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Neuronas sensoriales musculares están implicadas en la señalización propioceptor y también informan sobre los eventos estatales y lesiones relacionados con el metabolismo. Describimos un ratón adulto en preparación muscular del nervio vitro para estudios sobre los aferentes musculares activados por estiramiento.

Neuronas sensoriales musculares que inervan los husos musculares y los órganos tendinosos de Golgi codifican cambios esenciales a la propiocepción de longitud y fuerza. Fibras aferentes adicionales supervisan otras características del medio ambiente muscular, incluyendo la acumulación de metabolito, la temperatura y los estímulos nociceptivos. En general, la activación anormal de las neuronas sensoriales puede conducir a trastornos del movimiento o síndromes de dolor crónico. Se describe el aislamiento del extensor digitorum longus (EDL) del músculo y el nervio para el estudio in vitro de las respuestas de aferentes de estiramiento-evocado en el ratón adulto. Actividad sensorial se graba desde el nervio con un electrodo de succión y aferentes individuales se pueden analizar usando software de pico de clasificación. Preparaciones in vitro permiten estudios bien controlados sobre los aferentes sensoriales sin los factores de confusión potenciales de la anestesia o la perfusión del músculo alterado. Aquí se describe un protocolo para identificar y probar la respuesta de los aferentes del huso muscular a estirar. Es importante destacar que,esta preparación también apoya el estudio de otros subtipos de aferentes musculares, propiedades de respuesta después de la aplicación de drogas y la incorporación de enfoques genéticos de gran alcance y modelos de enfermedad en ratones.

Los músculos esqueléticos están inervados por neuronas sensoriales que proporcionan el sistema nervioso central con información importante sobre el medio ambiente muscular. Los husos musculares son altamente especializados estructuras encapsuladas compuestos de fibras musculares intrafusal que se encuentran en paralelo con las fibras musculares extrafusales. Husillos están inervados por Grupo Ia y II aferentes que codifican los cambios en la longitud del músculo y el tono de fibra intrafusal está regulado dinámicamente por neuronas motoras gamma inervan ^1. Grupo Ib aferentes están posicionados entre las fibras musculares y sus inserciones del tendón y son sensibles a cambios en la fuerza muscular, por ejemplo durante la contracción muscular ^2. El Grupo Ia, Ib y II aferentes proporcionan retroalimentación propioceptiva que ayuda en el control motor apropiado. Poblaciones adicionales de los aferentes musculares ubicadas en todo el músculo (Grupo III y IV) sirven para indicar la acumulación de metabolito, la presencia de los estímulos nociceptivos, y la temperatura del músculo ^{3. Esta información sensorial muscular es esencial para mantener la homeostasis, la prevención del daño muscular y la modulación de movimiento. Aferentes musculares pueden alterar sus patrones de disparo basado en la experiencia previa 4. La activación de los nociceptores puede conducir a la inducción de estados de dolor crónico y 5 de señalización aberrante de los propioceptores musculares puede conducir a problemas con el equilibrio o el movimiento 6. Utilizamos un músculo aislado del nervio en la preparación in vitro para estudiar la respuesta de los receptores musculares terminaciones de neuronas sensoriales de los ratones adultos de ambos sexos (mostrados son las respuestas de 2-4 meses de edad C57BL / 6 ratones). El ratón es la especie genética modelo para estudios en mamíferos. Esta preparación requiere el aislamiento de la rama profunda peroneo del nervio ciático y el músculo extensor digitorum longus (EDL), un músculo de contracción rápida del grupo peroneo se encuentra en la parte lateral de la pierna inferior. La EDL se utiliza a menudo para estudiar las propiedades contráctiles del músculo 7-9, tiene tendons que son fáciles de aislar y es lo suficientemente pequeño como para permitir el suministro de oxígeno por difusión adecuada en reposo y con ciclos de trabajo contracción razonables 10. Otros músculos en esta área (por ejemplo sóleo y tibial anterior) son de tamaño similar y esta preparación podrían ser fácilmente modificados para grabar desde los aferentes de estos músculos. Un electrodo de succión se coloca sobre el extremo cortado del nervio para grabar muscular sensorial aferente de disparo. Las neuronas individuales pueden ser identificados y analizados en función de su forma pico usando pico software de clasificación. Electrodos de estimulación en el baño o en el nervio puede ser utilizado para evocar la contracción muscular. La longitud del músculo y la fuerza pueden ser controlados y medidos usando sistemas disponibles comercialmente. Similar en preparaciones in vitro se han utilizado en roedores para estudiar los aferentes musculares Grupo III y IV en la rata EDL 11, Grupo Ia y II aferentes del huso en la rata cuarto dedo del pie muscular lumbrical 12 y musculares Grupo III y IV aferentes en tque el músculo plantar del ratón 13.}

Un sistema in vitro tiene las ventajas de la accesibilidad farmacológica y el control directo de las variables perfundido y fisicoquímicas como la temperatura y el pH. Un enfoque in vitro elimina el potencial in vivo confunde de la anestesia y el músculo estado de la perfusión. Si bien la preparación de músculo-nervio permite el estudio de la respuesta directa de una perturbación en los aferentes, la capacidad de estudiar gamma eferente de modulación de la sensibilidad del husillo y otras respuestas integradas que es posible con ¹⁴ in vivo o ex vivo ³ preparados como se sacrifica no hay cuerpos de las células neuronales en esta preparación.

Esta preparación se utilizó previamente para caracterizar la respuesta de los aferentes del huso muscular de ratón a una batería de la rampa y mantenga estiramientos y vibraciones y se determinó que respons aferentes del huso ratónes fueron similares a los reportados en otras especies como ratas, gatos y seres humanos. Se encontraron respuestas de ratón aferentes del huso a ser similar en ambos de 24 ° C y 34 ° C la temperatura del baño, aunque a 34 ° C las tasas de disparo absoluta eran más rápidos y los aferentes eran más capaces de responder a la longitud más rápido cambia ^15. Se describe a continuación cómo esta preparación se puede utilizar para identificar y estudiar los aferentes del huso muscular. Además, esta preparación puede ser fácilmente modificado para estudiar la respuesta de otros subtipos de aferentes muscular ^13, para comparar las propiedades de los aferentes sensoriales en respuesta a un estado de drogas o enfermedad o una variedad de otras variables (por ejemplo, edad, sexo, knockout de genes).

Ética nacionales e institucionales apropiadas deben obtenerse antes de realizar los experimentos con animales.

1. Eliminación de EDL musculares y nerviosas

1. Pesar y profundamente anestesiar a un ratón adulto con isofluorano inhalado usando un vaporizador con 5% de isofluorano más un / caudal de oxígeno min 1,5 L o una campana de vidrio con isofluorano algodón empapado en la parte inferior.
2. Asegúrese de que el ratón está profundamente anestesiados y no responde a una pizca dedo del pie. Decapitar rápidamente usando grandes, tijeras afiladas o una guillotina.
3. Haga un corte en la línea media ventral a través de las costillas con unas tijeras y quitar los órganos internos.
4. Piel animal sujetando la piel de la zona del cuello y tirando de ella más allá de los pies.
5. Retire las piernas cortando por encima de las caderas y coloque las piernas de piel en un plato con frío (4 ° C), carbogenated (95% O _2, 5% CO ₂₎ niveles bajos de calcio, magnesio alta bicarbonato tamponada contai solución salinacación en mM: NaCl 128, KCl 1,9, 1,2 KH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, 0,85 CaCl _2, 6,5 _MgSO4, y 10 de la glucosa (pH de 7,4 ± 0,05) ^16. El bajo nivel de calcio, solución de alto magnesio inhibe la transmisión sináptica durante la disección.
6. Coloque las patas del lado dorsal en el plato y el pin de las piernas y las caderas hacia abajo usando agujas o alfileres de insectos para que las articulaciones de la rodilla y el tobillo están en un ángulo de 90 °. Coloque un perno en cada extremo de los pies y un pasador en cada uno de los muslos anterior y posterior para mantener el tejido en su lugar.
7. Usando tijeras de primavera Castroviejo, levante la capa superior de los músculos en los muslos y hacer una línea media cortado para exponer el nervio ciático directamente debajo. El nervio ciático se encuentra justo debajo de la capa muscular superior y discurre por encima del fémur de su salida cerca de las caderas hasta que se ramifica en el peroneo común y el nervio tibial justo antes de la articulación de la rodilla.
8. Retire el músculo por encima del nervio ciático hasta la point en el que las profundas inmersiones rama del nervio peroneal en el músculo flexor largo del dedo gordo (FHL) es visible.
9. Uso # 55 pinzas, diseccionar el tejido conectivo alrededor de la rama peronea para liberarla de los gemelos y sóleo músculos, que están en el lado medial de la tibia. Cortar los tendones de los músculos gastrocnemio y sóleo y retirar cuidadosamente el nervio de debajo.
10. Retire el músculo superficial en el lado lateral de la tibia para exponer tres paquetes distintos de los tendones en la articulación del tobillo de medial a lateral: FHL, EDL y tibial anterior (TA), con el EDL escondido debajo de la TA.
11. Cortar el tendón de TA en la articulación del tobillo, levante la TA arriba y lejos de la EDL, y cortar el músculo cerca de la rodilla para quitarla.
12. Cortar el tendón FHL en el tobillo y levantar de nuevo al llegar a la zona donde el nervio entra en la FHL. Corte justo debajo de ese punto y eliminar ~ 2/3 del músculo FHL.
13. Cortar el nervio ciático lo más cercano a la articulación de la cadera como possible y tira suavemente todas las ramas nerviosas excepción de la rama peroneo profundo.
14. Cortar los tendones EDL en las juntas ambas tobillo y la rodilla utilizando grandes tijeras de primavera.
15. Con unas tijeras afiladas, retire la EDL, el restante FHL y el nervio del tejido circundante al cortar a través del hueso de la tibia en la rodilla ya medio camino a través del muslo. Cortar el hueso de la tibia restante de manera que sólo el EDL, parte de la FHL y los nervios permanecen.

2. Montaje del músculo EDL y los nervios en el baño de tejidos (Figura 1A)

1. Antes del inicio del experimento, preparar el baño de tejido. Constantemente perfundir el baño con oxigenada (100% O ₂₎ líquido intersticial sintética (SIF) que contiene (en mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 _MgSO4, 1,7 NaH ₂ PO _4, 2,0 CaCl _2, 9,5 NaC ₆ H ₁₁ O ( gluconato de sodio), 5.5 glucosa, 7.5 sacarosa, y 10 N -2 hydroxyethylpiperazine--N '-2-etácido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 ^17. Se recomienda una velocidad de flujo de 15-30 ml / min. Se muestra un baño disponible en el comercio de la capacidad de 25 ml con dos electrodos de estimulación fijados a la parte inferior de la bañera, un puesto de tejido montado y un montaje para un controlador de fuerza y ​​la longitud (dimensiones aproximadas de baño de 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; para las especificaciones véase la Tabla de Materiales / Equipos).
2. Utilice el tejido FHL restante para manejar el músculo aislado del nervio y colocarlo en el baño de tejido. Colocar una pequeña pieza de Sylgard en la parte inferior del plato y utilizar un pasador de insectos a través del tejido FHL restante para estabilizar el músculo.
3. Utilice 6-0 suturas de seda para atar ambos tendones y colocar un extremo al poste de tejido y el otro al brazo de palanca de la fuerza y ​​regulador de duración (véase la Tabla de Materiales / Equipos para las especificaciones). Use la longitud más pequeña de sutura que es práctico. Retire el pasador de insectos y Sylgard después de haber empatado los tendones. NOTA: Para facilitar la fácilconexión con la palanca de armar un pequeño trozo de alambre se puede doblar en una "j" en forma de gancho y se fija en el brazo de palanca con epoxi. La sutura puede ser atado al alambre en lugar de rosca en el pequeño orificio en el brazo de palanca.
4. Hacer electrodos de succión de SA 16 vidrio utilizando primero un extractor de micropipeta de vidrio (Heat = 286, Pull = 0, Velocidad = 150, Tiempo = 200); romper la punta hacia atrás y manualmente se muele en una piedra de afilar hasta que no se trata de un cono de 3 mm. Derretir la punta usando una microforge al diámetro interior punta deseada de entre 10 a 100 micras dependiendo de la zona de los nervios que se desea muestrear (véanse las figuras 1B-1C para electrodo esquemática y en la Tabla de Materiales / Equipo para la información del producto).
5. Llene un premade electrodo de succión de vidrio para el alambre de plata interior con SIF.
6. Aspirar el extremo cortado del nervio al electrodo y conecte al puerto positivo de un amplificador diferencial. Envuelva el electrodo con una plata cloruradacable que se conecta al puerto negativo de la cabezal de la platina. Conecte a tierra el baño SIF ejecutando un segundo alambre de plata clorurada del baño al puerto de tierra del cabezal de la platina. También a tierra el tubo de perfusión a la jaula de Faraday en múltiples puntos para mitigar el ruido eléctrico introducido a través de las bombas de perfusión.
7. Estimular el músculo a través de los electrodos montados a cada lado del músculo en el baño de tejido para inducir una contracción de contracción. Alternativamente colocar un electrodo de estimulación en el extremo cortado del nervio. Aumenta la tensión estimulante hasta que se observe una fuerza contráctil pico y luego aumentar la tensión por un 15% adicional para alcanzar el voltaje supramáxima (0,5 ms de ancho de pulso). Continuar las contracciones musculares de contracción a la tensión supramáxima, con un descanso de 10 segundos en el medio, pero variar la longitud del músculo hasta que una fuerza contráctil máxima se alcanza para encontrar la longitud óptima (L _o) del músculo. Todas las rampas de longitud y vibraciones comenzarán con el músculo en este lengª.
8. Permitir la preparación de músculo-nervio para permanecer en el baño durante al menos 1 hora antes de la recolección de datos subsiguiente a permitir que el tejido para llegar a la temperatura del baño y para la transmisión sináptica normal a recuperarse después de la disección en una solución baja en calcio.
9. Para recoger los datos a una temperatura distinta de la temperatura ambiente, coloque una sonda de temperatura en el baño de tejido cerca del músculo. Poco a poco llevar el baño a la temperatura mediante el bombeo de agua caliente a través de la placa de base de baño de tejido. Envuelva almohadillas térmicas para microondas de arcilla alrededor del embalse SIF para ayudar a mantener una temperatura constante.

3. Data Collection

1. Para identificar un aferente como aferentes del huso, registrar la actividad neuronal durante las contracciones musculares de contracción repetidas producidas por un estímulo de tensión 0,5 supramáxima ms entregado una vez por segundo. NOTA: los aferentes del huso muscular deben hacer una pausa durante el ^18,19 contracción contracción (Figura 2).
2. Uso dasoftware de adquisición ta para aplicar los cambios de longitud a diferentes velocidades y con diferentes longitudes. Utilice un script personalizado para automatizar esta tarea (ver información complementaria para una captura de pantalla de la secuencia de comandos y las instrucciones sobre cómo personalizar los tramos indicados). Aplicar rampa y retención tramos de 4 segundos a longitudes de estiramiento de 2,5%, 5%, y el 7,5% _o L y velocidades de estiramiento de 20, 40, o 60% _o L / seg ^15. NOTA: Consulte el manual de usuario para la fuerza específica y regulador de duración para el factor necesario de conversión de voltaje a milímetro.
3. Al final del experimento, determinar la salud del músculo a 24 ° C por medio de contracciones tetánicas isométricas máximas (500 trenes ms, 120 Hz de frecuencia de trenes, 0,5 ms de ancho de pulso, tensión supramáxima). Comparar la fuerza de contracción de pico a valores reportados anteriormente (~ 24 N / cm ^{2 9,20).}

La respuesta de los aferentes musculares se puede grabar después de una variedad de perturbaciones, dependiendo de qué subtipo aferente está siendo estudiado. Respuestas representativas de aferentes del huso muscular a la contracción muscular y la rampa y mantenga tramo se muestran aquí. Para identificar un aferente como un aferente husillo, de contracción contracciones se administra una vez cada segundo (0,5 mseg de ancho de pulso) para ver si hay una pausa en la cocción durante ^18,19 contracción. Figura 2 muestra una traza representante de la actividad neuronal y la tensión muscular durante estas contracciones musculares de contracción. No se observa actividad neuronal durante las contracciones musculares de contracción, como se esperaba para aferentes del huso. Si el aferente registrada fue de un aferente órgano tendinoso de Golgi Grupo Ib, un aumento en la tasa de disparo durante la contracción sería de esperar.

Bajo condiciones de control de la mayoría de los aferentes con un patrón de disparo normal (~ 12 impulsos / seg a 24 ° C y ~ 32 impulsos / seg a 34 ° C) Son aferentes del huso muscular. Un subconjunto de los aferentes del huso sólo se activará durante el tramo (en nuestras manos ~ 11% de las fibras aferentes del huso) ^15. Figura 3A muestra una traza prima representante de dos aferentes del huso muscular en respuesta a una rampa y mantenga estiramiento producido por el controlador de la fuerza y duración. La característica de Spike histograma de LabChart se utiliza para identificar y analizar la frecuencia de disparo instantáneo de las dos neuronas individuales por separado (figuras 3B-3C).

Figura 1. musculares aisladas Preparación A) El extensor largo de los dedos (EDL) y que inerva el nervio ciático se montan en un baño de tejido aislado perfundido con líquido intersticial sintética oxigenada (SIF). Un amplificador extracelular conectado a un venten el electrodo registra la actividad neuronal. Un doble fuerza y ​​duración de controlador con software-controles y medidas apropiadas fuerza muscular y la longitud. Los electrodos de baño tejidos ofrecen estímulos para producir contracción o contracciones tetánicas. El bombeo de agua caliente a través de los canales internos de la placa del baño controla la temperatura del baño de tejidos. B) Pulled electrodo de succión de vidrio con ~ 3 mm punta cónica. C) ampliada representación de la forma de la punta ideal para el electrodo de succión que se produce utilizando un microforge. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. husillo aferente Respuesta a Twitch contracción. Activit Neuronaly (trazo superior) y la tensión muscular (traza inferior) de 30 contracciones musculares de contracción se superponen con trazo superior superpuesta en negro. Actividad aferente hace una pausa durante el aumento de la tensión inducida por la contracción-, que es una respuesta característica de los aferentes del huso muscular. Soporte y flecha por encima del trazo superior denotan el tiempo durante la contracción cuando se detiene la actividad.

Figura 3. husillo aferente Respuesta a la rampa y Hold Stretch A) la actividad neuronal Raw de dos vías aferentes (superior traza) durante una rampa y mantenga estiramiento aplicado a la EDL (longitud del músculo se muestra en la traza de fondo). B) frecuencia de disparo instantáneo (Inst. Fr., impulsos por segundo) de la unidad de actividad en L _o de A que exhibe (en azul). C) instantanéous frecuencia de disparo de la unidad más pequeña que sólo se activa durante la recta final (se muestra en color naranja). Ambas unidades presentan la adaptación a la frecuencia pico durante tramo que es característico de aferentes del huso muscular ^1.

El objetivo de este artículo es describir un método para la grabación desde los aferentes del huso muscular en una preparación del ratón músculo-nervio en forma aislada. Hemos encontrado que aferentes del huso ratón responden de manera similar para estirar como los de ratas, gatos y seres humanos ^15, y otros laboratorios han utilizado ratones como organismos modelo para estudiar las neuronas sensoriales tanto en el músculo y la piel in vitro (por ejemplo ^3,13) .

Aferentes sensoriales musculares pueden ser grabados durante al menos 6-8 horas a ambos de 24 ° C y 34 ° C. Para reducir al mínimo el manejo de la EDL y el nervio, utilizar la parte restante de la FHL para manejar el tejido siempre que sea posible. Después de la disección, espere por lo menos 1 hora para iniciar la recopilación de datos para permitir que el tejido se equilibre a la temperatura del baño y para la transmisión sináptica normal para recuperarse. Anteriormente, la salud muscular se verificó en un subconjunto de los músculos usados ​​en esta preparación mediante la determinación de que la máxima tetánica contractile fuerza generada por los músculos es similar a la reportada por otros al principio y al final del experimento ^15.

Aferentes del huso muscular funcionalmente se identificaron en esta preparación mediante la búsqueda de una pausa en la característica de disparo en respuesta a la contracción de contracción (Figura 2), así como los aumentos instantáneos de frecuencia esperados en respuesta a cambios de longitud (Figura 3). En nuestra experiencia, la mayoría de los aferentes que disparan en condiciones de control son aferentes del huso muscular. La longitud del nervio retenido en esta preparación (~ 7 mm máximo) no es lo suficientemente largo para utilizar aferentes diferencias de velocidad de conducción para identificar subtipos de aferentes del músculo ^13. Además, a diferencia de en los gatos y seres humanos, las medidas de sensibilidad dinámica no fueron capaces de diferenciar claramente Grupo Ia y II aferentes en ratones (para mayor discusión ver Wilkinson et al. ^15). Otros subtipos de aferentes (es decir., Grupo III y IV) se pueden identificar mediante pruebas funcionales adicionales en esta preparación, por ejemplo mediante la adición de sustancias como la capsaicina, ATP, o la bradiquinina, la disminución del pH del baño, exponiendo el músculo a la isquemia, etc ^3,13,21-23 El uso de electrodos de succión permite la actividad de múltiples neuronas sensoriales a grabar a la vez, lo que aumenta la cantidad de datos que pueden ser recogidos a partir de un solo músculo. Esta preparación se puede utilizar para medir el efecto global de una perturbación en las respuestas de población de las neuronas sensoriales o de las respuestas de los aferentes identificados. Si las formas de pico son lo suficientemente único, hasta 4 neuronas sensoriales pueden ser discriminados por software (tanto Spike2 (Cambridge Electronic Design) y LabChart Pro (AD Instruments) han realizado de manera similar). En los casos en que las neuronas no pueden ser discriminados, los cambios en la colocación de los electrodos o diámetro de la punta fácilmente se pueden implementar.

En resumen, el ratón músculo-nervio en prepar vitroación es un enfoque experimental sencillo que se puede utilizar para investigar las propiedades de respuesta de los aferentes sensoriales musculares a varios modelos de perturbaciones, lesiones y enfermedades fisicoquímicas. Además, esta preparación es ideal para tomar ventaja de las poderosas herramientas genéticas disponibles en ratones, incluso los animales transgénicos y herramientas optogenética.

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.