Изображений биологических тканей десорбцией Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Десорбции с ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (DESI-МС) является внешним метод, по которому образцы, в том числе биологических тканей, могут быть отображены с минимальной подготовки образца. По растеризации примере ниже ионизационного электрода, этот спрей на основе техники обеспечивает достаточное пространственное разрешение различить молекулярных особенностей интересов в срезах тканей.

Масс-спектрометрия томография (MSI) предоставляет нецелевые молекулярную информацию с наибольшей специфичностью и пространственное разрешение для исследования биологических тканей в нескольких сотен до десятков микрон масштабе. Когда выполнено в условиях окружающей среды, пробоподготовки становится ненужным, тем самым упрощая протокол, сохраняя при этом высокое качество полученной информации. Десорбции с ионизацией электрораспылением (DESI) представляет собой спрей на основе окружающей техника MSI, который позволяет для прямой выборки поверхностей на открытом воздухе, даже в естественных условиях. При использовании с программным управлением предметный столик, образец развернут под ионизационным DESI, так и через временную область, м / е информации коррелирует с пространственным распределением химических веществ. Точности DESI-MSI выход зависит от ориентации источника и позиционирование по отношению к поверхности образца и впускной масс-спектрометра. Здесь мы рассмотрим, как подготовить срезов тканей для DESI яmaging и дополнительные экспериментальные условия, которые непосредственно влияют на качество изображения. В частности, мы опишем протокол для визуализации срезы головного мозга крыс ткани DESI-MSI.

Нецелевые изображений методом масс-спектрометрии облегчает получение информации о химических веществах для открытия и гипотезы генерирующих приложений. Целевые изображений известных химических интерес, с другой стороны, может способствовать увеличению чувствительности и селективности с помощью конкретных разработка метода. Масс-спектрометрия томография (MSI) является наиболее часто выполняемой на тканей с использованием MALDI, ¹ вторичной ионной масс-спектрометрии (ВИМС), ² и окружающих методы ионизации, в том числе десорбции электрораспыления ионизации (DESI), ^{3-лазерной} абляции электрораспыления ионизации ^{(LAESI), 4, 5} и жидких микро-стык поверхности пробоотборника (LMJ-SSP). ⁶ В MALDI и SIMS, образцы должны быть физически удалена из образца, должны быть плоскими и тонкими, поскольку они анализируются под высоким вакуумом. MALDI требуется покрытие образца с поглощающей излучение матрицы, добавление дополнительного и громоздким шаг подготовки образца. SIMSимеет самую высокую боковую разрешение, но бомбардировки высокоэнергетическими частицами вызывает обширные молекулярной фрагментации. Таким образом, MSI окружающим методы заполнить нишу, где мягкие анализа с минимальной подготовкой образца является желательным. Тем не менее, на сегодняшний день все методы по-прежнему ограничена требованием плоских поверхностей образца.

DESI использует помощь пневматическим распылением растворителя взимается направлены на поверхности образца для десорбции и ионизации анализируемых веществ. ⁷ рабочей моделью для последующей десорбции и ионизации DESI известен как "капли пикап модели». ^8-10 заряженных первичных капель производится DESI зонд сталкиваются с поверхностью, смачивающие его и образуя тонкую пленку, в которой анализируемое вещество растворяется твердой и жидкой микроэкстракция механизм ⁸ Последующие капли столкновения приводят к передаче импульса и взлет вторичных капель, содержащий материал, извлеченный из поверхности . ^9,10 В конечном счете, газфаза ионов, как полагают, производится через ESI-подобных процессов после ионного испарения, модели заряд остаток или других моделях, ¹¹ однако точный процесс формирования иона в DESI до сих пор не экспериментально проверенные. ¹² DESI чувствительность сильно зависит от растворимости анализируемого вещества в распылительной растворителе, как десорбции зависит от локализованного микроэкстракция ^13.

При использовании с программным управлением предметный столик, образец сканируется однонаправленно с полосы активизации под ионизационным DESI, так и через временную область, м / е информации коррелирует с пространственным распределением видов химических веществ "(Рис. 1). С первых доказательство принципа DESI-эксперимент MSI сообщила Ван Беркель и Kertesz в 2006 году, ¹⁴ техники заметно повзрослела, ¹⁵ с приложениями сообщили в анализе липидов, ^3,16 метаболитов наркотиков, ^17,18 Diseaсебе биомаркеров, ¹⁹ ткани головного мозга, ^3,18,20 легочной ткани, ткани почек ^{18, 18} ткани яичка, ¹⁸ надпочечники, ¹⁷ тонких пластин хроматографии, ²¹ и водорослей поверхностей. ²² рутина разрешение изображений, полученных DESI-MSI представляет 100-200 мкм, что в конечном счете определяется эффективная площадь поверхности извлекается посредством распыления, но резолюции по цене от 40 мкм не поступало. ^23-25 ​​такое разрешение, и удобства анализа делает DESI-MSI подходит для быстрого и простого анализа биологических образцов ткани с площадью поверхности в 0,5-5 см ² диапазона, что позволяет получение ценных пространственную информацию для лучшего понимания биологических процессов ^26. Здесь, в качестве примера типичного DESI MSI-приложение, мы рассмотрим процедурные детали успешного проведения эксперимента с участием визуализации липидов в тканях мозга крыс. Двумя наиболее важными шагами в Протоколеподготовки ткани ²⁷ и DESI источник ионов оптимизации, как описано ниже.

1. Ткань Секционирование

1. Магазин флэш цельной тушки ткани в -80 ° C морозильнике до готовности для секционирования.
2. Разрешить образца ткани, чтобы достичь температуры в криомикротомии до срезов (30 мин). Установите лезвие и температуры образца до -30 ° С.
3. Как только ткань достигла температуры, обработка образца с помощью пинцета, вырезать передней или задней части мозга в зависимости от того, какая часть мозга представляет интерес для достаточной монтажной поверхности (например, если в передней части мозга имеет первостепенное значение, установите заднюю часть мозга клещевые).
   1. Применить ~ 0,5 мл Оптимальное соединение сокращающейся температуры (OCT, Tissue-Tek, Сакура) Чаку в центре и, используя пинцет, для образцов на месте в ОСТ, пока она не затвердеет. После ОКТ полностью заморожены, гора патрон в держатель образца.
   2. Минимальное количество октября используется для установки образца предпочтительнее (в отличие от монтажной образца в блоке октября как это обычно делается в других историковлогической процедуры) для минимизации загрязнения образца. Загрязнение образца по ОСТ вредно для DESI и визуализации процесса за счет ион подавления.
4. Типичные срезы ткани необходимы для диапазона MS изображений от 12-18 мкм в толщину. Раздел тканей на желаемой толщины в пределах рекомендуемого диапазона. Тай-секционного монтажа каждой ткани, слегка касаясь комнатной температуре стекло микроскопа скользят по разделу. После того, как образец установлен, будьте осторожны и не прикасайтесь к срез ткани, как это изменит распределение химических и композиций.

Примечание: Мы рекомендуем монтаж двух секций на слайд, используя одну секцию для оптимизации, а другой для работы с изображениями. Если части не являются для немедленной визуализации, хранения слайдов в -80 ° C морозильнике в режиме слайд-коробки до готовности для анализа.

5. Если в результате анализа хранятся разделов, удалить слайд из морозильной камеры, немедленно передать в вакуум-эксикаторе, и позволить ~ 15-20мин таять. Оставив образца в эксикаторе больше будет сухой образец и уменьшить DESI эффективности. Оптимизация источник ионов DESI будет сделано с образца ткани как только она оттаяла, однако, в целях экономии времени, период, в течение которого образец оттаивания служит идеальное время для инициализации оборудования.
   1. Использование ацетонитрила с 1% уксусной кислоты в качестве растворителя DESI, включить шприцевой насос со скоростью потока 5 мкл / мин. Ниже скорости потока приведет к снижению бокового удара пятно распыления DESI и эффективно Размер пикселя, но с большей скоростью потока может быть необходимо для достаточной чувствительностью. Таким образом, скорость потока (обычно 1-5 мкл / мин) должна быть оптимизирована для каждого приложения и желаемого чувствительность и разрешающую способность. Убедитесь, что шприц содержит достаточно растворителя для полной оптимизации и обработки изображений при заданной скорости потока.
   2. Как только появляется растворителя капает из источника наконечник, следует повернуть на азоте распыления газа с давленЕ 160 фунтов на квадратный дюйм.
   3. Включите высоковольтный источник питания подключен к ионным источником применения 3600 В.
6. Монтаж салазок на движение стадии и начать ионного источника и MS оптимизации

2. Оптимизация DESI

1. DESI система состоит из источника зонд (см. Рисунок 2), шприц и насос или альтернативные системы доставки растворителя, сжатый азот, этап перевода образца и горе. Продолжайте DESI оптимизации источника раз масс-спектрометра была настроена для соответствующего диапазона массы и интерес аналитов.
   1. Если исходные компоненты не были включены еще приведено в разделах, 1.5.1-3 направлениях.
   2. Переменных обсуждается в этих разделах рекомендуется для визуализации биологических тканей. Однако эти переменные должны быть оптимизированы для разных типов ткани или образца. Альтернативные растворители, расхода, давления распыления газа и напряжения были зарегистрированы для воображениянг биологических тканей. ^16-18
2. Убедитесь, что первоначально DESI источник не касается предметного стекла, а не попадала на какие-либо части среза ткани. Это будет гарантировать, что зонд не поврежден на первоначальном этапе процесса оптимизации и не загрязняет любую часть созданного вступления в контакт с образца ткани.
   1. Хорошей начальной позиции с наконечником 3 мм от поверхности образца и 5 мм от MS капиллярного входе, при этом зонд под углом 55 ° по отношению к поверхности образца. Внутренняя капилляр DESI зонда должна распространяться ~ 1 мм за пределы внешнего капилляра. Все эти параметры будут оптимизированы.
3. Интерфейс MS капиллярная трубка должна иметь коллекцию угол ~ 15 ° по отношению к поверхности образца для оптимальной передачи ионов. Регулировка этап высоты, так что MS капиллярного нависает над поверхностью образца; капиллярной должно быть <1 мм от поверхности, как можно ближене касаясь.
4. Выравнивание DESI зонд в измерении х по отношению к MS капиллярного входе так, что они непосредственно в линию.
5. Регулировка у и г положениях DESI источник для оптимальной чувствительности с помощью дополнительной секции ткани. Следует отметить, что, как DESI зонд направлено на одной площади образца, при этом он постепенно десорбции и ионизации всех аналитов в этой области, и сигнал будет постепенно уменьшаться, как это происходит. Выполнение этого этапа как можно быстрее, имеет важное значение.
   1. Таким образом, на протяжении всего процесса оптимизации, образец должен быть перемещен под распылительной головки, чтобы свежий образец анализируемой и что любые изменения сигнала связаны с источником оптимизации, не образец истощение. Однако, учитывая, что разнообразный химический состав различных регионах ткани, прямое сравнение интенсивность ионов по всему поперечному ткани не вполне точным. Таламуса головного мозга обеспечивает разумно крупногабаритных области сболее последовательно химического состава, но все еще не полностью однородным. Кроме того, маркировка красного Шарпи, которая содержит красителей родамина 6G ([М] ^+, м / е 443), на предметное стекло от образца дает сильный ответ на MS DESI, а также может быть использована для оптимизации, но учитывая различные формы образцов и анализируемого, эти условия могут по-прежнему не коррелируют с идеальные настройки для биологических тканей.
   2. Рекомендуемое расстояние между Y наконечник источника и капиллярных Вход: ~ 4 мм, рекомендуется Z расстояние между зондом и поверхностью образца: ~ 1,5 мм. Хотя эти параметры будут немного отличаться для каждой экспериментальной установки.
   3. С учетом геометрии и угол зонда, учитывать, что у и г-измерение положения являются взаимосвязанными в отношении эффективной передачи растворителей и содержащих анализируемое вещество капель. Изменение одной переменной потребует последующей модификации в другую для поддержания той же позиции воздействия распыления иего углы передачи.
6. Отрегулируйте расстояние внутреннюю капиллярную выдавливает из внешней капиллярной источника для максимальной чувствительности, и минимальный размер пятна воздействия. Внимание: Убедитесь, что высокое напряжение отключается, но такой настройки.
7. Источник геометрия будет считать оптимальной, когда максимальный сигнал наблюдается.
   1. Переменные оптимизированы в разделах 2.5-2.6 являются взаимосвязанными, поэтому корректировка одного будут по своей природе требуют повторной регулировки других для поддержания необходимого исходного образца входной геометрии или регулировки условий описано в разделе 1.5.1, 3.
8. Кроме того, нагревательный элемент, связанных с передачей капиллярный в масс-спектрометр может улучшить чувствительность путем облегчения десольватация заряженных аналита капель производится в процессе ионизации. Здесь мы используем веревку спиральный нагреватель вокруг передачи капилляр установлен на 100 ° C.

3. Тканьэлектронной изображений

1. Во время процесса формирования изображения, предметный столик перемещает образец под зондом DESI и MS впускной капиллярного и все другие компоненты остаются неподвижными. Параметров движения сцены должны быть выбраны на основе DESI влияние размер факела и оптимальную чувствительность.
   1. Большее влияние шлейф приведет к более высокой ионной интенсивности, при условии, что более образец десорбирующихся, однако для работы с изображениями, он будет также привести к увеличению размера пикселя и, таким образом хуже разрешение изображения.
2. Перевод этап, используемые в этом эксперименте домашнего построен и управляется программой, LabView, что позволяет контролировать скорость растеризации и межстрочный интервал для изображения заданных размеров. Ступень регулирования движения В. И., используемые в данном эксперименте можно получить на omnispect.bme.gatech.edu. Кроме того, имеющиеся в продаже источник DESI и стадии могут быть использованы такие как автоматизированная 2D Omni Спрей источник Prosolia Инк (Индианаполис, Индиана США).
   1. Для тканей мозгатипичный размер 10 х 15 мм, и с учетом стадии движения параметров, используемых, изображение займет около 3 часов.
      1. Программа ВП LabVIEW или эквивалентный управления Программное обеспечение для визуализации желаемых условиях, используя скорость этапе сканирования 80 мкм / сек, а интервал между рядами 200 мкм. При использовании источника Omni спрей, движения должны быть установлены параметры для сканирования скорость 100-200 мкм / сек и межстрочный интервал 200 мкм. Заметим, что эти параметры движения могут быть изменены в зависимости от количества желаемого пикселей в каждом измерении чувствительности и необходимо.
         1. Меньше межстрочный интервал была показана для улучшения качества изображения, с скорость сканирования имеющих меньшее влияние. ²⁵ Тем не менее, важно отметить, что это не обязательно указывает и улучшенное разрешение изображений, так как это сильно зависит от места воздействия размера. Медленной скорости сканирования и меньший межстрочный интервал позволит значительно увеличить время анализа и поэтому должны быть оптимизет для каждого типа ткани или образца.
      2. С помощью МС спектральными приобретение установлена ​​на 1 сканирования / сек, а изображение создается как один пиксель / сканирования, стадия скорости определяет размер пиксела в измерении х, тогда как интервал определяет размер пиксела в измерении у. Хотя истинный размер пикселя изображения больше, чем это из-за распыления распространяется, более медленное движение позволяет больше времени для десорбции и обнаружения аналитов.
   2. Дайте путь к каталогу и имя файла для координат и времени файлов, которые будут записаны во время изображения в пределах ВП LabVIEW.
3. В рамках подготовки к масс-спектрального сбора данных, рассчитать общее время, необходимое для работы с изображениями. Программа Labview используется нашей группы автоматически обеспечивает это значение, но если альтернативный контроль ступень используется, этот расчет является необходимым для настройки MS сбора данных.
   1. При использовании автоматизированных Omni Спрей источника и стадии каждая строка изображения приобретается, как и виндивидуальные работает. Время на строке и количество строк, необходимых для заданных размеров изображений рассчитываются с использованием управления Omni Спрей программного обеспечения для ввода в массе программного обеспечения спектрометра.
4. Убедитесь, что сканирование масс-спектрометре скорость 1 спектр / сек, а также установить время приобретения инструмента, чтобы соответствовать общему времени рассчитывается.
   1. Набор спектральных скорость сканирования до 1 спектр / с.
   2. Получать данные в режиме профилирования и убедитесь, что м / з диапазон подходящих для данного вида интересов. Помните, что DESI также производит многозарядных аналитов, как и в ESI.
   3. Установить время измерения на соответствие общее время изображение дается LabView.
5. Установить место воздействия распыления в верхнем левом углу области для включения в образ.
6. Начать сбор данных MS и стадии движения одновременно.
7. После завершения сбора данных, вернуть масс-спектрометр в режим ожидания.
8. Выключите высокое напряжение DESI источника.
9. Поверните Oдалее азота.
10. Выключите шприцевой насос.

4. Обработка изображений

1. Масс-спектральные данные, в сочетании с время стадии и положение данных, сохраненных в виде текстовых файлов через LabView должны быть "сложены" в 2D изображение корреляции координат пикселов с соответствующими спектрами. Изображения, представленные здесь, были обработаны с использованием Matlab-программное обеспечение, которое находится в свободном доступе по адресу: omnispect.bme.gatech.edu. Если данные были получены с помощью источника Omni спрей, преобразование Firefly данных программное обеспечение используется для создания куба данных для визуализации изображения в BioMAP (www.maldi-msi.org).
2. Для данных, полученных на масс-спектрометре Jeol AccuTOF, записанные хроматограмме должны быть экспортированы в. Формат ПВ для дальнейшего анализа.
   1. Использование DataManager в MassCenter, необходимо сначала преобразовать полученные данные в centroided данных (Инструменты → Преобразование данных в Acquistion Centroid). Тогда экспортировать данные в. Формате CDF с помощью сочетания клавиш Ctrl + Shift + E следутанционного Инструменты → Экспорт.
3. Добавить сырой. CDF данные масс-спектрометрии и два текстовых файла, положение и время, OmniSpect сайта. Firefly-обработанные данные изображения могут быть визуализированы в BioMAP.
   1. Дальнейшая обработка данных, включая статистический анализ по неотрицательная матрица Факторизация или построение одного иона интереса может осуществляться непосредственно на сайте.
   2. Кроме того, сырые куба данные могут быть экспортированы для анализа в MATLAB.

3 показан спектр, полученный представитель из необработанной секции мозга крысы. В положительном режиме, масс-спектр преобладают фосфатидилхолины из-за их высокой эффективности ионизации (отнести к положительно заряженным группу четвертичного аммония). Общее изображение ион среза ткани также показано на фиг.3, показывающий обильный сигнала по всему поперечному мозга. Ключевые обнаружены липиды, приводятся в таблице 1 по литературе сравнений.

Пространственное распределение Например липидов (рис. 4) показывают, как относительное изобилие различных видов фосфатидилхолина колеблется от серого и белого вещества головного мозга. Например, [34:1 PC + K] ^+, м / е 798,5364, показывает повышение интенсивности в коре мозжечка (серое вещество), в то время как [PC 36:1 + K] ^+, м / е 826,5558, показывает повышение интенсивности в мозжечковой ножки (бееTE имеет значения). Составного изображения, полученные для двух ионов (рис. 4в) подчеркивает контраст в липидном распределение по срез ткани. Пространственного распределения других ключевых липидов в головном мозге, также перечислены в таблице 1. Эти распределения согласуются с предыдущими исследованиями. ^28-30

Рисунок 1. Схема DESI-MSI процесса формирования изображения. DESI () используется для анализа поверхности тканей, и, когда образец развернут в контролируемой движения (б) ниже источника, масс-спектральные данные, интенсивность против м / з (с ), как функцию времени (г) приобретена. Затем эти данные коррелируют через временной области с помощью параметров движения с образованием химической изображение(Е). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Схема DESI источника.

Рисунок 3. Средний цельной ткани спектра с более обильными м / з значения помечены (а) и общее изображение иона (б), приобретенных DESI-MSI в режиме положительных ионов.

Рисунок 4. Выбранный ионных изображений ключ фосфохолинов в ткани головного мозга крысы, приобретенных DESI-MSI в режиме положительных ионов, (а) [PC 34:1 + K] ^+, м / е 798,5364, (б) [PC 36:1 + K] ⁺ , м / Z 826.5558, (в) составное изображение м / Z 798, синий, и 826, красный.

Таблица 1. Основные идентичности липидов и локализации в мозге разделе.

Оптимизации геометрии источника DESI имеет решающее значение для успешных экспериментов MSI. Несколько переменных способствует выравнивание системы непосредственно влияют на чувствительность и разрешение изображения. Если в процессе оптимизации, экспериментатор имеет трудности с получением сигнала, мы рекомендуем использовать красное пятно Sharpie обращено на слайде в качестве ориентира; краситель, родамина 6G, м / Z 443, что дает сильный сигнал в режиме положительных ионов и может быть использован для Первичная оптимизация сайта. Кроме того, выбор растворителя для DESI имеет решающее значение для чувствительностью, как передача аналита и ионизации зависит от экстракции анализируемого вещества с поверхности в тонкую пленку, сформированную. ¹³ Многие ионизацией электрораспылением совместимые растворители и смеси могут быть использованы для оказания помощи в десольватация и процесс ионизации в зависимости от класса интерес соединения в процессе анализа.

Как упоминалось ранее, разрешение DESI-МС изображение депеNDS в первую очередь от источника геометрии. Разрешение изображения порядка 200 мкм регулярно получены DESI-MSI, хотя это выше, чем на основе лазера и / или в вакууме методов визуализации, которые могут варьироваться от ~ 10-150 мкм. ^5,31 Разрешение выше, чем 40 мкм Сообщалось использованием DESI, ²⁴ однако, 200 мкм для текущего изображения достаточна для анализа больших биологических срезов тканей. Качество внутренней плавленого кварца капилляр DESI источник также будет влиять на качество изображения и разрешение. Рекомендуемый внутренний диаметр капилляра 50 мкм, так как крупные капилляры ID производить большие спреи и больше разрешение изображения. ²⁵ Если это капилляр не вырезано прямо или треснула, спрей не будет иметь коническую форму в результате неправильной формы воздействия месте, бедных- качество и невоспроизводимых изображений.

Мало того, что исходная геометрия на разрешение влияет DESI-MSI, он также играет важную роль в чувствительностиметода. Таким образом, геометрия должна быть оптимизирована и поддерживали в течение всей процедуры. Если образец не является плоским, или не установлен совершенно горизонтально, исходная геометрия изменится, тем самым изменяя ответа и создания артефактов на изображении. DESI Хотя ^23-MSI ограничена плоскими образцами, 3D визуализации биологических тканей производится возможно через 2D визуализации серийных срезов ткани, которые затем укладываются в трехмерном изображении. ³² Этот подход может быть также использован для других методов MSI, в том числе SIMS, MALDI, LAESI и т.д. ³³ Трехмерные изображения масс-спектрометрии может быть также созданный постепенное удаление слоев материала с помощью лазерного импульса, например, и изменение образа ^34.

Положительный анализ режима тканей мозга крыс облегчает успешную детальную съемку фосфатидилхолины и некоторые лекарственные препараты и метаболитов. ¹⁸ В дополнение к этому анализу, работы с изображениями в Negativэлектронной режим производит спектр с большим разнообразием классов липидов, ^28,35 и может быть использовано, чтобы обеспечить полный анализ срезов ткани. В случаях, когда более чем одного вида липидов могут быть отнесены к конкретному м / з значение, тандемной масс-спектрометрии может быть использован для идентификации. Тандемной масс-спектрометрии также служит в качестве дополнительного метода липидов подтверждения личности ^35.

Окружающие масс-спектрометрии изображений по DESI было показано, чтобы быть эффективным в визуализации липидного вида в ткани мозга крыс. Информация, полученная в экспериментах MSI может дать представление о заболеваниях, связанных с измененными уровнями фосфолипидов, таких как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, и диабет, и другие. ^36-38 Учитывая высокую численность липидов и их роль в биологических процессах, многие биологические системы существуют которые выиграют от информации, полученной с помощью масс-спектрометрии изображений. Со многими потенциальными методамиизображения биологических образцов с использованием масс-спектрометрии, окружающего методы ионизации, DESI в частности, обеспечить средства для этого с пониженной пробоподготовки и значительно облегчает его анализа.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа поддержана NSF ARRA МРТ Инструмента развития грант № 0923179 на ССЛ. Мы благодарим Аква Asberry, координатор Лаборатории H. Parker Petit Института биоинженерии и биологических наук Основные гистология, за помощь в срезов ткани.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet