Мышечные сенсорные нейроны вовлечены в Проприоцептор сигнализации, а также доклад о метаболических государственных и травм, связанных с событиями. Опишем взрослую мышь в пробирке подготовки мышц нерва для исследований натяжных активированного мышечных афферентов.

Мышечные сенсорные нейроны, иннервирующие мышцы шпиндели и Гольджи сухожилия органы кодировать изменения длины и силы, необходимые для проприоцепции. Дополнительные афферентные волокна контролировать другие характеристики среды мышц, в том числе наращивание метаболита, температуры и ноцицептивных стимулов. В целом, ненормальное активация сенсорных нейронов может привести к двигательных расстройств или хронических болевых синдромов. Опишем изоляцию пальцев мышцы (EDL) мышцы и нерва для исследования в пробирке натяжных-вызвали афферентных реакций в взрослой мыши. Сенсорная действия записываются от нерва с всасывающим электродом и индивидуальные афференты могут быть проанализированы с помощью шипа сортировки программного обеспечения. В пробирке препараты позволяют хорошо контролируемых исследований по сенсорных афферентов без потенциальных смешивает анестезии или изменены мышечной перфузии. Здесь мы опишем протокол для выявления и проверить реакцию мышц шпинделя афферентов растянуть. Важно отметить, чтоэтот препарат также поддерживает изучение других подтипов мышечных афферентов, свойства реагирования после применения препарата и включения мощных генетических подходов и моделей заболеваний у мышей.

Скелетные мышцы иннервируются сенсорными нейронами, которые предоставляют на центральную нервную систему с важной информацией о состоянии окружающей среды мышц. Мышечные веретена являются узкоспециализированными инкапсулированные структуры, состоящие из интрафузальных мышечных волокон, расположенных параллельно с extrafusal мышечных волокон. Шпиндели иннервируются группы Ia и II афферентов, которые кодируют изменения длины мышц и интрафузальных тоном волокна динамически регулируется иннервирующих гамма моторных нейронов ^1. Группы IB афферентов расположены между мышечными волокнами и их сухожилий и чувствительны к изменениям в мышечной силы, например, при сокращении мышц ^2. Группа Ia, Ib и афференты II обеспечивают проприоцептивной обратной связи, что помогает в соответствующем управления двигателем. Дополнительные популяции мышечных афферентов, расположенных по всей мышцы (Группа III и IV), служат для накопления сигнала метаболита, присутствие ноцицептивных стимулов и температуру мышц ^{3. Эта мышца сенсорная информация имеет решающее значение для поддержания гомеостаза, предотвращая повреждение мышц и модуляции движение. Мышечные афференты может изменить свои модели огневые основе предшествующего опыта 4. Активация болевых рецепторов может привести к индукции хронической боли и 5 аберрантной сигнализации от мышечных проприоцепторов может привести к проблемам с балансом или движения 6. Мы используем изолированный мышц-нерв в пробирке подготовки изучить реакцию окончаний сенсорных рецепторов нейронов мышц от взрослых мышей обоих полов (показанных ответы от 2-4 месяца старый мышей C57BL / 6). Мышь является модель генетического видов для исследований у млекопитающих. Этот препарат требуется выделение глубокой малоберцового ветви седалищного нерва и длинный разгибатель пальцев (EDL) мышцы, быстро дергаться мышцы малоберцового группы, найденного в боковой части голени. EDL часто используется для изучения мышц сократительные свойства 7-9, имеет TEndons, которые легко изолировать и достаточно мал, чтобы обеспечить достаточное снабжение диффузионного кислорода в покое и с разумными циклов сжатия грузоподъемности 10. Другие мышцы в этой области (например камбаловидной и передней большеберцовой) имеют одинаковый размер и этот препарат может быть легко модифицирована для записи с афферентов из этих мышц. Всасывания электрод помещают на обрезанный конец нерва, чтобы записать мышц сенсорной афферентной стрельбы. Индивидуальные нейроны могут быть выявлены и проанализированы на основе их спайка форме с использованием шип сортировки программного обеспечения. Стимулирующих электродов в ванной или на нерв может быть использован, чтобы вызвать сокращение мышц. Длина мышцы и сила, можно контролировать и измеряется с использованием коммерчески доступных систем. Похожие на препараты пробирке были использованы на грызунах учиться Группа III и IV мышечные афференты на крысах EDL 11, Группа Ia и II шпинделя афферентов в крыс четвертой червеобразная ног мышцы 12 и группа III и IV мышечные афференты в тон мышь подошвенной мышцы 13.}

Система в пробирке имеет преимущества фармакологической доступности и непосредственным контролем перфузата и физико-химических переменных, таких как температура и рН. Подход в пробирке устраняет потенциал в естественных условиях смешивает анестезии и мышечной статуса перфузии. В то время как подготовка мышц-нерва позволяет для изучения прямого ответа возмущения на афферентов, способность учиться гамма эфферентной модуляцию шпинделя чувствительности и других комплексных мер, которые можно с в естественных условиях ¹⁴ или экс естественных ³ препараты приносится в жертву, как нет нейронные клеточные тела в данном препарате.

Этот препарат был ранее использован для характеристики реакции мыши мышцы шпинделя афферентов к батарее рампы и удерживайте участки и вибрации и было определено, что шпинделя мыши афферентные Responsэс были аналогичны приведенным в других видах, таких как крысы, кошки и человека. Мыши реакции шпинделя афферентные Было обнаружено, что аналогично как на 24 ° C и 34 ° C температуре ванны, хотя при 34 ° С ставок абсолютное обжига были быстрее и афферентов были более способны реагировать на более быстрого изменения длины ^15. Ниже мы описываем, как этот препарат может быть использован для определения и изучения афференты мышцы шпинделя. Кроме того, этот препарат может быть легко изменен, чтобы изучить реакцию с другими подтипами мышцы афферентных ^13, чтобы сравнить свойства сенсорных афферентных волокон в ответ на состояние лекарственного средства или заболевания или различных других переменных (например, возраст, пол, ген нокаут).

Соответствующие национальные и институциональные этика должна быть получена до выполнения экспериментов на животных.

1 Удаление EDL мышечных и нервных

1. Взвешивание и глубоко обезболить взрослую мышь с вдыхаемым изофлуораном помощью испарителя с 5% изофлуораном плюс 1,5 л / мин расход кислорода или колпаком с изофлуораном пропитанной хлопка на дне.
2. Убедитесь, что мышь находится глубоко под наркозом и не реагирует на забой крайнем случае. Быстро обезглавить используя большие, заостренные ножницами или гильотину.
3. Сделать вентральной разрез по средней линии через ребра с помощью ножниц и удалить внутренние органы.
4. Кожу животного, держа кожу от области шеи и потянув ее мимо ног.
5. Удалить ноги, сокращая выше бедер и поместите кожурой ноги в блюдо с охлажденной (4 ° С), carbogenated (95% O _2, 5% CO ₂₎ низкая кальция, с высоким содержанием магния бикарбоната буфером Contai солевой растворнин в мм: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 0,85 CaCl _2, 6,5 MgSO _4, и 10 глюкозы (рН 7,4 ± 0,05) ^16. Низкое содержание кальция, решение высокой магния тормозит передачу синаптическую во время вскрытия.
6. Поместите ноги спинной стороной вверх на блюдо и прикрепить ноги и бедра вниз, используя иглы или насекомых булавками так, чтобы коленного и голеностопного суставов являются под углом 90 °. Поместите булавку на каждом конце ног и одной булавки на каждом из передних и задних бедер держать ткань в месте.
7. Использование Castroviejo весенние ножницы, поднимите верхний слой мышц на бедрах и сделать среднюю линию сократить выставить седалищный нерв непосредственно ниже. Седалищный нерв находится чуть ниже верхнего слоя мышц и работает над бедренной кости от ее выхода ближайшем бедер пока он разветвляется на общий малоберцовый и большеберцовый нерв раз перед коленного сустава.
8. Удалите выше седалищного нерва мышцы до роInt, при котором глубокие малоберцового нерва отраслевые ныряет в сгибателей большого пальца стопы (FHL) мышцы видна.
9. Использование # 55 пинцета, рассекают соединительной ткани вокруг малоберцового отрасли, чтобы освободить его от икроножных и камбаловидной мышц, которые находятся на внутренней стороне голени. Вырезать сухожилия икроножной и камбаловидной мышц и осторожно удалите их из под нерва.
10. Удаление поверхностного мышцы на боковой стороне голени выставить три различных сухожилия связки на лодыжке совместное с медиальной к сторонам: FHL, EDL, и передней большеберцовой (TA), с EDL скрытой под TA.
11. Разрежьте сухожилие ТА в голеностопном суставе, поднимите TA и от EDL, и сократить мышцы возле колена, чтобы удалить его.
12. Разрежьте сухожилие FHL на лодыжке и поднять его обратно для достижения области, где нерв входит в FHL. Вырезать чуть ниже этой точки и удалить ~ 2/3 мышц FHL.
13. Вырезать седалищный нерв как можно ближе к тазобедренного сустава, как позможные и осторожно стирают все нервные ветви для глубокого малоберцового филиала исключением.
14. Вырезать сухожилия EDL на обоих голеностопных и коленных суставов, использующих большие весенние ножницы.
15. Использование острые ножницы, удалить EDL, оставшееся FHL и нервы от окружающей ткани путем перерезания голени кости в колене и на полпути через бедро. Срежьте оставшееся голени кости так, чтобы только EDL, часть FHL и нерва остаются.

2 Монтаж мышцы EDL и нерва в ткань Бат (1А)

1. Перед началом эксперимента, подготовить ткани ванны. Постоянно заливать ванну с кислородом (100% O ₂₎ синтетический межклеточной жидкости (SIF), содержащий (в мм) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO _4, 1,7 NaH ₂ PO _4, 2,0 CaCl _2, 9,5 NaC ₆ H ₁₁ O ( глюконат натрия), 5,5 глюкозы, 7,5 сахарозы, и 10 N 2-hydroxyethylpiperazine- N '-2-эhanesulfonic кислоты (HEPES); рН 7,4 ± 0,05 ^17. Скорость потока 15-30 мл / мин рекомендуется. Показаны является коммерчески доступным ванна из 25 мл мощностью с двумя стимулирующих электродов, прикрепленных к нижней части ванны, смонтированной сообщению ткани и горе для силовой и длины контроллера (размеры приблизительны ванны 8,5 см х 3 см х 1 см; для спецификации табл материалов / оборудования).
2. Используйте оставшиеся FHL ткани для обработки изолированной мышцы-нерв и поместить его в ткани ванны. Поместите небольшой кусочек Sylgard на дно тарелки и использовать штифт насекомых с помощью оставшихся FHL ткани, чтобы стабилизировать мышцы.
3. Используйте 6-0 шелковые швы, чтобы связать оба сухожилия и прикрепить один конец к сообщению тканей и другой рычагу силы и регуляторе длины (см таблицу материалов / оборудования для спецификаций). Используйте наименьшую длину шва, что является практичным. Снимите насекомых штифт и Sylgard после того как вы связали сухожилия. ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения легкоподключение к рычага небольшой кусок проволоки можно согнуть в "J" в форме крюка и фиксированной в рычага с эпоксидной смолой. Шов может быть привязан к проводу вместо резьбой в небольшое отверстие на рычаг.
4. Сделать всасывающие электроды от SA 16 стекла сначала с использованием стекла микропипетки съемник (Heat = 286, Pull = 0, скорость = 150, Время = 200); сломать кончик назад и вручную растереть его на точило, пока не будет о 3 мм конусом. Растопить наконечник, используя microforge в желании наконечника внутренним диаметром от 10 - 100 мкм в зависимости от области нерва, которую вы хотите отведать от (см рисунки 1B-1C для электрода схематическом и Таблица материалов / оборудования для получения информации).
5. Заполните Premade стекло всасывания электрод к внутренней серебряной проволоки с SIF.
6. Всасывания конец сокращения нерва в электрод и подключите к положительному порту дифференциального усилителя. Оберните электрод с хлорированном серебрапровод, который подключается к отрицательной порту headstage. Заземлить ванну SIF, запустив вторую хлорированный серебряной проволоки из ванны на первом порту headstage в. Также заземлить перфузии трубку к клетке Фарадея в нескольких точках, чтобы смягчить электрический шум вводится через перфузии насосов.
7. Стимулировать мышцы с помощью электродов, установленных по обе стороны от мышцы в ткани ванну, чтобы вызвать сокращение дергаться. В качестве альтернативы разместить стимулирующее электрода на обрезанный конец нерва. Увеличьте напряжение стимулирующее пока не наблюдается пик сократительная способность, а затем увеличить напряжение повышается на 15% до сверхмаксимальном напряжение (0,5 мсек длительности импульса). Продолжить сокращающиеся сокращений при напряжении сверхмаксимальном, с 10 сек отдыха в период между, но варьировать длину мышцы до пиковой силы сокращения достигается найти оптимальную длину (L _о) мышцы. Все Длина рампы и вибрации начнется с мышцы в этой Ленгго.
8. Разрешить препарат мышцы нерва, чтобы оставаться в бане в течение по крайней мере 1 часа до последующего сбора данных, чтобы позволить ткани, чтобы достичь температуры ванны и нормальной синаптической передачи, чтобы восстановить следующие вскрытия в низкой раствора кальция.
9. Для сбора данных, при температуре, отличной комнатной температуре, поместить датчик температуры в ванну ткани у мышцы. Медленно довести ванны до температуры путем откачки нагретой воды через ткань ванны опорной плите. Оберните глиняные Microwavable электрогрелки вокруг водохранилища SIF, чтобы помочь поддерживать стабильную температуру.

3 Сбор данных

1. Для идентификации афферентные как афферентных шпинделя, записать нейронную активность при повторных сокращающихся сокращений, произведенных напряжения стимула 0,5 мс сверхмаксимальном доставлен раз в секунду. ПРИМЕЧАНИЕ: Мышечные афференты шпинделя должны приостановить во время сжатия подергивание ^18,19 (рисунок 2).
2. Использование даПрограммное обеспечение та приобретения, чтобы применить изменения длины на разных скоростях и в различных длин. Используйте специальный скрипт, чтобы автоматизировать эту задачу (см дополнительную информацию для скриншота сценария и направлений о том, как настроить участки, данные). Применить рампы и удерживайте участки 4 сек при длине участке 2,5%, 5%, и 7,5% L _O и скоростей протяжение 20, 40, или 60% L _O / сек ^15. ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству пользователя для конкретной силы и регуляторе длины, для обеспечения необходимого коэффициента преобразования напряжения в миллиметр.
3. В конце эксперимента, определить здоровье мышц при 24 ° С с использованием максимальной изометрической тетанические сокращений (500 мсек на поезд, поезд 120 частоты Гц, 0,5 мсек длительности импульса, сверхмаксимальном напряжение). Сравните пиковую сократительную силу, чтобы сообщенные ранее значения (~ 24 Н / см ^{2 9,20).}

Реакция мышечных афферентов могут быть записаны следующие различных возмущений, которые в зависимости от афферентных подтипа изучается. Представительства ответы мышц шпинделя афферентов до мышц и рампы и провести прямую показаны здесь. Для идентификации афферентные как шпинделя афферентных, дергаться сокращения даны каждую секунду (0,5 мс ширина импульса), чтобы увидеть, если есть пауза в стрельбе во время сжатия ^18,19. Рисунок 2 показывает характерный след нейронной активности и мышечного напряжения во время эти подергивания схватки. Нет нейронная активность не наблюдается во время сокращающихся сокращений, как ожидается, для шпинделя афферентов. Если записанный афферентных был Группа Ib Гольджи сухожилия орган афферентные, увеличение скорострельность при сжатии можно было бы ожидать.

В условиях управления большинство афферентов с обычной схеме срабатывания (~ 12 импульсов / сек при 24 ° С и ~ 32 импульсов / сек при 34 ° C) Являются мышечные афференты шпинделя. Подмножество шпинделя афферентов будет только огонь в течение участке (в наших руках ~ 11% от шпинделя афферентов) ^15. 3А показывает представитель сырой след двух афферентов мышцы шпинделя отвечая на рампе и удерживайте участок производимого силы и длины контроллера. Функция Спайк Гистограмма LabChart используется для выявления и анализа мгновенную частоту стрельбы из двух отдельных нейронов отдельно (цифры 3B-3C).

Рис.1 изолированной мышцы Подготовка) длинный разгибатель пальцев (EDL) и иннервирующих седалищный нерв установлены в ткани ванной изолированной перфузии кислородом синтетического межклеточной жидкости (SIF). Внеклеточный усилитель подключен к suctiна электроде записывает нейронной активности. Двойной силой и длины импульса-с соответствующим программным обеспечением-меры контроля и мышечной силы и длины. В ткани ванны электроды доставить стимулы для производства дергаться или тетанические сокращений. Насосные нагретой воды через внутренние каналы ванна пластины регулирует температуру ткани ванны. B) Вытащил стекло всасывания электрод с ~ 3 мм концевой конус. C) Увеличенный изображением идеальной формы наконечника для всасывания электрода, который производится с использованием microforge. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 шпинделя Афферентный Ответ на Twitch сокращения. Нейронов Activitу (верхняя кривая) и напряжение мышц (нижний луч) от 30 сокращающихся сокращений накладываются с верхней перекрытия трассы в черный. Афферентные деятельность приостанавливается во время сжатия, вызванного увеличением напряженности, которая является характерной реакцией мышц шпинделя афферентов. Кронштейн и стрелка над верхней следа обозначать время во время сокращения, когда деятельность приостановлена.

Рис.3 шпинделя Афферентный Ответ на рампу и растянуть) Raw нервную деятельность двух афферентов (верхняя кривая) во время рампы и удерживайте участок, приложенное к EDL (длина мышцы показано на нижнем следа). B) мгновенная частота стрельбы (Ин. Отец, импульсы в секунду) блока, обладающего активностью в л _о с А (показаны синим цветом). C) InstantaneПодразделения частота генерации капель меньшего единицы, что срабатывает только во время растяжения (показано оранжевым цветом). Оба устройства обладают адаптацию частоты всплеск во время протяжения, что характерно для мышц шпинделя афферентов ^1.

Цель этой статьи заключается в описании способа записи с мышц шпинделя афферентов в изолированной подготовки мышь мышц нерва. Мы обнаружили, что шпиндель мыши афферентов реагировать аналогично растягиваться, как и у крыс, кошек и человека ^15, и других лабораторий использовали мышей в качестве модельных организмов для изучения сенсорных нейронов как в мышцах и коже в пробирке (например, ^3,13) .

Мышечные сенсорные афферентные могут быть записаны, по крайней мере 6-8 часов при обоих 24 ° С и 34 ° С. Чтобы свести к минимуму обработки EDL и нерва, используют оставшуюся часть FHL для обработки ткани, когда это возможно. После вскрытия, ждать по крайней мере 1 час, чтобы начать сбор данных, чтобы позволить ткани, чтобы уравновесить до температуры ванны и для нормальной синаптической передачи, чтобы восстановиться. Ранее здоровья мышц была проверена на подмножестве мышц, используемых в этом препарате, определяя, что максимальное тетанической Contractile сила, создаваемая мышц аналогичен тому, что описан другими в начале и в конце эксперимента ^15.

Мышечные афференты шпинделя были определены функционально в данном препарате, глядя на характерной паузы в стрельбе в ответ дергаться сокращение (рисунок 2), а также ожидаемые мгновенные частота увеличивается в ответ на изменения длины (рисунок 3). По нашему опыту, большинство афференты, что огонь в условиях контроля являются мышцы шпинделя афференты. Длина нерва сохраняется в этом препарате (~ 7 мм максимум) не достаточно долго, чтобы использовать афферентные различия скорости проводимости для определения мышечной афферентные подтипы ^13. Кроме того, в отличие от кошек и людей, меры динамической чувствительностью не смогли четко дифференцировать группы IA и афференты II у мышей (для дальнейшего обсуждения см Уилкинсон и соавт. ^15). Другие подтипы афферентов (т.е.., Группа III и IV), могут быть идентифицированы с помощью дополнительных функциональных тестов в этом препарате, например, путем добавления веществ, как капсаицин, АТФ или брадикинина, снижение рН ванны, подвергая мышцы к ишемии и т.д. ^3,13,21-23 Использование всасывающего электродов позволяет активности из нескольких сенсорных нейронов, которые будут записаны сразу же, что увеличивает количество данных, которые могут быть получены от одной мышцы. Этот препарат может использоваться для оценки общего эффекта возмущения на сенсорных реакций нейрона населения или ответах выявленных афферентов. Если шипованные формы достаточно уникальный, до 4 сенсорных нейронов может быть подвергнут дискриминации с помощью программного обеспечения (как Spike2 (Cambridge Electronic Design) и LabChart Pro (AD Instruments) провели аналогично). В тех случаях, когда нейроны не может быть различен, изменения в размещении электродов или диаметр наконечника может быть легко реализовано.

Таким образом, мышь мышцы нерва в пробирке В ведениевания является простой экспериментальный подход, который может быть использован для исследования свойств отклика мышечных сенсорных афферентов в различных физико-химических возмущений, травм и болезней моделей. Кроме того, этот препарат идеально подходит, чтобы воспользоваться мощными генетических инструментов, доступных на мышах, в том числе трансгенных животных и optogenetic инструментов.

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.