Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly^1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency³. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes⁴. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)⁵. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.

Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium⁶. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.

The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.^7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.

HINWEIS: Alle Xenopus Arbeit vollumfänglich den britischen Animals (Scientific Procedures) Act von 1986, wie durch die MRC National Institute for Medical Research durchgeführt.

1. Vorbereitungen

1. Schätzen Sie die Anzahl von Embryonen für den Chip-Experiment (siehe Diskussion) erforderlich.
2. Folgende Lösungen, die bei Raumtemperatur gelagert werden, hergestellt: 500 ml 10x Marc modifiziertem Ringers (MMR) ohne EDTA, pH auf 7,5 eingestellt und durch Autoklavieren sterilisiert (1 M NaCl, 20 mM KCl, 20 mM CaCl _2, 10 mM MgSO _4, 50 mM HEPES pH 7,5), ^10, 1 ml des SDS-Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) und 1 ml des DNA 5x Ladepuffer (0,2% Orange G, 30% Glycerin, 60 mM EDTA, pH 8,0).
3. Bereiten Sie die folgenden Lösungen, die bei 4 ° C gelagert werden: 50 ml HEG-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 20% Glycerin) 500 ml Extraktionspuffer E1 (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. 10% Glycerin, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) und E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-Desoxycholat, 0,1% SDS), 500 ml RIPA-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA , 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-Desoxycholat) und 50 ml TEN-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl).
4. Partitur und Clip ein 15 ml konischen Polystyrolröhrchen an der 7-ml-Markierung. Dieses Röhrchen zu Kernextrakten unterziehen Beschallung enthalten.
5. Für Post-Sequenzanalyse, mit einem Multicore-Unix-Betriebs Computer mit mindestens 8 GB RAM und 500 GB Festplattenspeicher. Installieren Sie die folgende Software lokal von denen die meisten in der Befehlszeile verwendet: FastQC, Illumina casava-1.8 Qualitätsfilter, Bowtie ^11, samtools ^12, HOMER ^13, MACS2 ^14, IGV ^15,16, Cluster3 ^17, Java TreeView, BLAST + ^18, und b2g4pipe ^{19. Überprüfen Sie die Installationsanweisungen und Anforderungen für Compiler und Software von Drittanbietern.}
6. Erstellen Sie eine Bowtie-Index zum Ausrichten kurz NGS liest zu der Xenopus-Genoms. Ein Beispiel ist hier für den X gezeigt tropicalis-Genom v7.1 (November 2011), die als eine FASTA-Datei (genome.fa) vom Xenbase FTP-Server (/ pub / Genomics / JGI) heruntergeladen werden kann. Bewegen Sie den FASTA-Datei in das Unterverzeichnis Index Bowtie.
   1. Verwenden Sie die folgende Befehlszeile (hier nach dem Prompt-Zeichen>), um xenTro7 Index-Dateien zu generieren:
      > Bowtie-build /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
      > Export BOWTIE_INDEXES = / path / to / Fliege / index /
7. Laden Sie die Gen-Annotation-Datei (GTF) von der UCSC Genome Browser oder der Spiegel-Site auf dem Server für NIMR neuesten Genom-Versionen (genomes.nimr.mrc.ac.uk) über Tools / Table Browser. Verwenden Sie das Genom FASTA-Datei und das GTF-Datei auf H anpassenOMER für Xenopus (zB X. tropicalis-Genom v7.1, - nennen xenTro7).
   1. Alternativ können Sie auch vorgefertigte HOMER Pakete für einige ältere Versionen des Xenopus-Genoms.
      > LoadGenome.pl -name xenTro7 -org null -fasta /path/to/genome.fa -gtf path / to / genes.gtf
8. Erstellen Sie ein Genom Spur (.genome Datei) für die Genom-Browser IGV durch Hochladen einer indizierten FASTA-Datei (genome.fa mit genome.fa.fai Datei im selben Ordner) und der Anmerkungsdatei (genes.gtf). Erstellen Sie ein Genom Gerüst Index (genome.fa.fai) für die Xenopus-Genom wie folgt:
   > Samtools faidx /path/to/genome.fa
9. Verwenden BLAST + um Gene Ontology (GO) Bezug aus mehreren Modellarten (Mensch, Maus, Zebrafisch, Fruchtfliege und Hefe) auf Xenopus Gene weiterzugeben, wie folgt:
   1. Laden Sie alle kodierenden Sequenzen (CDS) als Einzel FASTA-Datei (cds.fa) von der UCSC Genome Browser über Extras/ Table Browser und aktualisieren BLAST + mit dem vorformatiert BLAST Datenbank von nicht-redundanten Proteine ​​(nr):
      > Update_blastdb.pl nr
   2. Suche für den menschlichen (txid9606), Maus (txid10090), Zebrafisch (txid7955), Fruchtfliege (txid7227) und Hefe (txid4932) Proteine ​​aus der NCBI-Website über seine erweiterte Suchfunktion (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / Protein / Fortgeschrittene) und senden Sie die Liste resultierende GI (Sequenzkennzahl) (sequence.gi.txt) mit dem Computer.
   3. Vergeben Xenopus Gene in die am ähnlichsten Proteine ​​aus dem GI-Liste durch die Ausführung BLASTx mit einer gewissen erwarten (E) Wert Cutoff (hier 10 ^-20). Stellen Sie sicher, das Ausgabeformat ist XML (-outfmt 5 -out blastx_results.xml). Nutzen zeitsparFäden (-num_threads), die mit der Anzahl der verfügbaren Rechnerkerne korrelieren.
      > Blastx -db / path / to / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / path / to / cds.fa -evalue 1e-20
      -outfmt 5 -out /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# Themen]
   4. Öffnen Sie die Datei des b2gPipe.properties b2g4pipe Ordner mit einem Texteditor und aktualisieren Sie die Datenbankeigenschaften zu Dbacces.dbname = b2go_sep13 und Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Führen b2g4pipe aus dem Installationsordner.
      > Java -cp Xmx1000m *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -in /path/to/blastx_results.xml
      -out Ergebnisse / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot
      HINWEIS: Dieses Programm extrahiert GO Bedingungen für jeden BLAST getroffen und ordnet sie den entsprechenden Xenopus Gene (xenTro7.annot). Unter Tools können die aktuellste Datenbankeinstellungen gefunden werden / Allgemeine Einstellungen / Dataaccess-Einstellungen des Blast2GO Java Web Start-Anwendung (siehe 9.11.1).

2. Chromatin Vernetzung

1. Düngung Xenopus Eier, de-Gelee und Kultur embryonen gemß Standardprotokollen ^20.
2. Übertragen Sie die dejellied Embryos (maximal 2.500 X. laevis oder 10.000 X. tropicalis) in der Entwicklungsphase von Interesse für eine 8 ml Glasprobengefäß mit Deckel und waschen Sie einmal kurz mit 0,01x MMR.
3. Fixieren die Embryonen mit 1% Formaldehyd in 0,01x MMR (zB Hinzufügen 225 ul 36,5-38% Formaldehyd zu 8 ml 0,01x MMR) für 15 bis 40 min bei RT (siehe Diskussion der Fixierungszeit und die Anzahl der Embryos erforderlichen pro Chip-Experiment).
   HINWEIS: Formaldehyd ist ätzend und sehr giftig. Es ist im Falle der Augen und der Haut, Verdauungsstörungen, und das Einatmen gefährlicher. Verwenden Sie den Abzug beim Hinzufügen von Formaldehyd in das Fläschchen.
4. Stoppen Sie die Fixierung durch kurzes Waschen der Embryonen dreimal mit kaltem 0,01x MMR. Lassen Sie sich nicht embry os Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeit, da die Oberflächenspannung bewirkt, dass sie bersten.
5. Aliquot der Embryonen in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eismit einem Maximum von 250 Embryonen pro Röhre, die ein Volumen von etwa 250 ul (X. tropicalis) oder 600 ul (X. laevis) vor dem Schlüpfen zu besetzen.
6. Pipette entfernt so viel 0,01x MMR wie möglich. Überspringen Sie den nächsten Schritt, wenn Sie sofort mit Kapitel 3 fort.
7. Äquilibrieren Embryonen in 250 ul kaltem HEG Puffer. Sobald die Embryonen auf den Boden des Rohres abgewickelt zu entfernen, so viel Flüssigkeit wie möglich und Schnapp Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C.

3. Chromatin Extraction

HINWEIS: Die nach der Extraktion aus vernetztem Chromatin von Xenopus-Embryonen arbeitet am wirksamsten mit den Fixierungszeiten in Schritt 2.3 und 50 bis 80 X. deutet tropicalis oder 25 bis 40 X. laevis Embryonen pro ml Extraktionspuffer E1, E2 und E3. Jeder Extraktionsstufe wird wiederholt, so dass das Doppelte der berechneten Volumen an Puffer benötigt. Für Upscaling, verwenden Sie mehrere 2 ml microcentrifuge Rohre oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie Proben und Puffer auf Eis während der Chromatin-Extraktion.

1. Ergänzen ausreichende Mengen von Puffern E1, E2 und E3 mit 1 mM DTT und Protease-Inhibitor Tabletten. Vor der Durchführung der Chip mit einer Phosphor-spezifischen Antikörpers weiter zu ergänzen Puffer mit 5 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4.
2. Homogenisieren fixierte Embryonen mit E1 durch Auf- und Abpipettieren. Zentrifuge Homogenate in einer Kühlzentrifuge (4ºC) bei 1000 g für 2 min (oder 5 min bei Verwendung von 50-ml-Röhrchen). Saugt den Überstand und keine Lipide an der Wand befestigt.
3. Resuspendieren Pellets in E1. Halten Sie Proben auf Eis für 10 min. Zentrifuge und Verwerfen Überständen, wie in Schritt 3.2.
4. Resuspendieren Pellets in E2. Zentrifuge und Verwerfen Überständen, wie in Schritt 3.2.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4, aber halten Sie Proben auf Eis für 10 Minuten vor dem Zentrifugieren.
6. Resuspendieren Pellets in E3. Halten Proben auf Eis für mindestens 10 min. Zentrifuge und entsorgen supernatants wie in Schritt 3.2.
   HINWEIS: In dieser Phase sollten die Resuspensionen ziemlich transparent. Die anionischen Detergenzien E3 extrahieren vernetzte Kerne durch Rendern meisten übrigen Eigelb Blutplättchen löslich.
7. Resuspendieren und Pool Pellets aus vernetzten Kernen (in der Regel braun gefärbt von den unlöslich Pigmentkörnchen) in einem Gesamtvolumen von 1 ml E3. Verdünnte Probe mit E3 zu 2 bis 3 ml, wenn es scheint, sehr viskos und schwierig zu pipettieren. Halten Sie sich auf Eis oder bei 4 ° C bis bei Schritt 4 von gleichen oder am nächsten Tag fort. Snap-freeze in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C für die spätere Verwendung.

4. Chromatin Fragmentierung

HINWEIS: Die Ultraschallbehandlung wird sowohl zur Solubilisierung und vernetzte Chromatin zu scheren. Hier sind Parameter, um die Misonix Sonicator 3000 mit einem 1/16 Zoll Kegelmikrospitze und Schallschutzkabine ausgestattet laufen. Bei Verwendung anderer Beschaller folgen Empfehlungen der Hersteller zu scherenvernetzten Chromatin oder verwenden 6 bis 12 W für 4 bis 8 min insgesamt.

1. Übertragen Sie die Kernprobe aus Schritt 3.7 in eine kundenspezifische Rohr für Beschallung (Schritt 1.4). Halten Sie die Probe während der Beschallung gekühlt, indem das Rohr mit einem 800 ml Kunststoffbecher mit Eiswasser über eine kurze Thermometer Klemm gefüllt befestigt.
2. Becherglas auf einem Labor-Buchse. Passen die Buchse, so daß der Beschallungsgerät Mikrospitze in der Probe auf etwa zwei Drittel des Volumens Tiefe eingetaucht und ohne Berührung der Rohrwand zentriert ist.
3. Beschallen die Probe für 7 Minuten insgesamt, unterbrach alle 30 Sekunden mit 1 Minute Pause. Stellen Sie den Netz bis 1,0. Starten Sie die Ultraschallbehandlung und sofort erhöhen die Leistungseinstellung (in der Regel 2 bis 4), um einen Messwert von 9 bis 12 W. Pause sofort, wenn die Probe beginnt zu schäumen zu erreichen. Positionieren Rohr und neu starten, wenn der Schaum vollständig verschwunden ist.
4. Übertragen Sie die geschert Chromatin in vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei voller Geschwindigkeit (> 15,000 × g) für 5 min bei 4 ° C.
5. Den Überstand vor, eine gekühlte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie 50 ul des Überstands (die Chromatinstruktur von etwa 400.000 oder mehr Kerne, die im Idealfall), den Grad der Fragmentierung Chromatin (Abschnitt 5) zu visualisieren. Verwenden Sie den Rest des Überstandes für Chip (Abschnitt 6).
6. Proben bei 4 ° C bis zu einem Tag. Schnappgefrierproben Aliquots (eine pro Chip-Experiment) in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -80 ° C.

5. Imaging Chromatin Fragmentierung

1. Zugeben von 50 ul SDS-Elutionspuffer, 4 ul 5 M NaCl und 1 ul Proteinase K (20 ug / ul) zu 50 ul des Überstands aus Schritt 4.6.
2. Inkubationszeit von 6 bis 15 h (O / N) in einem Hybridisierungsofen auf 65 ° C eingestellt.
3. Reinige DNA mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungs-Kit. Verwenden Sie gegebenenfalls 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zur pH-Einstellung, wie vom Hersteller empfohlen. Elution desDNA zweimal mit 11 & mgr; l Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5).
4. In 0,4 ul RNase A (20 ug / ul) und 5 ul 5x DNA-Ladepuffer, bevor Sie das gesamte Probe neben einer 100 bp und ein 1 kb DNA-Leiter auf einem 1,4% Agarose-Gel durch Elektrophorese. Für optimale Ergebnisse Flecken-Gel mit einem sicheren Nukleinsäure-Farblösung nach der Elektrophorese.

6. Chromatin Immunopräzipitation

HINWEIS: In diesem Abschnitt verwenden, Low-Retention-1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und mindestens 1 ml pro Röhrchen angegebenen Puffer an magnetische Kügelchen für 5 min waschen bei 4 ° C. Vor dem Entfernen des Puffers von den Kügelchen, lassen die Rohre in dem Magnetträger für 20 bis 30 sec jedes Mal oder bis die Lösung klar ist.

1. Transfer von 10 bis 30 & mgr; l des Überstands (geschert Chromatin) aus Schritt 4.6 in ein neues Röhrchen, die später als Eingangs Probe, die auf etwa 1% des Gesamt Chromatin für die Chip verwendet wird, entspricht eingesetzt werden. Lagerung bei 4° C bis zur Chip-Proben sind bereit für die Umkehr-Vernetzungen.
2. Die restliche Chromatin in ein neues Röhrchen. Für ChIP-qPCR-Experimente eine Antikörperkontrolle erfordern, zu verbreiten gleichen Volumina von Chromatin auf zwei Röhren.
3. Fügen Sie den ChIP Grade Antikörper (oder das entsprechende Antikörperkontrolle) an Chromatin. Als grobe Richtlinie, verwenden Sie etwa 1 ug Antikörper pro eine Million Zellen das Epitop von Interesse exprimieren.
   1. Um genauer zu schätzen die Menge an Antikörper pro Chip Experiment erforderlich, führen Sie den gleichen Chip mit verschiedenen Mengen an Antikörper (zB 0,25 ug, 1 & mgr; g und 2,5 & mgr; g) und vergleichen Sie die Rendite auf negative und positive Kontrolle loci von ChIP-qPCR (siehe Abschnitt 10). Als Antikörper-Kontrolle, verwenden normale Serum der gleichen Isotyps und Wirtstierspezies wie der Antikörper.
4. Inkubieren auf einem Rotor (10 min) O / N bei 4 ° C.
5. Wäsche eine ausreichende Menge an Antikörper-kompatible magnetische Kügelchen einmal mit E3 für 5 min eint 4 ° C. Kreuze An der Herstellerangabe für die Antikörper-Bindungskapazität der Beads (üblicherweise 5 bis 20 & mgr; l Kügelchen binden 1 ug IgG-Antikörper).
6. Fügen gewaschenen Perlen an den Antikörper vorinkubiert Chromatin. Weitere Inkubation auf einem Rotator (10 rpm) für 4 Stunden.
7. Wasch Perlen viermal (ChIP-qPCR) bzw. zehnmal (ChIP-Seq) mit vorgekühltem RIPA-Puffer, und dann einmal mit vorgekühltem TEN-Puffer.
8. Führen Sie nur diesen Schritt, wenn der Durchführung einer ChIP-Seq-Experiment.
   1. Resuspendieren gewaschenen Perlen in 50 ul TEN-Puffer pro Röhrchen. Pool Alle Perlen aus einem einzigen Chip Experiment durch Übertragung auf einen neuen Schlauch. Verwenden der magnetischen Zahn gekühlt (4 ° C) Zentrifugation bei 1000 × g zu Kügelchen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Verwerfen so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne dass der Pellet der Perlen.
9. Streifenspanmaterial aus den Kügelchen durch Resuspendieren der Kügelchen in 50 bis 100 & mgr; l SDS-Elutionspuffer und vortkontinuierlich Exing sie mit einem Thermomixer (1.000 rpm) für 15 min bei 65 ° C. Nach dieser Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (> 15.000 xg) für 30 Sekunden. Den Überstand (Eluat ChIP) in ein neues Röhrchen.
10. Wiederholen Sie den letzten Schritt und verbinden den Chip Eluate.

7. Chromatin umge Vernetzung und DNA Purification

1. Add genug SDS-Elutionspuffer mit dem Eingang Probe (Schritt 6.1), um das Volumen des Chips-Probe, die 100 bis 200 & mgr; l (Schritt 6.10) ist zu erreichen. Ergänzen Sie beide Chip und Eingangsabtastwerten mit 1/20 Volumen 5 M NaCl. Inkubieren der Proben für 6 bis 15 h (O / N) bei 65 ° C in einem Hybridisierungsofen.
2. 1 Volumen TE-Puffer und RNase A bei 200 ug / ml. Inkubieren für 1 h bei 37 ° C.
3. Hinzufügen Proteinase K bei 200 & mgr; g / ml. Inkubieren für 2 bis 4 Stunden bei 55 ° C.
4. Reinige DNA durch Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion gefolgt von Ethanol-Präzipitation wie vorstehend umrissen ^9. Für ChIP-Seq, fügen Sie 32ul Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5), um das DNA-Pellet zu lösen. Verlassen Proben auf Eis für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass die DNA vollständig gelöst ist.
   HINWEIS: Kommerzielle PCR-Reinigungs-Kits haben niedrigere DNA-Gewinnung sind aber bequemer, und kann für die Chip-qPCR Proben verwendet werden.
5. Für ChIP-Seq, bestimmen die Konzentration von 1 ul-Chip und Input-DNA mit Fluorometrie basierende Verfahren. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und stellen Sie sicher, dass DNA-Konzentration im zuverlässige Erfassungsbereich des Fluorometers fällt.

8. ChIP-Seq Library Construction and Validation

HINWEIS: Aktuelle Methoden zur DNA-Bibliothek Vorbereitung ermöglichen Bau von Hoch Komplexität Bibliotheken für NGS 1-2 ng. Auf Kosten von einiger Komplexität können Bibliotheken von weniger als 50 pg der DNA (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung) durchgeführt werden. Verwenden Sie die gleiche DNA-Menge sowohl für Chip und Eingabe Bibliothek. Kurz gesagt, um make indiziert (Paired-End) ChIP-Seq Bibliotheken ChIP und Input-DNA müssen end-repariert werden, um spezielle Adapter ligiert (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung), größenselektierten und PCR amplifiziert.

1. Folgen Sie den Richtlinien des Herstellers zu ChIP-Seq-Bibliotheken machen. Siehe Diskussion für weitere Empfehlungen.
2. Eluieren jede Bibliothek in 12 ul Elutionspuffer und bestimmt die Konzentration von 1 & mgr; l eines jeden Chips und Eingabebibliothek unter Verwendung eines Fluorometers. Erwarten Konzentrationen von 5 bis 25 ng / & mgr; l. Betrachten wir die Verringerung der Anzahl der PCR-Zyklen (weniger als 18 Zyklen), wenn die Konzentrationen höher als 25 ng / & mgr; l.
   HINWEIS: Eine genaue Quantifizierung ist der Schlüssel zur optimalen NGS Ergebnisse zu erzielen. Bibliotheken mit Konzentrationen nach 18 PCR-Zyklen so günstig wie 1 ng / ul können sequenziert werden, aber häufig von geringerer Komplexität.
3. Verwenden Sie 1 ul-Bibliothek, um die Bruchgrößenverteilung zu bestimmen und für jede Adapter-Dimer Verschmutzung (Band um 120 bp) von c zu überprüfenHip-basierten Kapillar-Elektrophorese. Wiederholen Sie den Festphasen reversible Immobilisierung Reinigung mit einem Perlen-zu-Probe im Verhältnis 1: 1 (anstelle von 1,6: 1), wenn die Bibliothek enthält Adapter Dimere.
4. Führen Sie auf qPCR validiert positiven und negativen Kontroll loci (siehe Punkt 10), um zu prüfen, ob ähnliche DNA-Anreicherung Trends werden vor und nach der Bibliothek Vorbereitung beobachtet. Senden Qualitätskontrolle genehmigt Bibliotheken für die Sequenzierung.

9. Post-Sequenzierungsanalyse und Datenvisualisierung

HINWEIS: Heute NGS wird häufig von im eigenen Haus oder kommerzielle Einrichtungen Sequenzierung (siehe Diskussion für einige NGS-Richtlinie) durchgeführt. Die Standardausgabe sind einzelne oder mehrere gzip komprimiert FASTQ-Dateien (* .fastq.gz) Speichern Millionen Sequenzierung liest. Normalerweise liest Multiplex bereits getrennt nach ihrem Index und jeder Lese enthält eine Sequenz-Kennung und ein Qualitätskontroll Score (Phred + 33 für Illumina 1.8+) pro base Anruf. Diese Vorgehensweise ist hier nur eine von vielen Möglichkeiten, wie NGS Daten analysieren. Der Leser wird aufgefordert, zu prüfen, ob eine der folgenden Befehlszeilen erfordern Änderungen dieses Feld schnell voran und Updates werden regelmäßig auftritt.

1. Verketten gzip komprimiert FASTQ Dateien und überprüfen Sie die Qualität der Sequenzdaten mit Hilfe der FastQC Skript. Führen Sie diese und die meisten der folgenden Befehle für beide Chip und Eingabesequenzdaten (Beispiele für die Chip gezeigt) von dem Endgerät:
   > Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
   > Fastqc ChIP.fastq.gz
   HINWEIS: Rohdaten aus der erfolgreichen Sequenzierung eines hochkomplexen ChIP-Seq Bibliothek sollte die meisten Tests bestehen. Ausfälle stammen hauptsächlich aus armen Sequenzierläufe und experimentelle Artefakte wie voreingenommen PCR-Amplifikation oder Adapter Kontamination. Ein gewisses Maß an Überschneidungen (Redundanz) wird erwartet, dass als redundante liest, kann in gutem Glauben DNA Bereicherung darstellen ^{21. Doch eines später einschränken Lesekennungen - das 5'-Ende oder liest - auf einen pro Basenpaar zur Beseitigung jeder redundante liest, ohne die Detektionsempfindlichkeit des Peaks (Schritt 9.4) 21.}
2. Pre-Prozess Sequenzierungsdaten zu Adapter Verunreinigungen zu entfernen (homerTools trimmen -3 ) ermöglicht eine Nichtübereinstimmung (-mis 1). Mit den ersten 20 Basen der (indexiert) Adapter (5 'nach 3') proximal zu dem DNA-Fragment von Interesse auf der Ligation (für Adapter in der Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung aufgeführt gezeigt).
   > Gzip -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vn> ChIP.fastq
   > HomerTools trimmen -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq
   HINWEIS: Das Entfernen der gefilterten liest (N) wird standardmäßig nur in FASTQ Dateien von Illumina 1.8 erzeugt erforderlich. Lassen Sie den Befehl fastq_illumina_filter (dh. "| Fastq_illumina_filter -vn ')wenn eine ältere Version als 1.8 erzeugt die Sequenzkennung.
3. Richten vorverarbeitet lautet auf die Referenzgenom (xenTro7) mit Bowtie. Immer nur eindeutig zugeordnet liest (-m 1) im Standardmodus, dh maximal zwei Fehlpaarungen in den ersten 28 Basen und insgesamt Phred + 33 Qualitätsfaktor aller Fehlanpassungen pro Lese von maximal 70 Bericht Ausrichtung in SAM-Format (-S) . Erhöhen Sie die Anzahl der Megabyte pro Thema (--chunkmbs), wenn das Stück Speicher erschöpft ist:
   > Bowtie -m 1 -S -p [# Themen] --chunkmbs [zB 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
   HINWEIS: Bowtie erwartet Phred + 33 Qualitätswerte standardmäßig. Fügen Sie die Option - phred64-quals wenn die FASTQ Datei mit Phred + 64 Qualitätsbewertungen von Illumina älter als 1.8 erzeugt.
4. Verwenden Sie zwei HOMER Befehle, um die Ausrichtung (SAM-Datei) in ein hohes Tier-Datei (.bw) umzuwandeln:
   > MakeTagDirectory ChIP / -single -tbp 1 ChIP.sam
   > MakeUCSCfile ChIP /-bigWig / path / to / genome.fa.fai -fsize 1E20 -Norm 1E7 -o ChIP.bw
   HINWEIS: Die Umwandlung erfordert die Gerüstindex (genome.fa.fai) des Bezugsgenoms (Schritt 1.8). Hier wird das Profil an einem Tag pro Basenpaar (-tbp 1) und normalisiert auf 10 Millionen begrenzt liest (-Norm 1E7). BIGWIG ist eine der bevorzugten Format an Chromatin-Profile mit einem Genom Browser wie IGV (Schritt 9.12) dynamisch zu visualisieren.
5. Bestimmen Sie die Verteilung der Tags (-d ChIP /) auf genomischer Sehenswürdigkeiten (zB +/- 10 kb mit 25 bp Tonnen, -si ze 20000 -hist 25) wie der Transkriptionsstart (tss, beispielsweise hier abgebildet) und Kündigung ( tts) Websites. Führen Sie das Perl-Skript HOMER annotatePeaks.pl mit Xenopus Anmerkungen xenTro7 (Schritt 1.7):
   > AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -size 20000 -hist 25 -d ChIP /> ChIP_tagDensity.tss
6. Suche signifikanten Spitzen von DNA Bereicherung zwischen Chip(-t ChIP.sam) und Eingang (-c Input.sam) in der X. tropicalis-Genom mit MACS2 mit einer 1% FDR Cutoff (-q 0,01) und DNA-Fragmente (nach Ultraschall) von 200 bp (--bw = 200) für den Modellbau. Fügen Sie die Flagge --broad dieser Befehlszeile erwarte eine breite Verteilung des Chromatins Merkmal von Interesse wie Histon-Markierungen oder RNA-Polymerase.
   > Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n ChIP -g 1.4376e9 -q 0,01 --bw = 200
   HINWEIS: Die effektive Größe der X. tropicalis-Genom Montage v7.1 ist etwa 1,4376 Mrd. bp (-g 1.4376e9). MACS2 erzeugt eine BED Datei (ChIP_peaks.bed) Anwerbung Tausender mit ihren genomischen Standorten.
7. Vergleichen Sie mehrere Chromatin-Profile in Form einer gruppierten Heatmap:
   1. Erstellen Sie ein Tag Verteilungsmatrix von Tag Dichte Verzeichnisse von Interesse (-d ChIP / other_ChIP /) am MACS2 Spitzen (zB +/- 1 kb mit 25 bp Tonnen, -size 2000 -hist 25 -ghist):
      > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 2000 -hist 25 -ghist -d ChIP / other_ChIP /> ChIP.matrix
   2. Verwenden Sie die grafische Benutzeroberfläche des Cluster3 zu ChIP.matrix-Datei hochladen und hierarchisch gruppieren diese Tag-Dichten auf der Grundlage der minimale euklidische Distanz zum nächsten Schwerpunkts. Öffnen Sie die erzeugten CTD-Datei in Java TreeView, um die Clusterbildung zu visualisieren.
8. Finden Sie neue und bisher bekannten Bindungsmotive, die zu Spitzengipfel angereichert sind +/- 100 bp (-size 200). Verwenden annotatePeaks.pl zu Motiv Ereignisse abzubilden und Motiv Dichten des Grundstückes:
   > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -Größe 200 -p [# Themen]
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -size 800 -hist 25> motif1.density
   HINWEIS: Die findMotifsGenome.pl Skript infers die Anreicherung aus dem Vergleich, um zufällig ausgewählte Gen-centric Hintergrund Sequenzen. Die angereicherte neuartige Motiv unter motif1.motif im Format eines Positionsgewichtungsmatrix gespeichert. Der Leser wird aufgefordert, diese Ergebnisse mit anderen De-novo-Motiverkennungsmethoden wie cisFinder ²² und MEME ²³ zu untermauern.
9. Kommentieren von Spitzen, die durch die Berechnung ihrer Entfernung zur nächsten Gen und durch Bestimmung ihrer normalisierten Lesezählung innerhalb von 400 bp Fenster (-size 400):
   > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 400 -d ChIP / Input /> ChIP_peaks.genes
10. Fassen Sie die Ausgabe mit dem folgenden Befehl awk, um die Anzahl (N), die Lage und normalisierte Lesezählung der einzelnen (R) und alle (LR) Peaks pro nächsten (Ziel) Gen aufzulisten.
    > Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
    {N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ", &# 39; 7 $ '(' $ 9 ')'} END {for (i in N)
    {Print i ' t' N [i] ' t' R [i] ' t' substr (LR [i], 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
    HINWEIS: Die Zahl nach $ bezieht sich auf die Spaltennummer, die der Änderung bedürfen möglicherweise die ChIP_peaks.genes Datei in der vorherigen Schritt erstellt passen. Dieses Skript Exemplar filtert Peaks über 5 kb stromaufwärts und 1 kb stromabwärts des TSS. $ 7, $ 8 und $ 9 beziehen sich auf die Entfernung zu dem TSS, das Gen-Kennung und der normalisierten Lesezählung pro Peak auf.
11. Führen Sie die Analyse angereichert GO Begriffe unter Zielgene, wie folgt:
    1. Starten Sie die grafische Benutzeroberfläche des Blast2GO von der Kommandozeile über Java Web Start (javaws) ^19.
       > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp
    2. Folgen Sie der Entwickler Anweisungen, um die Annotation hochladenDatei für Xenopus Gene (xenTro7.annot) wie in 1.9.4 erzeugt und eine flache Datei der identifizierten Zielgene. Stellen Sie sicher, dass die gleichen Gen-IDs werden in beiden Dateien.
12. Visualisieren Chromatin Profile, indem Bigwig (ChIP.bw, Input.bw) und BED-Dateien (ChIP_peaks.bed) in IGV als Spuren. Complement Daten mit RNA-Seq-Tracks, wenn für den gleichen Entwicklungsstufe zur Verfügung. Ergebnisse speichern als Session.
13. Verwenden Sie die Programmierung Plattformen R (www.r-project.org) oder MATLAB weiter zu manipulieren und zu visualisieren, Daten wie oben erzeugt. Alternativ plotten kleine Datensätze mit Excel.

10. ChIP-qPCR zum Testen Chip und bestätigen ChIP-Seq

1. Nutzen Sie die Online-Plattform Primer3 um Primer Umgebung etwa 100 bp DNA bei 60 ° C (T _m) für positive (Spitze-spezifisch) und Negativkontrolle Loci zu entwerfen. Bestätigen Primer-Spezifität mit Hilfe der In-silico- PCR-Suche in die UCSC Genome Browser implementiert.
2. Erstellen eines 8-Punkt-Standardkurve von Dreifachverdünnungen ausgehend von etwa 1% Eingang oder mit dem 2 ^{- ΔΔC (T) 8,24} Verfahren zur Quantifizierung von DNA-Anreicherung.
3. Führen Sie Echtzeit-PCR in technischen dreifach für alle Proben, dh ChIP, Kontrolle und, wenn es sein muss, Standardkurvenproben.
4. Plot DNA Anreicherung als Prozentsatz der Ausgangs-DNA oder als Verhältnis von Chip gegenüber der Kontrollprobe auf sowohl positive als auch negative Kontroll loci.

Gleichwertige Ergebnisse liefern wie die hier vorgestellt werden erwartet, wenn das Protokoll wird gut ausgeführt und der Antikörper verwendet wird von ChIP-Grade-Qualität (siehe Diskussion). Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung von Zellkernen aus Formaldehyd fixierten Xenopus-Embryonen und die effiziente Scher Chromatin durch Beschallung (1A-C). Geschert Chromatin zeigt eine asymmetrische Verteilung von DNA-Fragmenten vor allem im Bereich von 100 bis 1.000 bp und Peaking zwischen 300 und 500 bp (Abbildung 1C). Eine minimale 50 pg von immunpräzipitierten DNA wird benötigt, um erfolgreich zu machen eine indizierte Paired-End ChIP-Seq-Bibliothek mit ähnlich großen DNA-Inserts (Abbildung 2A). Die Bibliothek sollte weitgehend frei von Dimeren Adapter, die auf dem Elektropherogramm bei etwa 120 bp gesehen werden kann.

Nach Sequenzierung-durch-Synthese, vorverarbeitet Lesewerte werden in das Genom (Abbildung 2B, C) ​​abgebildet. In einem erfolgreichen Versuch mit X. tropicalis Embryonen liest von 40 bp in der Regel 50 bis 70% der Einendmaschine eindeutig zum Genom Zusammenbau v7.1 mit maximal zwei Fehlpaarungen zugeordnet werden. Während einliest auszurichten ziemlich gleichmßig über das Genom, die Ausrichtung des Chips liest ergibt strangspezifische Anreicherung, die die Chromatinstruktur Merkmal von Interesse flankieren. Dies ist, da alle Fragmente werden von dem 5'-Ende (2C) ²⁵ sequenziert. Die Ausweitung der Ausrichtung in Leserichtung zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße ermöglicht exakte Profile für einzelne Chromatin Funktionen wie Transkriptionsfaktor-Bindungsereignisse. Diese DNA-Belegungen erscheinen als Peaks, wenn in IGV oder einem anderen kompatiblen Genom-Browser visualisiert. Peak Anrufern wie MACs verwendet, um den Ort dieser Peaks (3A) zu bestimmen. Auf diese Weise Zehntausende von Bindungsstellen wurden in der X. bestimmt tropicalis-Genoms für die T-Box-Transkriptionsfaktoren wie VEGT ^26. ChIP-qPCR Erfahgen sollte die lokale Anreicherung von ChIP-Seq (3B) gefunden zu bestätigen.

ChIP-Seq-Experimente erlauben die Erkundung genomweiten Eigenschaften von Chromatin-Funktionen. Beispielsweise kann die Berechnung der Lese- Verteilung über genomischen Elemente wie Transkriptionsstart und Terminationsstellen keine räumliche Bindungspräferenzen rund Gene (3C) zu markieren. Ebenso ist eine Heatmap der Lese Distributionen zu Stoßstellen wird verwendet, um verschiedene Chromatin Features auf einen genomweiten Skala (3D) zu vergleichen. Bestimmte Transkriptionsfaktoren binden DNA sequenzspezifisch. De novo-Motiv-Analyse der genomischen DNA zugrunde liegenden Peaks können diese Art von Informationen, einschließlich Co-angereicherten Motive potentieller Kofaktoren (3E) abzurufen. Die große Mehrheit der Zielgene zeigen DNA-Belegung zu einem niedrigeren und nicht höhere Ebene (3F). Diese Skala freie Funktion scheint recht häufig bei transcription Faktoren und schlägt vor, daß nur ein kleiner Bruchteil der Zielgene sind direkt mit biologischer Relevanz ^27,28 geregelt. Die Analyse der angereicherten GO Begriffe oder andere Eigenschaften wie beispielsweise die differentielle Expression von Zielgenen können ferner offenbaren Einblicke in die biologische Funktion des Chromatins Funktion im Xenopus Embryo (Figur 3G).

Abbildung 1. Chromatin Immunopräzipitation Verfahren für Xenopus-Embryonen. (A) Die Embryonen sind Formaldehyd fixierten in der Entwicklungsphase von Interesse kovalent binden (vernetzen) alle Proteine ​​mit genomischer DNA assoziiert. Bei der Kerngewinnung (B), wird vernetzt Chromatin fragmentiert, um gezieltere genomischen DNA-Bindung oder Chromatinmodifizierung Websites durch Minimierung der flankierenden DNEine Sequenz (C). Anschließend werden die Chromatin-Fragmente mit einem Chip-Grade-Antikörper immunpräzipitiert zu denen, die das Epitop von Interesse (D) anzureichern. Die co-immunpräzipitiert DNA wird das Protein ausgezogen und vor dem Erstellen der ChIP Fragmentbibliothek für NGS (Abbildung 2) gereinigt (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2. ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung, Sequenzierung-durch-Synthese, die Kartierung und Spitzen Berufung. (A) Das Elektropherogramm zeigt eine gute ChIP-Seq-Bibliothek mit DNA-Matrizen von 250 bis 450 bp. Diese Vorlagen beinhalten die DNA-Insert von Interesse durch die universelle (58 bp) flankiert und die indexierte (63 bp) Adapter. (B) Millionen von Clustern, wobei jeder Cluster mit identischen Vorlagen sind sequenziert Base für Base in Gegenwart von allen vier Nukleotiden besitzen, reversible, deutliche Fluorophor und identische Kündigungs Eigenschaften. Fluoreszenzbilder werden in Echtzeit verarbeitet werden, um entsprechenden Basen, die letztlich zusammengebaut in liest nennen. (C) nur liest, dass Karte eindeutig dem Xenopus Genom aufbewahrt. Da alle Fragmente werden von dem 5'-Ende sequenziert, zur Kartierung der ChIP liest ergibt strangspezifischen Peaks, die die Chromatinstruktur Merkmal von Interesse flankieren. Dabei Spitzen Anrufer erkennen die Bereicherung durch die Immunpräzipitation stammt und erweitern das heißt zu einer durchschnittlichen Fragmentlänge genau zu lokalisieren Chromatin Funktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3 Ein Beispiel einer Post Sequenzierung Analyse und Visualisierung von Daten mittels des zygotischen T-Box-Transkriptionsfaktor VEGT (zVegT). Alle Lesezählungen hier dargestellt sind normalisiert auf 10 Millionen eindeutig abgebildet und nichtredundanten liest. (A) Auszug der genomweiten Profil zVegT verbindlich in X. tropicalis Gastrula Embryos (Stadium 11 bis 12,5 nach Nieuwkoop und Faber ^29). Jeder Peak, eine Anhäufung von erweiterten liest, stellt eine Bindungsstelle. Diese Spitzen sind durch MACS2 mit einem falschen Discovery Rate (FDR) von weniger als 1% genannt. Jeder MESP-Gens zeigt sehr proximalen und stromauf zVegT Bindung, sondern nur mespa und mespb durch diese Stufe (RNA-Seq-Daten ³⁰⁾ ausgedrückt. (B) DNA Belegungsniveaus zVegT durch ChIP-qPCR an verschiedenen Loci bestimmt (einschließlich eines nicht -gebundenen Region 0,5 kb stromaufwärts von β-Aktin) Konfirm die spezifische Anreicherung von ChIP-Seq gefunden. Ergebnisse für mespa mit Peak genannt (roter Balken) in (A) vergleichen. Die DNA Belegungspegel als Prozentsatz der Eingang für beide, den Chip mit der VEGT Antikörper (polyklonaler Kaninchen-IgG-Isotyp) und dem Chip mit dem Antikörper-Kontrolle (normales Kaninchen IgG) visualisiert. Fehlerbalken geben die Standardabweichung von zwei biologischen Replikaten. (C) METAGENE Analyse zeigt Präferenz zVegT Bindung (Tags über 25 bp klassierten) mit dem Promotor in Bezug auf jede andere Genombereich um und in Gen Körpern. (D) Bewegungsradius zeigt k-Mittelwert Cluster (k = 5) DNA Auslastung der zVegT und Smad2 / Smad3 (ChIP-Seq Daten ³¹⁾ bezogen auf alle zVegT gebundenen Regionen Gastrulastadium (Tags über 25 bp klassierte). Die Heatmap ist log ₂ basiert und bei 5 Tags pro bp zentriert. (E) De-novo-Motiv-Analyse entdeckt die kanonische T-Box-Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv in 38% der zVegT-Regionen gebunden, wenn die zugrunde liegende Motiv Wertung ist auf einer Entdeckungsrate von 5% im Hintergrund Sequenzen. Die Dichte Karte zeigt höchsten Anreicherung für den T-Box-Motiv in der Mitte zVegT Bindungsstellen, wobei die kanonische Smad2 / Smad3 Bindungsmotiv kaum angereichert. (F) Histogramm zeigt DNA Belegungsniveaus zVegT, die für jedes Ziel-Gen berechnet werden von allen Gipfeln (+/- 200 bp) zwischen 5 kb stromaufwärts [-]. und 1 kb stromabwärts [+] der entsprechenden Transkriptionsstartstellen (G) Top 300 Gene, die mit höchsten DNA-Auslastung innerhalb -5 kb und 1 kb sind für biologische Prozesse der frühen Embryonalentwicklung bereichert. Diese GO Begriffe sind im Einklang mit der vermeintlichen Funktion zVegT. Der FDR auf einem zweiseitigen Fisher-Test basiert und für multiples Testen korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Unser Protokoll beschreibt, wie zu machen und zu analysieren, genomweite Chromatin Profile Xenopus-Embryonen. Es umfasst alle Schritte von vernetzenden Proteinen an endogenen Loci in vivo auf die Verarbeitung Millionen liest, die angereicherten genomische Websites in silico. Da immer mehr Genom Entwürfe zur Verfügung stehen, sollte dieses Protokoll auf andere Modell und nicht-Modellorganismen sein. Die wichtigsten experimentellen Teil, der dieses Protokoll von bisherigen Arbeit ^8,31,33,34 stellt, ist die nach der Fixierung vor, um vernetzte Kerne zu extrahieren. Es ermöglicht die effiziente Chromatin Solubilisierung und Scher und einfach Upscaling. Zusammen mit verbesserten Wirkungsgraden von Bibliothek Vorbereitung dieses Protokoll erlaubt den Aufbau hochkomplexe ChIP-Seq-Bibliotheken von eineinhalb bis zwei Millionen Zellen der Chromatin-assoziierte Epitop von Interesse exprimieren. Für ChIP-qPCR-Experimente, einige zehntausend dieser Zellen sind in der Regel genug,für DNA Bereicherung auf vielleicht sechs verschiedenen genomischen Loci zu überprüfen. Diese Zahlen sind vorsichtige Schätzungen, kann aber je nach Expressionsniveau Protein, Antikörper Qualität abhängig, Vernetzungseffizienz und Epitop Zugänglichkeit. Als Richtwert ca. 4000 Zellen in der Mitte Blastulastadium (8,5 nach Nieuwkoop und Faber ²⁹⁾ enthält eine einzige Xenopus Embryo, 40.000 Zellen in der späten Gastrula-Stadium (12) und 100.000 Zellen in einem frühen Schwanzknospe Bühne (20).

Die exakte Fixierung Zeit für eine effiziente Immunfällung muss empirisch durch ChIP-qPCR (§ 10) ermittelt werden. Im allgemeinen werden mehr Fixierungszeiten benötigt, wenn das Experiment beinhaltet X. laevis Embryonen frühen Entwicklungsstadien, und schwach (oder indirekte) DNA-Bindungseigenschaften. Es wird jedoch nicht empfohlen Befestigungs Xenopus Embryonen länger als 40 Minuten, oder Verarbeitung mehr Embryonen als angegeben (Abschnitt 3), Chromatin Scher wird weniger effizient. Es ist wichtig,jede Glycin nach der Fixierung als dieser gemeinsamen Schritt zum Abschrecken Formaldehyd Kernentnahme aus dotterreichen Embryonen sehr schwierig machen zu verwenden. Derzeit ist der Grund hierfür nicht bekannt. Es ist denkbar, dass die Formaldehyd-Glycin-Addukt ferner mit N-terminalen Amino-Gruppen oder Argininresten ³⁵ reagiert.

Der Antikörper ist der Schlüssel für ein Chip-Experiment und ausreichende Kontrollen müssen durchgeführt, um ihre Spezifität für das Epitop von Interesse zeigen werden (siehe Richtlinien Landt et al. ^36). Wenn kein ChIP Grade Antikörper verfügbar ist, kann die Einführung von entsprechenden Epitop markierte Fusionsproteine ​​eine legitime Alternative sein, da diese Proteine ​​Bindungsstellen besetzen ³⁷ endogen. In diesem Fall sind nicht injizierten Embryonen am besten, als negative Kontrolle eher als ein Chip mit unspezifischen Serum zu verwenden. Diese Strategie kann auch angewendet werden, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau, was zu der schlechten Rückgewinnung des enri ausdrückenched DNA.

Als zur Herstellung ChIP-Seq Bibliotheken, wegen der geringen Menge an DNA, im Gebrauch, ist es empfehlenswert, für Verfahren, die die Anzahl der Reinigungsschritte zu verringern und um eine Reaktion zu kombinieren, um den Verlust von DNA auf ein Minimum zu entscheiden. Die Adapter und Grundierungen müssen mit Multiplex-Sequenzierung und der NGS-Plattform kompatibel sind (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Geräte). Bei der Verwendung von Y-Adaptern (mit langen Einzelstrang-Arme), ist es wichtig vor, verstärken die Bibliothek drei bis fünf PCR-Runden vor size-Auswahl DNA-Insertionen (z. B. 100 bis 300 bp) durch Gelelektrophorese. Einzelsträngigen Enden verursachen DNA Fragmente heterogen migrieren. Testläufe mit verschiedenen Mengen an Ausgangs-DNA (zB 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 und 20 ng) werden empfohlen, um die Gesamtzahl der PCR-Zyklen zu bestimmen (weniger als oder gleich 18 Zyklen) erforderlich, um eine Größe zu machen -Ausgewählte Bibliothek von 100 bis 200 ng. Verringerung der Anzahl der PCR-Zyklen macht die Sequenzierung redundant liest weniger wahrscheinlich. Die Festphasen-reversible Immobilisierung Perlen sind gute Reinigung Reagenzien zur effizienten Wiederherstellung der DNA von Interesse und zuverlässig entfernen Sie alle freien Adaptern und Dimere von Ligation und PCR-Reaktionen.

In Bezug auf die Anzahl, Art und Länge der liest, um 20 bis 30 Millionen Single-End liest von 36 bp ist genug für die meisten ChIP-Seq-Experimente, die ganze Xenopus Genom mit ausreichender Tiefe zu decken. Die häufigsten NGS Maschinen sind routinemäßig in der Lage, die diese Kriterien erfüllen. Es kann jedoch von Vorteil sein, um die Anzahl zu erhöhen der liest, wenn eine breite Verteilung der liest wird erwartet, da mit Histon-Modifikationen zu beobachten, anstatt scharfe Spitzen. Für viele ChIP-Seq Experimenten 4 bis 5 unterschiedlich indizierten Bibliotheken gepoolt und in einer Durchflusszelle Fahrspur unter Verwendung einer Hochleistungsmaschine NGS sequenziert werden. Manchmal ist auch ratsam, die Lese Länge und Sequenz an beiden Enden der DNA-Vorlage (Paired-End), um Abbildbarkeit w erhöhen verlängernHenne Analyse Chromatin innerhalb repetitiven genomischen Regionen.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Chromatin Funktionen wie Transkriptionsfaktoren, Signalmediatoren und posttranslationale Histonmodifizierungen aufgebracht. Allerdings Embryonen gewinnen einen zunehmenden Grad an zellulärer Heterogenität, wie sie sich entwickeln und Chromatin-Profile schwerer zu interpretieren. Erste Schritte auf in Arabidopsis und Drosophila gewebsspezifisch Profil Chromatin Landschaften durch Extrahieren zelltypspezifische Kerne ^38,39 erzielt. Unser Protokoll umfasst eine Kernextraktionsschritt, der den Weg für die gewebespezifische ChIP-Seq anderer Embryonen bahnen könnte.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Chris Benner for implementing the X. tropicalis genome (xenTro2, xenTro2r) into HOMER and the Gilchrist lab for discussions on post-sequencing analysis. I.P. assisted the GO term analysis. G.E.G and J.C.S. were supported by the Wellcome Trust and are now supported by the Medical Research Council (program number U117597140).