для долговременного хранения при -80 ° C.

5. изображений хроматина Фрагментация

1. Добавить 50 мкл SDS буфера для элюции, 4 мкл 5 М NaCl и 1 мкл протеиназы К (20 мкг / мкл) в 50 мкл надосадочной жидкости с этапа 4.6.
2. Инкубировать в течение 6 до 15 часов (O / N) в гибридизации печь, установленную на 65 ° C.
3. Очищают ДНК с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР. Если необходимо, используйте 3 м ацетата натрия (рН 5,2) для корректировки рН в соответствии с рекомендациями производителя. ЭлюцииДНК дважды с 11 мкл буфера для элюции (10 мМ Трис-HCl, рН 8,5).
4. Добавить 0,4 мкл РНКазы А (20 мкг / мкл) и 5 ​​мкл 5x ДНК загрузки буфера перед запуском весь образец наряду с 100 б.п. и 1 кб ДНК лестницы на 1,4% агарозном геле путем электрофореза. Для достижения оптимальных результатов, пятно геля с безопасного нуклеиновой окрашивания раствора кислоты после электрофореза.

6. иммунопреципитации хроматина

Примечание: В этом разделе, используют низкие-удерживания 1,5 мл микроцентрифужных трубы и по меньшей мере 1 мл указанного буфера в пробирку для мытья магнитных шариков в течение 5 мин при 4 ° С. Перед удалением буфер из гранул, оставить трубы в магнитном стойки от 20 до 30 секунд каждый раз или до раствор не станет прозрачным.

1. Передача от 10 до 30 мкл супернатанта (сдвигу) хроматина с шагом 4,6 в новую пробирку для последующего использования в качестве входной выборки, что соответствует примерно 1% от общего хроматина, используемого для чипа. Хранить при 4° C до образцы ChIP не готовы для реверсирования перекрестные ссылки.
2. Передача оставшегося хроматин в новую пробирку. Для чип-КПЦР экспериментов, требующих контроля антител, распространять равные объемы хроматина двух труб.
3. Добавить чип-класса антитела (или контроль соответствующим антителом), чтобы хроматина. В качестве приблизительного ориентира, использовать около 1 мкг антител на один миллион клеток, экспрессирующих эпитоп.
   1. Для более точной оценки количества антител, необходимый на чип эксперимента, запустить тот же чип с различными количествами антитела (например, 0,25 мкг, 1 мкг и 2,5 мкг) и сравнить доходность на отрицательной и положительной локусов управления по чип-КПЦР (см раздел 10). В качестве контрольного антитела, используют нормальную сыворотку тех же изотипа и ведущий животных, как антитела.
4. Выдержите на ротатор (10 мин) O / N при 4 ° С.
5. Промыть достаточное количество антител, совместимый магнитных шариков один раз Е3 в течение 5 мин Ат 4 ° C. Проверить спецификации производителя для связывания антитела мощностью бисера (обычно от 5 до 20 мкл из бисера связать 1 мкг IgG антитела).
6. Добавить вымытые бисером антитела предварительно инкубируют хроматина. Кроме того инкубировать на ротатор (10 оборотов в минуту) в течение 4 ч.
7. Вымойте бисером в четыре раза (чип-КПЦР) или в десять раз (чип-Seq) с предварительно охлажденной буфера RIPA, а затем один раз с предварительно охлажденной TEN буфера.
8. Выполнять только этот шаг, если выполнения чип-Seq эксперимент.
   1. Ресуспендируют мыть шарики в 50 мкл TEN буфера на трубе. Бассейн все бусы из одного эксперимента чипа передачи их в одну новую пробирку. С помощью магнитного стойку и в холодильнике (4 ° С) центрифугирования при 1000 мкг собирать шарики в нижней части трубки. Откажитесь столько жидкости, сколько возможно без нарушения осадка из бисера.
9. Газа чип материал с бисером ресуспендированием бусины в 50 до 100 мкл SDS буфера для элюции и Vortexing их непрерывно термомиксер (1000 оборотов в минуту) в течение 15 мин при 65 ° С. После этого центрифуге на полной скорости (> 15000 XG) в течение 30 сек. Передача супернатант (чип элюат) в новую пробирку.
10. Повторите последний шаг и объединить чип элюаты.

7. хроматина Обратный Сшивание и очистки ДНК

1. Добавьте достаточно SDS буфера для элюции с входным образца (шаг 6,1), чтобы достичь объема образца чипа, который составляет от 100 до 200 мкл (шаг 6,10). Дополнение оба чипа и входных выборок с 1/20 объема 5 М NaCl. Инкубируйте образцы от 6 до 15 ч (O / N) при 65 ° С в гибридизации печи.
2. Добавить 1 объем буфера ТЕ и РНКазы А при 200 мкг / мл. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
3. Добавить протеиназы К при 200 мкг / мл. Инкубируют в течение 2 до 4 ч при 55 ° С.
4. Очищают ДНК, фенол: хлороформ: изоамиловый спирт экстракции с последующим осаждением этанолом, как описано ранее ^9. Для чип-Seq, добавить 32мкл буфера для элюции (10 мМ Трис-HCl, рН 8,5), чтобы растворить осадок ДНК. Оставить образцы на льду в течение 30 мин, чтобы гарантировать, что ДНК полностью не растворится.
   Примечание: Коммерческий ПЦР наборы очистки имеют меньшую восстановление ДНК, но более удобно, и может быть использован для образцов чип-КПЦР.
5. Для чип-Seq, определить концентрацию 1 мкл чипа и входного ДНК с использованием флюорометрия на основе методов. Следуйте инструкциям производителя и убедитесь, что концентрация ДНК попадает в надежной дальности обнаружения флуорометра.

8. чип-Seq библиотеки строительства и проверка

ПРИМЕЧАНИЕ: Современные методы ДНК готовки библиотек позволяют формировать высокой сложности библиотек для NGS от 1 до 2 нг. За счет какого-то сложности, библиотеки могут быть сделаны из всего лишь 50 мкг ДНК (табл конкретных материалов / оборудования). Используйте ту же количество ДНК как для чипа и входного библиотеки. Короче говоря, чтобы маке индексируются (парноконцевое) Chip-Seq библиотеки, Чип и вход ДНК должны быть в конце ремонта, лигировали специальных адаптеров (табл конкретных материалов / оборудования), размер отобранных и ПЦР-амплификации.

1. Соблюдайте рекомендации производителя, чтобы сделать чип-Seq библиотеки. См обсуждение для дальнейших рекомендаций.
2. Элюции каждый библиотеку в 12 мкл буфера для элюции и определить концентрацию 1 мкл каждого чипа и входного библиотеки с использованием флуорометр. Ожидать концентрации от 5 до 25 нг / мкл. Рассмотрим уменьшения количества циклов ПЦР (менее 18 циклов), если концентрация выше, чем 25 нг / мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точная количественная является ключом к достижению оптимальных результатов NGS. Библиотеки с таких низких концентрациях, как 1 нг / мкл после 18 циклов ПЦР может быть упорядочены, но часто являются менее сложности.
3. Используйте 1 мкл библиотеки, чтобы определить распределение размера фрагмента и, чтобы проверить наличие адаптера димера загрязнения (группа около 120 б.п.) на схип-основе капиллярного электрофореза. Повторите твердой фазе очистки обратимы иммобилизации при соотношении шариков к образцу 1: 1 (вместо 1,6: 1), если библиотека содержит адаптер димеры.
4. Выполните КПЦР на проверенной положительной и отрицательной локусов управления (смотрите раздел 10), чтобы проверить, будут ли наблюдаться подобные тенденции обогащения ДНК до и после библиотеки подготовки. Отправить по контролю качества утвержденных библиотеки для секвенирования.

9. Анализ Post-последовательности и Визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время, NGS часто осуществляется в доме или коммерческих объектов секвенирования (см обсуждения для некоторых руководящих принципов NGS). Стандартный вывод одиночные или множественные GZIP-сжатых FASTQ файлы (* .fastq.gz) хранение миллионы последовательность чтения. Как правило, мультиплексный читает уже разделены в соответствии с их индексом и каждый чтения содержит идентификатор последовательности и оценки контроля качества (PHRED + 33 для Illumina 1.8+) для каждого BASе вызова. Этот подход здесь лишь один из многих способов, как анализировать данные NGS. Читателю предлагается проверить любой из ниже приведенных команд требуют изменений, так как это поле быстро развивающейся и обновления регулярно происходит.

1. Соединить GZIP-сжатых FASTQ файлы и проверить качество данных секвенирования с помощью скрипта FastQC. Выполнить это, и большинство из следующих команд как для чипа и входного секвенирования данных (Примеры показаны для чип) с терминала:
   > Кошка /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
   > Fastqc ChIP.fastq.gz
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные данные от успешного секвенирования высокой сложности чип-Seq библиотеки должны пройти большинстве тестов. Неудачи происходят в основном из бедных трасс секвенирования и экспериментальных артефактов, таких как предвзятые ПЦР-амплификации или загрязнения адаптера. Определенная степень дублирования (резервирования), как ожидается избыточными читает могут представлять истинного обогащения ДНК ^{21. Тем не менее, в последствии может ограничить теги чтения - 5 'конец или читает - к одному за пару оснований для ликвидации любой излишним читает, не влияя на чувствительность обнаружения пиков (шаг 9.4) 21.}
2. Данные Предварительная обработка секвенирования для удаления загрязнений адаптера (homerTools обрезать -3 <последовательность адаптер>), что позволяет одним несоответствие (-mis 1). Используйте первые 20 баз в (индексируется) адаптера (5 'к 3') проксимальнее фрагмента ДНК процент по перевязке (только для адаптера, приведенного в таблице конкретных материалов / оборудования).
   > GZIP -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -Vn> ChIP.fastq
   > homerTools обрезать -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq
   ПРИМЕЧАНИЕ: удаление фильтруют читает (N) требуется только по умолчанию в FASTQ файлов, создаваемых в Illumina 1.8. Пропустите команду fastq_illumina_filter (т.е. ". | Fastq_illumina_filter -Vn ')Если старая версия, чем 1,8 генерируется идентификатор последовательности.
3. Совместите предварительно обрабатывается читает на референсный геном (xenTro7) с помощью бабочкой. Только держатся однозначно отображается читает (-m 1), используя настройки по умолчанию, то есть максимальные два несоответствия в первые 28 баз и общей PHRED + 33 показателя качества всех несоответствий в чтение максимального выравнивания 70. Отчет в формате SAM (-S) , Увеличение числа мегабайт в потоке (--chunkmbs), если память кусок исчерпан:
   > Бабочкой -m 1 -S -p [# нити] --chunkmbs [например, 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
   ПРИМЕЧАНИЕ: Боути ожидает Phred + 33 показателей качества по умолчанию. Включите опцию - phred64-Quals если файл FASTQ был создан с Phred + 64 показателей качества по Illumina старше 1,8.
4. Используйте две команды Гомер, чтобы преобразовать выравнивание (SAM) файл в воротила файла (.bw):
   > MakeTagDirectory чип / -Один -tbp 1 ChIP.sam
   > MakeUCSCfile чип /-bigWig / путь / к / genome.fa.fai -fsize 1e20-норма 1E7 -o ChIP.bw
   ПРИМЕЧАНИЕ: трансформация требует индекс эшафот (genome.fa.fai) эталонного генома (шаг 1,8). Здесь профиль ограничивается одним тэгом за пару оснований (-tbp 1) и нормированы на 10000000 читает (-норма 1E7). шишка является одним из предпочтительных формате динамически визуализации хроматина профили с геномом браузера, такие как IGV (этап 9.12).
5. Определите распределение меток (-d чип /) в геномных достопримечательностей (например, +/- 10 КБ с 25 б.п. бункеров, -si ZE 20000 -hist 25), такие как старта транскрипции (TSS, например, как показано здесь) и прекращения ( TTS) сайты. Запустите ГОМЕР скрипт на Perl annotatePeaks.pl с Xenopus аннотации xenTro7 (шаг 1,7):
   > AnnotatePeaks.pl TSS xenTro7 -size 20000 -hist 25 -d чип /> ChIP_tagDensity.tss
6. Найти значительные пики обогащения ДНК между стружкой(-t ChIP.sam) и ввода (-c Input.sam) в X. tropicalis генома с использованием MACS2 с 1% ПБУ отсечки (-q 0,01) и фрагментов ДНК (после обработки ультразвуком) из 200 п.о. (--bw = 200) для построения модели. Добавьте флаг --broad с этой командной строки, если ожидает широкое распределение хроматина особенности интерес, таких как гистоновых меток или РНК-полимеразы.
   > Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n чип -g 1.4376e9 -q 0,01 --bw = 200
   ПРИМЕЧАНИЕ: эффективный размер X. tropicalis геном сборки v7.1 о 1437600000 ВР (-g 1.4376e9). MACS2 генерирует файл Кровать (ChIP_peaks.bed) привлечения пики с их геномных местах.
7. Сравните несколько хроматина профили в виде кластерного Тепловая карта:
   1. Создать распределения тег матрицу из плотности тег каталогов интереса (-d чип / other_ChIP /) на MACS2 пиков (например, +/- 1 КБ с 25 б.п. бункеров, -size 2000 -hist 25 -ghist):
      > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 2000 -hist 25 -ghist -d чип / other_ChIP /> ChIP.matrix
   2. Используйте графический пользовательский интерфейс Cluster3 загрузить ChIP.matrix файл и иерархически объединить эти плотности тегов, основанных на минимальной евклидовой расстояния до ближайшего центра тяжести. Откройте созданный CTD файл в Java TreeView для визуализации кластеризации.
8. Найти новые и ранее известные связывающие мотивы, которые обогащены в часы пик встреч на высшем уровне +/- 100 б.п. (-size 200). Используйте annotatePeaks.pl на карту мотив происшествия и построить плотность мотив:
   > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -размер 200 р [# темы]
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -размер 800 -hist 25> motif1.density
   ПРИМЕЧАНИЕ: сценарий инфе findMotifsGenome.plRS обогащения из сравнения случайно выбранного гена-ориентированных фоновых последовательности. Наиболее обогащены роман мотив сохраняется под motif1.motif в формате положение веса матрицы. Читателю предлагается обосновать эти результаты с результатами других методов De Novo обнаружения мотив, таких как cisFinder ²² и мем ^23.
9. Комментировать пики, вычисляя их расстояние до ближайшего гена и определения их нормированное количество чтения в пределах 400 б.п. окон (-size 400):
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 400 -d чип / вход /> ChIP_peaks.genes
10. Кратко выход с помощью следующей команды AWK перечислить ряд (N), место нахождения и нормированные количество считывания индивидуальных (R) и все (LR) пиков на ближайшее (целевой) гена.
    > AWK 'BEGIN {FS = " T'} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
    {N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', и# 39; $ 7 '(' $ 9 ')'} END {для (я в N)
    {Печать я ' Т' N [я] ' т' R [я] ' т "зиЬзЬг (LR [я], 2)}}' ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
    ПРИМЕЧАНИЕ: после $ число относится к числу столбцов, которые могут нуждаться в модифицирующего чтобы соответствовать файл ChIP_peaks.genes, созданную в предыдущем шаге. Этот сценарий образцом отфильтровывает пики, помимо 5 т.п.н. слева и 1 кб вниз по течению TSS. $ 7, $ 8 и $ 9 см с расстоянием до УТП, идентификатор гена и нормированной кол чтения на пик, соответственно.
11. Проведение анализа обогащенных Условия Отправить среди целевых генов следующим образом:
    1. Начните графический пользовательский интерфейс Blast2GO из командной строки с помощью Java Web Start (javaws) ^19.
       > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp
    2. Следуйте инструкциям разработчиков, чтобы загрузить аннотациюфайл для Xenopus генов (xenTro7.annot), генерируемых в 1.9.4 и плоского файла выявленных генов-мишеней. Убедитесь в том, что те же самые идентификаторы генов используются в обоих файлах.
12. Визуализация профилей хроматина путем добавления шишка (ChIP.bw, Input.bw) и постельного файлы (ChIP_peaks.bed) в ВНА по дорожкам. Дополнять данные с РНК-Seq отслеживает если они доступны для одной и той же стадии развития. Сохранение результатов в виде сессии.
13. Используйте программирования платформы R (www.r-project.org) или MATLAB для дальнейшего манипулирования и визуализации данных, генерируемых выше. Кроме того, участок небольших наборов данных с Excel.

10. ЧИП-КПЦР для тестирования чипа и Подтверждение чип-Seq

1. Используйте он-лайн платформу Primer3 для разработки праймеров, окружающих около 100 б.п. ДНК при 60 ° С (Т _м) для положительных (пик-специфических) и отрицательных локусов контроля. Подтвердите праймера специфику, используя в силикомарганца Поиск ПЦР реализованы в браузере УСК генома.
2. Создание стандартной кривой 8-точечный три кратные разведения, начиная примерно с 1% вход или использовать 2 ^- метод ^{ΔΔC (T) 8,24} для количественного обогащения ДНК.
3. Выполнить ПЦР в реальном времени в технических трижды для всех образцов, т.е., чип, контроля и, в случае необходимости, стандартных образцов кривой.
4. Обогащение ДНК участка в процентах от входного ДНК или как отношение чипа по сравнению с контрольным образцом на обоих положительных и отрицательных контрольных локусов.

Результаты, эквивалентные тем, представленные здесь, как ожидается, если протокол хорошо выполнен и антитела в использовании имеет качество чип-класса (см обсуждение). Этот протокол позволяет извлечение ядер из формальдегида фиксированной Xenopus эмбрионов и эффективного Стрижка хроматина с помощью ультразвука (1А-C). Жакет хроматина показывает асимметричное распределение фрагментов ДНК в основном в пределах от 100 до 1000 пар оснований, и пиком от 300 до 500 п.о. (фиг 1С). Минимальная 50 мкг Иммунопреципитированные ДНК, необходимые для успешного сделать индексированный парного чип-Seq библиотеки с аналогичного размера ДНК-вставок (рис 2а). Библиотека должна быть в значительной степени лишена адаптера димеров, которые можно увидеть на electropherogram примерно 120 б.п..

После секвенирования через синтез, предварительно обрабатывается считывает отображаются в геноме (фиг.2В, С). В успешном эксперименте с X. эмбрионы tropicalis, как правило, от 50 до 70% одного конца читает 40 б.п. могут быть отображены однозначно генома сборки v7.1, обладающей максимально два несоответствия. В то время как вход читает выровнять довольно равномерно по всей генома, выравнивание чипа читает результаты в пряди конкретных обогащения, обрамляющих хроматина интересующий объект. Это происходит потому, что все фрагменты секвенировали с 'конце 5 (фиг.2с) ^25. Продление выравнивание при чтении направление до среднего размера фрагмента дает точные профили для отдельных функций хроматина, такие как связующие фактор транскрипции событий. Эти заселенности ДНК появляются в виде пиков, когда визуализируется в ВНА или любой другой совместимый генома браузере. Пиковые абоненты, такие как MACS используются для определения местоположения этих пиков (фиг.3А). Таким образом, десятки тысяч сайтов связывания были определены в X. tropicalis геном Т-коробки транскрипционных факторов, таких как VegT ^26. ЧИП-КПЦР Experiменты должны подтвердить местного обогащения, найденный чип-Seq (рис 3б).

Чип-Seq экспериментов позволяют исследовать генома характеристики особенностей хроматина. Например, расчета распределения чтения по геномных элементов, таких как начало транскрипции и терминации сайтов может выделить какие-либо пространственные обязательные предпочтения вокруг генов (рис 3в). Кроме того, Тепловая карта распределений чтения в часы пик местах используется для сравнения различных функций хроматина в генома масштабе (рис 3D). Некоторые факторы транскрипции связывать ДНК-последовательность в частности. De Novo мотив анализ геномной ДНК, лежащих в основе пиков может получить такую ​​информацию, включая совместное обогащенный мотивов потенциальных сопутствующих факторов (рис 3e). Подавляющее большинство генов-мишеней показать размещение ДНК на нижней, а не высокий уровень (рис 3F). Эта шкала без особенность кажется вполне распространенным среди TRфакторы anscription и предполагает, что только небольшая часть генов-мишеней непосредственно регулируются с биологической значимости ^27,28. Анализ обогащенных условиях идти или других атрибутов, таких как дифференциальной экспрессии генов-мишеней может также выявить способность проникновения в суть биологической функции функции хроматина в Xenopus эмбрионов (рис 3G).

Рисунок 1. хроматина процедуры иммунопреципитации для эмбрионов Xenopus. (A) Эмбрионы формальдегида фиксируется на стадии развития интереса к ковалентного связывания (сшивания) каких-либо белков, связанных с геномной ДНК. По ядерной добычу (B), сшитый хроматина раздроблена, чтобы сузить геномной ДНК или Переплет хроматина модификации сайты, сводя к минимуму фланговый DNПоследовательность (С). Впоследствии фрагменты хроматина являются иммунопреципитации с чипом класса антител для обогащения, содержащие эпитоп интереса (D). Совместно иммунопреципитировали ДНК снял белок и очищали (E), прежде чем создавать библиотеку чип фрагмента для NGS (рисунок 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. ЧИП-Seq подготовка библиотека, секвенирование через синтез, отображение и пиковой призвания. () Electropherogram неплох чип-Seq библиотеки с ДНК-матриц от 250 до 450 б.п.. Эти шаблоны влечет за собой вставку интерес ДНК в окружении всеобщего (58 б.п.) и индексироваться (63 б.п.) адаптера. (B) Миллионы кластеров, с каждого кластера, содержащих одинаковые шаблоны, которые секвенировали базу основанием в присутствии всех четырех нуклеотидов, обладающих обратимой, отличный флюорофор и одинаковые свойства прекращения. Флуоресцентные изображения обрабатываются в режиме реального времени для вызова соответствующих баз, которые в итоге складываются в читает. (C) Только говорится, что карта однозначно генома Xenopus хранятся. Как и все фрагменты последовательность из 5'-конца, отображение чипа читает результаты в пряди конкретных пиков, обрамляющих хроматина интересующий объект. Таким образом, пик абоненты обнаружить обогащение, исходящего от иммунопреципитацией и расширить читает средней длиной фрагмента, чтобы точно локализовать особенности хроматина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Пример анализа после секвенирования и визуализации данных с помощью фактора зиготический T-коробка транскрипции VegT (zVegT). Все операции чтения рассчитывает, показанные здесь нормированы на 10000000 уникально отображаться и без резервирования читает. () Выдержка из генома профиль zVegT связывания в X. эмбрионы tropicalis гаструлы (стадия 11 до 12,5 после Nieuwkoop и Faber ^29). Каждый пик, нагромождение продлен читает, представляет собой один сайт связывания. Эти пики называются по MACS2 с ложной Discovery (FDR) менее 1%. Каждый MESP ген показывает очень проксимального и выше zVegT связывания, но только mespa и mespb выражены на этом этапе (РНК-Seq данных ^30). (B) размещение уровнях ДНК zVegT, определяемые чип-КПЦР на нескольких локусов (в том числе неправительственных -связанного область 0,5 кб перед β-актина) конфиР.М. Специфическое обогащение найденный чип-Seq. Сравните результаты для mespa с пиком названием (красная полоса) в (А). Уровень занятости ДНК визуализировали в виде процента от входа для обоих, чип с антителом VegT (кролик поликлональных IgG изотипа) и чип с контрольным антителом (обычный кролик IgG). Столбики ошибок отражают стандартное отклонение двух биологических повторностях. (С) Metagene анализ показывает предпочтительное zVegT связывания (метки Binned более 25 пар оснований) с промотором по отношению к любой другой геномной области вокруг и внутри гена органов. (D) Тепловая карта показывает K-среднее кластерные уровни (к = 5) размещение ДНК (теги Binned более 25 б.п.) в zVegT и Smad2 / SMAD3 (чип-Seq данных ³¹⁾ по отношению ко всем zVegT-связанных областей в стадии гаструлы. Тепловая карта, это войти ₂ на основе и с центром в 5 меток в ВР. (E) De Novo мотив анализ обнаруживает каноническую Т-ящика связывания транскрипционных факторов мотив у 38% zVegT-ограничивают участки, если основной счет мотив нормированы на 5%, показатели обнаружения в фоновом режиме последовательности. Карта плотности показывает высокий обогащения для T-коробки мотив в центре zVegT сайтов связывания, в то время как канонический связывания Smad2 / Smad3 мотив едва ли обогащаться. (F) Гистограмма показывает уровень заполнения ДНК zVegT, которые рассчитываются для каждого гена-мишени от всех пиков (+/- 200 б.п.) между 5 т.п.н. слева [-]. и 1 кб вниз по течению [+] соответствующих старта транскрипции сайты (G) 300 лучших генов с высоким уровнем заполняемости ДНК в пределах -5 кб и 1 Кб обогащенные для биологических процессов раннего эмбрионального развития. Они идут термины в соответствии с предполагаемой функции zVegT. FDR основан на двухстороннюю точного критерия Фишера и исправлены для нескольких тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Наш протокол описывает, как сделать и анализировать генома хроматина профили из эмбрионов Xenopus. Она охватывает каждый шаг от сшивающих белков эндогенного локусов в естественных условиях к обработке миллионы читает, представляющий обогащенные геномных участков в кремнии. Поскольку увеличение числа геномов проектов доступны, этот протокол должен быть применим к другой модели и не модельных организмов. Наиболее важный экспериментальный раздел, который устанавливает этот протокол отдельно от предыдущей работы ^8,31,33,34, является процедура после фиксации, чтобы извлечь сшитые ядра. Это способствует эффективному хроматина солюбилизации и резки и легкий растяжение. Вместе с улучшенными эффективности библиотечной подготовки этого протокола позволяет строить очень сложные чип-Seq библиотеки от половины до двух миллионов клеток, экспрессирующих хроматина, ассоциированных эпитоп. Для чип-КПЦР экспериментов, несколько десятков тысяч этих клеток обычно достаточнодля проверки обогащения ДНК, возможно, на шесть различных геномных локусов. Эти цифры консервативные оценки, но может варьироваться в зависимости от уровня экспрессии белка, качества антител, сшивания эффективности и эпитоп доступности. В качестве ориентира, один Xenopus эмбрионов содержит около 4000 клеток на стадии среднего бластулы (8,5 после Nieuwkoop и Faber ^29), 40000 клеток на стадии поздней гаструлы (12) и 100000 клеток на ранней стадии tailbud (20).

Точное время фиксации для эффективного иммунопреципитацией должна быть определена опытным путем чип-КПЦР (раздел 10). В общем, более длительные времена фиксации необходимы, если эксперимент предусматривает X. Laevis эмбрионов, на ранних стадиях развития, а также слабые (или косвенные) ДНК свойства. Тем не менее, это не рекомендуется фиксации Xenopus эмбрионов больше, чем 40 мин, или обработку больше, чем указано эмбрионов (раздел 3), а хроматина сдвига становится менее эффективным. Важно неиспользовать любой глицин после фиксации как этого общего шага для тушения формальдегид может сделать ядерную извлечение из богатых желтком зародышей очень трудно. В настоящее время причина этого не известна. Можно предположить, что формальдегид-глицин аддукт дополнительно реагирует с N-концевой амино-группы или остатки аргинина ^35.

Антитела является ключом к любой ChIP эксперимента и достаточные контроля должны быть выполнены, чтобы показать свою специфику для эпитопа (см руководящих принципов Landt и др. ^36). Если не ЧИП-класса антитела отсутствуют, внедрение соответствующих эпитопов с метками слитые белки могут быть законными альтернативой, поскольку эти белки могут занимать эндогенный сайты связывания ^37. В этом случае, неинъецированных эмбрионы лучше всего использовать в качестве отрицательного контроля, а не чип с неспецифической сыворотки. Эта стратегия может также применяться, если интересующий белок экспрессируется на низком уровне, в результате плохой восстановления ENRIКВО ДНК.

Что касается решений чип-Seq библиотеки, из-за низкого количества ДНК в использовании, рекомендуется сделать выбор в пользу процедур, которые уменьшают количество ступеней очистки и объединяют реакции, чтобы какой-либо потери ДНК как минимум. Адаптеры и праймеры должны быть совместимы с мультиплексной последовательности и платформы NGS (табл конкретных материалов / оборудования). При использовании Y-адаптеры (содержащие длинные одноцепочечные руки), очень важно, чтобы предварительно усилить библиотека с 4:57 раундов ПЦР до размера, выбрав ДНК-вставок (например., От 100 до 300 б.п.) с помощью гель-электрофореза. Одноцепочечные концы привести фрагменты ДНК мигрировать гетерогенно. Испытание выполняется с различными количествами входного ДНК (например, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 и 20 нг), рекомендуется, чтобы определить общее количество циклов ПЦР (меньше или равно 18 циклов) требуется, чтобы размер -selected библиотека от 100 до 200 нг. Уменьшение количества циклов ПЦР оказывает секвенирование Редуndant читает менее вероятным. Твердые фазы обратимые иммобилизации шарики хорошо очистки реагентов эффективно восстановить интерес ДНК и надежно удалить любые свободные адаптеры и димеры перевязки и ПЦР-реакций.

С точки зрения количества, типа и длины читает, вокруг 20 до 30 млн одностороннего читает 36 б.п. достаточно для большинства чип-Seq экспериментов, чтобы покрыть всю Xenopus геном с достаточной глубиной. Наиболее распространенные машины NGS являются обычно способны удовлетворить этим критериям. Тем не менее, это может быть выгодно, чтобы увеличить количество операций чтения, если широкие распределения считывает ожидается, как это наблюдалось при модификации гистонов, а не резких пиков. Для многих чип-Seq экспериментов, от 4 до 5 по-разному индексированные библиотеки могут быть объединены и упорядочены в переулке один поток клеток с использованием высокопроизводительного NGS машину. Иногда также целесообразно увеличить длину считывания и последовательность обоих концах ДНК-матрицы (в паре-конец), чтобы увеличить mappability маскурица анализа хроматина в повторяющихся областей генома.

Этот протокол был успешно применен к широкому кругу функций хроматина, таких как факторы транскрипции, сигнализации посредников и посттрансляционных модификаций гистонов. Тем не менее, эмбрионы приобрести увеличивающуюся степень клеточной гетерогенности, как они развиваются и профили хроматина становится все труднее интерпретировать. Перспективные шаги были сделаны в Arabidopsis и дрозофилы тканевые специфически профиль хроматина ландшафтов путем извлечения типоспецифические клеточных ядер ^38,39. Наш протокол включает в себя этап ядерного добычу, которая может проложить путь для тканеспецифической чип-Seq в других эмбрионов.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Chris Benner for implementing the X. tropicalis genome (xenTro2, xenTro2r) into HOMER and the Gilchrist lab for discussions on post-sequencing analysis. I.P. assisted the GO term analysis. G.E.G and J.C.S. were supported by the Wellcome Trust and are now supported by the Medical Research Council (program number U117597140).