Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Desorption Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (DESI-MS) ist eine Methode, mit der Umgebungsluft Proben, einschließlich biologischen Geweben, mit minimaler Probenvorbereitung abgebildet werden kann. Durch Rastern der Probe unterhalb der Ionisationselektrode, bietet dieses Spray-basierte Technik ausreichender räumlicher Auflösung auf molekularen Eigenschaften von Interesse in Gewebeschnitten zu erkennen.

Massenspektrometrie Imaging (MSI) bietet ungezielte molekularen Informationen mit der höchsten Spezifität und räumlicher Auflösung für die Untersuchung von biologischen Geweben zu den hundert bis zehn Mikrometer-Skala. Wenn unter Umgebungsbedingungen durchgeführt wird Probe Vorbehandlung überflüssig und vereinfacht damit das Protokoll unter Beibehaltung der hohen Qualität der erhaltenen Informationen. Desorption Elektrospray-Ionisation (DESI) ist ein Spray auf Umgebungstemperatur MSI Technik, die für die direkte Entnahme von Oberflächen im Freien, auch in vivo ermöglicht. In Verbindung mit einem Software-gesteuerten Probentisch verwendet, wird die Probe unter der DESI Ionisationselektrode gerastert und in den Zeitbereich, m / z Informationen mit der chemischen Spezies räumliche Verteilung korreliert. Die Genauigkeit der DESI-MSI Ausgang hängt von der Quelle Ausrichtung und Positionierung in Bezug auf die Probenoberfläche und Massenspektrometer Einlass. Hier prüfen wir, wie man Gewebeschnitte für DESI vorzubereiten imaging und zusätzlichen experimentellen Bedingungen, die direkt auf die Bildqualität. Insbesondere beschreiben wir das Protokoll für die Bildgebung von Rattenhirn Gewebeschnitten durch DESI-MSI.

Untargeted Bildgebung mittels Massenspektrometrie ermöglicht die Übernahme von chemischen Informationen für die Entdeckung und Hypothesen-generierenden Anwendungen. Gezielte Bildgebung eines bekannten chemischen von Interesse auf der anderen Seite kann eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität durch spezifische Verfahren Entwicklung zu erleichtern. Massenspektrometrie Imaging (MSI) wird am häufigsten auf Gewebe mit MALDI, ¹ Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), ² und Umgebungstemperatur Ionisation Techniken, einschließlich Desorption Elektrospray-Ionisation (DESI), ³ Laserablation-Elektrospray-Ionisation (LAESI), ^{4 durchgeführt, 5} und flüssigen Mikro-junction-Oberfläche Probenahmesonde (LMJ-SSP). ⁶ In MALDI und SIMS, müssen die Proben physikalisch aus der Probe entfernt werden, und müssen flach und dünn, wie sie im Hochvakuum analysiert. MALDI erfordert Beschichtung der Probe mit einer Strahlung absorbierenden Matrix, das Hinzufügen einer zusätzlichen und umständlich Schritt zur Probenvorbereitung. SIMShat die höchste laterale Auflösung, aber Beschuss mit hochenergetischen Teilchen verursacht umfangreiche molekulare Fragmentierung. Deshalb füllen MSI durch Umgebungslicht Methoden eine Nische, wo weiche Analyse mit minimaler Probenvorbereitung ist wünschenswert. Doch bis heute werden alle Methoden noch durch das Erfordernis der flachen Probe Flächen begrenzt.

DESI verwendet eine pneumatisch unterstützte aufgeladen Lösungsmittel Spray an der Probenoberfläche gerichtet zu desorbieren und zu ionisieren Analyten. ⁷ Das Arbeitsmodell für die Desorption und anschließende Ionisation durch DESI als "Tropfen Pick-up-Modell" bekannt ist. ^8-10 Die geladenen primären Tröpfchen hergestellt von der DESI Sonde mit der Oberfläche kollidiert, Benetzung und Ausbildung einer Dünnschicht, in die der Analyt durch eine Fest-Flüssig-microextraction Mechanismus ⁸ Nachfolgende Tröpfchenkollisionen ergeben Impulsübertragung und Start des zweiten Tröpfchen, die das Material von der Oberfläche entnommen wird aufgelöst . ^9,10 Letztlich GasPhase Ionen sind vermutlich durch ESI Fortsätze nach dem Ionenverdampfung, Ladung Rückstand Modelle oder andere Modelle, ¹¹ hergestellt werden, wobei der genaue Ionenbildung Verfahren DESI erst noch zu experimentell bewiesen. ¹² DESI Empfindlichkeit ist stark abhängig von der Löslichkeit der Analyt in dem Solvens, wie Desorption beruht auf der lokalisierten microextraction. ¹³

In Verbindung mit einem Software-gesteuerten Probentisch verwendet, wird die Probe mit unidirektional Spur Schrittmotors unter der DESI Ionisationselektrode abgetastet und durch den Zeitbereich, m / z Informationen mit der chemischen Spezies räumliche Verteilung (Fig. 1) korreliert. Seit dem ersten proof of principle DESI-MSI Experiment von Van Berkel und Kertesz im Jahr 2006 berichtet, hat ¹⁴ die Technik deutlich gereift ¹⁵ mit gemeldeten Anwendungen in der Analyse von Lipiden, ^3,16 Drogenmetaboliten ^17,18 disease Biomarker, ¹⁹ Hirngewebe, ^3,18,20 Lungengewebe, ¹⁸ Nierengewebe, ¹⁸ Hodengewebe, ¹⁸ Nebennieren, ¹⁷ Dünnschichtchromatographieplatten, ²¹ und Algen Oberflächen. ^22. Die Routine Auflösung von Bildern von DESI-MSI erhaltene 100-200 um, die letztlich durch die wirksame Fläche durch das Spray extrahiert wird bestimmt, sondern Auflösungen so niedrig wie 40 um berichtet worden. ^23-25 ​​Solche Auflösung und einfache Analyse macht DESI-MSI geeignet für die schnelle und einfache Analyse von biologischen Gewebeproben mit Oberflächen im Bereich 0,5-5 cm ^2, so dass der Erwerb von wertvollen Geodaten besser zu verstehen biologischen Prozessen ^26. Hier wird als ein Beispiel für eine typische DESI-MSI-Anwendung, überprüfen wir die Einzelheiten des Verfahrens für die Durchführung einer erfolgreichen Experiment mit bildgebenden von Lipiden im Rattenhirn Gewebe. Die beiden wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind dieGewebepräparation ²⁷ und DESI Optimierung der Ionenquelle, wie unten beschrieben.

1. Tissue Schnitte

1. Shop-Flash-gefroren, ganz Gewebe in -80 ° C Gefrierschrank bis bereit zum Schneiden.
2. Lassen Sie die Gewebeprobe, um die Temperatur in der Kryomikrotom erreichen, bevor Schneiden (30 min). Legen Sie die Klinge und Probentemperatur bis -30 ° C.
3. Sobald Gewebe hat die Temperatur erreicht, die Handhabung der Probe mit einer Pinzette, geschnittene Vorder-oder Rückseite des Gehirns je nachdem, welcher Teil des Gehirns ist von Interesse für eine ausreichende Montagefläche (dh wenn die Vorderseite des Gehirns ist von primärer Bedeutung, montieren Rückseite des Gehirns auf Chuck).
   1. Bewerben ~ 0,5 ml Optimal Cutting Temperatur Compound (OCT, Tissue-Tek, Sakura) um Futter in der Mitte und mit einer Pinzette, halten Probe an Ort und Stelle in OCT bis sie erstarrt. Sobald Oktober ist komplett eingefroren, Mount Futter in Probenhalter.
   2. Eine minimale Menge der OCT verwendet, um die Probe zu montieren ist bevorzugt (im Gegensatz zur Befestigung der Probe in einem Block der OCT wie allgemein in anderen histo getanlogische Verfahren), um die Verunreinigung der Probe zu minimieren. Kontamination der Probe durch OCT ist schädlich für die DESI-und Imaging-Verfahren aufgrund Ionensuppression.
4. Typische Gewebeschnitten, die für MS Imaging Bereich von 12-18 &mgr; m Dicke. § Gewebe an gewünschten Dicke innerhalb des empfohlenen Bereichs. Auftauen-mounten Sie jede geschnittene Gewebe durch leichtes Berühren eines Raumtemperatur-Mikroskop Objektträger über den Abschnitt. Sobald eine Probe montiert ist, seien Sie vorsichtig nicht, um das Gewebe Abschnitt berühren, wie es die chemischen Zusammensetzungen Ausschüttungen und wird sich ändern.

Hinweis: Wir empfehlen die Montage von zwei Sektionen pro Folie, mit einem Abschnitt für die Optimierung und die andere für die Bildgebung. Sofern Teile sind nicht für den sofortigen Imaging, Speicher Folien in -80 ° C Gefrierschrank in einer Dia-Box bis zur Analyse bereit.

5. Bei der Analyse gespeichert Abschnitte, entfernen Rutsche aus dem Gefrierschrank, sofort Vakuumexsiccator übertragen und erlauben ~ 15-20min zu tauen. Verlassen der Probe im Exsikkator länger trocknet die Probe und reduzieren DESI Effizienz. Die Optimierung der DESI-Ionenquelle mit der Gewebeprobe wird geschehen soll, wenn aufgetaut wurde jedoch im Interesse der Zeit dient die Zeitspanne, während der die Probe Auftauen als ideale Zeit für die Initialisierung des Gerätes.
   1. Verwendung von Acetonitril mit 1% Essigsäure als Lösungsmittel DESI auf der Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 5 ml / min drehen. Eine geringere Fließgeschwindigkeit verringert sich die Auswirkungen vor Ort Seite der DESI-Spray und effektive Pixelgröße, aber eine höhere Fließgeschwindigkeit kann notwendig sein, für eine ausreichende Empfindlichkeit. Daher ist die Fließgeschwindigkeit (in der Regel 1-5 ml / min) sollte für jede Anwendung und der gewünschten Empfindlichkeit und Auflösung optimiert werden. Stellen Sie sicher, dass die Spritze genug Lösungsmittel für die komplette Optimierung und Bildgebung bei gegebenen Durchsatz enthält.
   2. Nachdem das Lösungsmittel erscheint tropft aus der Quelle Spitze, am Stickstoff Zerstäubergases drehen mit einem pressure von 160 psi.
   3. Schalten Sie die Hochspannungs-Stromversorgung verbunden Ionenquelle Anwendung 3.600 V.
6. Montieren Sie den Schieber auf der Bühne und Bewegung beginnen Ionenquelle und MS-Optimierung

2. DESI Optimization

1. Die DESI-System besteht aus einer Quelle Sonde (siehe Abbildung 2), eine Spritze und Pumpe oder alternative Lösungsmittel Delivery-System, komprimierten Stickstoff, Übersetzung Probertisch und montieren. Fahren Sie mit DESI Quelle Optimierung einmal das Massenspektrometer hat für die entsprechende Massenbereich und Analyten abgestimmt worden.
   1. Wenn die Source-Komponenten nicht auf noch nicht eingeschaltet, um Abschnitte 1.5.1-3 für Richtungen beziehen.
   2. Die Variablen in diesen Abschnitten sind für die Bildgebung von biologischen Geweben empfohlen. Allerdings sollten diese Variablen für verschiedene Arten von Gewebe oder Probe zu optimieren. Alternative Lösungsmittel, Strömungsgeschwindigkeiten, Zerstäubergases Drücke und Spannungen haben für Imagi gemeldetng von biologischen Geweben. ^16-18
2. Stellen Sie sicher, dass zunächst die DESI-Quelle wird nicht berühren die Glasplatte, und nicht in jedem Teil des Gewebes Abschnitt gerichtet. Dadurch wird sichergestellt, dass die Sonde nicht in der ersten Optimierung beschädigt und nicht kontaminieren Teil der Einrichtung durch den Kontakt mit der Gewebeprobe.
   1. Eine gute Ausgangsposition ist mit der Spitze 3 mm von der Probenoberfläche und 5 mm von der MS Kapillareinlass, mit der Sonde in einem Winkel von 55 ° in Bezug auf die Probenoberfläche. Die innere Kapillare des DESI Sonde sollte erstrecken ~ 1 mm über den äußeren Kapillare. Alle diese Parameter optimiert werden.
3. Die MS-Schnittstelle Kapillare sollte eine Sammlung Winkel von ca. 15 ° gegenüber der Oberfläche der Probe für eine optimale Übertragung von Ionen. Stellen Sie die Höhe der Bühne, so dass die MS Kapillare schwebt über der Oberfläche der Probe; die Kapillare sollte <1 mm von der Oberfläche, so nah wie möglichohne sie zu berühren.
4. Ausrichten DESI Sonde in der X-Dimension in bezug auf die MS Kapillareinlass so dass sie direkt in einer Linie sind.
5. Passen Sie die y-und z-Positionen der DESI Quelle für optimale Empfindlichkeit mit der zusätzlichen Gewebeschnitt. Beachten Sie, dass die DESI Fühler bei einer Probenfläche gerichtet ist, wird es schließlich zu desorbieren und zu ionisieren sämtliche Analyten in diesem Bereich und das Signal wird nach und nach abnehmen, wenn dies geschieht. Darstellende diesen Schritt so schnell wie möglich ist wichtig.
   1. Daher gesamten Optimierungsprozess, muss die Probe unter dem Sprühkopf bewegt werden, um sicherzustellen, dass frische Probe analysiert wird und dass alle Änderungen in Signal aufgrund Quelle Optimierung, nicht Probe Erschöpfung sind. Allerdings, wenn man bedenkt, dass die vielfältigen chemischen Zusammensetzung der verschiedenen Regionen des Gewebes, ein direkter Vergleich der Ionenintensität über den gesamten Gewebeschnitt nicht ganz genau. Der Thalamus des Gehirns bietet eine einigermaßen großformatigen Bereich mitkonsequenter chemische Zusammensetzung, aber noch nicht perfekt gleichmäßig. Alternativ kann eine Kennzeichnung der roten Sharpie, die den Farbstoff Rhodamin 6G enthält ([M] ^+, m / z 443), auf dem Objektträger von der Probe eine starke MS Reaktion DESI und kann auch für die Optimierung verwendet werden, aber Angesichts der unterschiedlichen Form und Probe Analyten können diese Bedingungen noch nicht zu einem idealen Aufbau für biologisches Gewebe korreliert.
   2. Empfohlene y Trennung zwischen Quelle Spitze und Kapillareinlass: ~ 4 mm, empfohlen z Trennung zwischen Spitze und Probenoberfläche: ~ 1,5 mm. Obwohl diese Parameter wird etwas anders für jede Versuchsanordnung.
   3. Unter Berücksichtigung der Geometrie und der Winkel der Sonde, zu berücksichtigen, dass die y-und z-Dimension Positionen miteinander verbunden in Bezug auf die effektive Übertragung von Lösungsmittel und Analyt-haltigen Tröpfchen sind zu nehmen. Eine Veränderung einer Variablen erfordert eine nachträgliche Änderung in der anderen, die gleiche Sprayaufprall Position zu halten undihre Übertragung Winkeln.
6. Stellen Sie den Abstand der inneren Kapillare extrudiert aus der äußeren Kapillare der Quelle für maximale Empfindlichkeit und minimale Auswirkungen Punktgröße. Achtung: Stellen Sie sicher, dass die hohe Spannung ausgeschaltet ist, während Sie diese Einstellung vornehmen.
7. Die Quelle Geometrie wird als optimal betrachtet werden, wenn das maximale Signal beobachtet wird.
   1. Die Variablen in den Abschnitten 2.5-2.6 optimiert sind miteinander verbunden, damit die Einstellung eines inhärent erfordern die Neujustierung des anderen, um den erforderlichen Source-sample-Einlaufgeometrie oder Anpassung der Bedingungen in Abschnitt 1.5.1 diskutiert pflegen- 3.
8. Zusätzlich kann ein Heizelement umgebenden Transferkapillare dem Massenspektrometer Empfindlichkeit durch Erleichterung Desolvatisierung der geladenen Analyten Tröpfchen während der Ionisation erzeugt verbessern. Hier verwenden wir ein Seil gewickelt Heizung rund um den Transfer-Kapillare auf 100 ° C.

3. Tissue Imaging

1. Während der Bildgebung, bewegt sich der Probenhalter die Probe unter der Sonde und DESI MS Einlasskapillare und alle anderen Komponenten stationär bleiben. Die Bewegung Parameter der Bühne sollte basierend auf DESI Auswirkungen plume Größe und optimale Empfindlichkeit gewählt werden.
   1. Eine größere Auswirkung plume wird in einer höheren Ionenintensität, da mehr Probe desorbiert führen, jedoch für die Bildgebung, wird es auch in einer größeren Pixelgröße und damit schlechter Bildauflösung führen.
2. Die Übersetzung der Bühne in diesem Experiment verwendet ist die Heimat gebaut und von einem LabView-Programm, das für die Kontrolle der Rasterung Geschwindigkeit und Zeilenabstand für ein Bild mit vorgegebenen Abmessungen ermöglicht. Die Bühne Motion Control VI in diesem Experiment verwendet wird, ist es bei omnispect.bme.gatech.edu. Alternativ könnte ein im Handel erhältliches DESI Quelle und Bühne wie die automatisierte 2D Omni Spray Quelle Prosolia Inc. (Indianapolis, IN USA) verwendet werden.
   1. Für Hirngewebe eintypische Bild Größe ist 10 x 15 mm, und in Anbetracht der Bühne Bewegung Parameter verwendet, wird das Bild dauert ca. 3 Stunden.
      1. Programmieren Sie die LabView VI oder gleichwertig Steuerungssoftware für die gewünschte Bildgebung Bedingungen, mit einer Bühne Scangeschwindigkeit von 80 um / sec und Zeilenabstand zwischen den Zeilen von 200 um. Bei Verwendung des Omni Spray Quelle sollte Fahrparameter einer Scangeschwindigkeit von 100-200 um / sec und einem Linienabstand von 200 um eingestellt werden. Beachten Sie, dass diese Bewegung Parameter geändert werden abhängig von der Anzahl der gewünschten Pixel in jeder Dimension und notwendige Empfindlichkeit werden.
         1. Ein kleinerer Zeilenabstand ist gezeigt worden, um die Bildqualität zu verbessern, mit der Scan-Geschwindigkeit mit weniger Einfluss. ²⁵ Allerdings ist es von Bedeutung ist zu beachten, dass diese nicht unbedingt auf und verbesserte Bildauflösung, wie das ist stark abhängig von Auswirkungen vor Ort Größe. Eine langsamere Scan-Geschwindigkeit und kleineren Zeilenabstand deutlich erhöhen wird die Zeit der Analyse und müssen deshalb optimiert werdenmiert auf jede Art von Gewebe oder Muster.
      2. Mit dem MS Spektrenerfassung auf 1 gesetzt scan / sec, und das Bild als 1 Pixel / Scan erstellt, definiert die Bühne Geschwindigkeit die Pixelgröße in der x-Dimension, während der Zeilenabstand bestimmt die Pixelgröße in y-Dimension. Obwohl die wahre Pixelgröße des Bildes größer ist als dieser aufgrund sprühen Ausbreitung ermöglicht langsamere Bewegung mehr Zeit für die Desorption und Detektion von Analyten.
   2. Geben Verzeichnispfad und Dateinamen für Position und Zeit Dateien, die bei Bildern im LabView VI aufgenommen werden.
3. In Vorbereitung für massenspektrometrische Datenerfassung, berechnen die Gesamtzeit für die Bildgebung erforderlich. Das Labview Programm von unserer Gruppe verwendet automatisch stellt diesen Wert, aber wenn alternativen Steuerung verwendet wird, ist diese Berechnung erforderlich, dass die MS Datenerfassung Einstellungen.
   1. Bei Verwendung eines Omni Spray automatisierten Quelle und Stufe wird jede Zeile des Bildes nach erworbeneinzelnen läuft. Die Zeit pro Zeile und die Anzahl der Zeilen, die für Given Imaging Dimensionen werden anhand der Omni Spray-Software eingegeben werden in das Massenspektrometer Software.
4. Stellen Sie sicher, dass das Massenspektrometer Scangeschwindigkeit 1 Spektrum / sec ist, und stellen Sie das Instrument Übernahme Zeit, um die gesamte Zeit berechnet übereinstimmen.
   1. Set spektralen Scan-Geschwindigkeit bis 1 Spektrum / sec.
   2. Daten erfassen in PROFIL-Modus und stellen Sie sicher, dass die m / z-Bereich für die jeweilige Art von Interesse ist. Beachten Sie, dass DESI produziert auch mehrfach geladene Analyten, wie in ESI.
   3. Set Akquisition Zeit zu Zeit durch Gesamtbild LabView angegebenen Anforderungen.
5. Positionieren Sie den Spray Auswirkungen Fleck in der linken oberen Bereich des abzubildenden.
6. Beginnen Erwerb von MS-Daten und Bühne Bewegung gleichzeitig.
7. Nach Abschluss der Datenerfassung, zurückzukehren Massenspektrometer Standby-Modus.
8. Schalten Sie Hochspannung von DESI Quelle.
9. Drehen off Stickstoffgas.
10. Schalten Sie Spritzenpumpe.

4. Bildverarbeitung

1. Massenspektrometrische Daten müssen in Kombination mit Phase Zeit und Positionsdaten als Textdateien gespeichert durch LabView "gefaltet" werden in ein 2D-Bild korreliert Koordinaten der Pixel mit der zugehörigen Spektren. Die hier präsentierten Bilder wurden unter Verwendung Matlab-basierte Software, die frei verfügbar ist: omnispect.bme.gatech.edu. Wenn die Daten erworben werden, mit der Omni Spray Quelle wird die Firefly Daten-Konvertierungs-Software verwendet, um die Daten-Cube für die Bild-Visualisierung in BioMAP (www.maldi-msi.org) erstellen.
2. Für die Daten der Jeol AccuTOF Massenspektrometer erworben, werden die aufgezeichneten Chromatogramm. CDF-Format zur weiteren Analyse exportiert werden.
   1. Mit der DataManager innerhalb MassCenter, zuerst konvertieren erfassten Daten an gebildetem Schwerpunkt Daten (Tools → Konvertieren Acquistion Daten an Centroid). Dann Export von Daten in. CDF-Format unter Verwendung der Tastenkombination Strg + Umschalt + E folgefolgt von Extras → Exportieren.
3. Laden Sie die roh. Cdf Massenspektraldaten und die beiden Textdateien, Position und Zeit, um die OmniSpect Website. Firefly-verarbeiteten Bilddaten visualisiert werden in BioMAP.
   1. Die weitere Verarbeitung der Daten inklusive statistischer Auswertung von nicht-negative Matrix-Faktorisierung oder Plotten eines einzelnen Ions von Interesse können direkt auf der Website vorgenommen werden.
   2. Alternativ kann die Rohdaten Würfel zur Analyse in Matlab exportiert werden.

Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Spektrum von einer unbehandelten Rattenhirn Abschnitt erhalten. Im positiven Modus wird das Massenspektrum von Phosphatidylcholine aufgrund ihres hohen Ionisierungseffizienz (zurückzuführen auf die positiv geladenen quaternären Ammoniumgruppen) dominiert. Die gesamte Ionenbild der Gewebeschnitt ist auch in Fig. 3 gezeigt, mit umfangreicher Signal über den gesamten Abschnitt des Gehirns. Key Lipide erfasst sind in Tabelle 1 durch Vergleiche Literatur identifiziert.

Die räumliche Verteilung der Lipide Beispiel (Abbildung 4) zeigen, wie die relative Häufigkeit der verschiedenen Arten Phosphatidylcholin zwischen grauen und weißen Substanz des Gehirns verändert. Zum Beispiel [PC 34:1 + K] ^+, m / z 798,5364, zeigt erhöhte Intensität in der Hirnrinde (graue Substanz), während [PC 36:1 + K] ^+, m / z 826,5558, zeigt erhöhte Intensität in die Kleinhirnstiel (white Angelegenheit). Das zusammengesetzte Bild für die beiden Ionen (Abbildung 4c) erhalten hebt den Kontrast in Lipid-Verteilung über die Gewebeschnitte. Die räumliche Verteilung der andere wichtige Lipide im Gehirn sind ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Verteilungen stimmen mit früheren Studien. ^28-30

Abbildung 1. Schematische Darstellung der DESI-MSI Abbildungsverfahren. DESI (a) zur Oberflächenanalyse von Geweben verwendet wird, und wenn die Probe in einer gesteuerten Bewegung (b) unterhalb der Source gerastert, Massenspektren, Intensität vs m / z (c ), als Funktion der Zeit (d) erfasst wird. Diese Daten werden dann über den Zeitbereich mit der Bewegung korreliert, um eine chemische Bildes(E). Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Schematische Darstellung der DESI Quelle.

Abbildung 3. Durchschnittliche ganze Gewebe-Spektrum mit reichlicher m / z-Werte mit (a) und Totalionenstrom Bild (b) von DESI-MSI in positive Ionen-Modus erworben.

Abbildung 4. Ausgewählte Ionen Bildmaterial von Phosphocholinen in Rattenhirngewebe von DESI-MSI in positive Ionen-Modus erworben; (a) [PC 34:1 + K] ^+, m / z 798,5364, (b) [PC 36:1 + K] ⁺ , m / z 826.5558 (c) zusammengesetzte Bild von m / z 798, blau, und 826, rot.

Tabelle 1. Key Lipid Identitäten und Lokalisation im Gehirn Abschnitt.

Die Optimierung der DESI Quellgeometrie ist entscheidend für eine erfolgreiche MSI Experimente. Die mehreren Variablen, die zur Ausrichtung des Systems unmittelbar auf Empfindlichkeit und Auflösung. Wenn während der Optimierung, hat der Experimentator Schwierigkeiten bei der Beschaffung Signal, empfehlen wir die Verwendung rot Sharpie Stelle auf der Folie als Maßstab gezeichnet; der Farbstoff Rhodamin 6G, m / z 443, erzeugt ein starkes Signal in der positiven Ionen-Modus und kann verwendet werden für anfängliche Optimierung. Außerdem ist die Auswahl des Lösungsmittels für DESI entscheidend für die Empfindlichkeit, als Analyt Übertragung und Ionisation hängt von der Gewinnung des Analyten von der Oberfläche in dem dünnen Film gebildet wird. ¹³ Viele Elektrospray-Ionisation-kompatiblen Lösungsmitteln und Mischungen verwendet werden, um in der Desolvatation unterstützen und Ionisation Prozess abhängig von der Klasse der Verbindung von Interesse bei der Analyse.

Wie bereits erwähnt, ist die Auflösung des DESI-MS Bild depends in erster Linie auf die Quelle Geometrie. Bildauflösung in der Größenordnung von 200 um wird regelmäßig von DESI-MSI erhalten, wenn dieser höher ist als Laser-basierten und / oder im Vakuum bildgebenden Verfahren, die von ~ 10-150 um. ^5,31 Auflösung so hoch wie 40 um reichen kann Es wurde berichtet, mit DESI, ²⁴ jedoch 200 um für die routinemäßige Bildgebung ausreicht Analyse von großen biologischen Gewebeschnitten. Die Qualität der inneren Quarzglaskapillare der DESI-Quelle wird auch Auswirkungen auf die Bildqualität und Auflösung. Die empfohlene Innendurchmesser der Kapillare 50 um, so groß ID Kapillaren ergeben eine größere Sprays und größere Bildauflösung. ²⁵ Wenn diese Kapillare nicht quadratisch oder geschnitten wird rissig, das Spray nicht konisch sein, was zu unregelmäßig geformten Auswirkungen Stelle, schlechte Qualität und reproduzierbare Bilder.

Nicht nur, dass die Quelle die Auflösung der Geometrie DESI-MSI beeinflussen, es spielt auch eine bedeutende Rolle bei der Empfindlichkeitdes Verfahrens. Deshalb ist die Geometrie zu optimieren und konstant gehalten werden während des gesamten Verfahrens. Wenn die Probe nicht planar ist oder nicht genau waagerecht montiert ist, die Source-Geometrie ändert, wodurch sich die Reaktionszeit und die Schaffung eines Artefakt im Bild. ²³ Obwohl DESI-MSI an ebenen Proben beschränkt wird 3D-Bildgebung von biologischen Geweben hergestellt möglich durch die 2D-Bildgebung von seriellen Gewebeschnitten, die dann in ein dreidimensionales Bild gestapelt sind. ³² Dieser Ansatz kann auch für andere MSI Methoden, einschließlich SIMS, MALDI, LAESI usw. ³³ Dreidimensionale Massenspektrometrie Bilder können auch eingesetzt werden erstellt von der schrittweisen Beseitigung von Schichten des Materials, durch Laserpulse zum Beispiel, und Re-Imaging. ³⁴

Die positive Analyse der Modus Rattenhirn Gewebe erleichtert erfolgreiche Bildgebung Phosphatidylcholinen und einige Medikamente und Metaboliten. ^18. Um diese Analyse zu ergänzen, Bildgebung in negativE-Modus erzeugt ein Spektrum mit einer größeren Vielfalt von Klassen von Lipiden, ^28,35 und kann verwendet werden, um eine umfassende Analyse der Gewebeschnitte bereitzustellen. In Fällen, in denen mehr als eine Lipid-Spezies zu einer bestimmten m / z-Wert zugeordnet werden können, können Tandem-Massenspektrometrie zur Identifizierung verwendet werden. Tandem-Massenspektrometrie dient auch als zusätzliche Methode der Lipid Identität Bestätigung. ³⁵

Ambient Massenspektrometrie Bildgebung durch DESI wurde als wirksam erwiesen bei der Abbildung Lipide in Rattenhirngewebe. Informationen über MSI Experimenten erhalten einen Einblick in Krankheiten mit veränderter Ebenen der Phospholipide wie Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom und Diabetes ua verbundene Dienstleistungen zu erbringen. ^36-38 Angesichts der hohen Fülle von Lipiden und ihre Rollen in biologischen Prozessen existieren viele biologische Systeme das wäre von den Informationen über bildgebende Massenspektrometrie erhalten profitieren. Mit vielen potenziellen MethodenBild zu biologischen Proben mittels Massenspektrometrie, ambient Ionisierungsmethoden, DESI insbesondere ein Mittel, dies zu tun mit eingeschränkter Probenvorbereitung und erhöht einfache Analyse.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Diese Arbeit wird durch ARRA NSF MRI Instrument Development Grant # 0923179 zu FMF unterstützt. Wir danken Aqua Asberry, Lab-Koordinator für die Parker H. Petit Institut für Bioengineering und Biowissenschaften Histologie Kern, für die Unterstützung bei Gewebe Schnitte.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet