Разделение

Парамагнитные свойства hemozoin используются для изоляции поздних стадиях Plasmodium тропической-Инфицированных красных кровяных клеток, растущих в культуре. Метод прост и быстр и не влияют на последующие инвазивным возможности паразитов.

В отличие от других видов Plasmodium, P. тропической можно культивировать в лабораторных условиях, что облегчает его изучение ^1. В то время как паразитемии достигнуты может достигать ≈ 40% предел, следователь обычно держит доля составляет около 10%. Во многих случаях это необходимо изолировать паразита содержащих красных кровяных телец (эритроцитов) из незараженных, чтобы обогатить культуру и продолжить данный эксперимент.

Когда P. тропической поражает эритроциты, паразит деградирует и питается от ^{2 гемоглобина, 3.} Тем не менее, паразиты должны иметь дело с очень токсичным железосодержащего гема часть ^{4, 5.} Паразит ускользает от его токсичность путем преобразования гема в инертного полимера кристалл называется haemozoin ^{6, 7.} Это железосодержащих молекулы хранятся в его пищу вакуоли и металл в нем имеет окислительное состояние, которое отличается от той, в гем ^8. Трехвалентного состояния железа в гемozoin придает ей парамагнитных свойств отсутствует в неинфицированных эритроцитов. Как вторжение паразита достигает зрелости, содержание haemozoin также увеличивает ^9, который дарит еще больше парамагнетизма на последних стадиях P. тропической внутри эритроцитов.

Основываясь на этом парамагнитных свойств, последние этапы P. тропической инфицированной-красные клетки крови могут быть разделены путем передачи культуры через колонку, содержащую магнитные шарики. Эти шарики стали магнитные когда столбцы, содержащие их, размещенных на магнитный держатель. Зараженные эритроциты, из-за их парамагнетизма, затем будет в ловушке внутри колонны, в то время как проточные будет содержать, по большей части, неинфицированных эритроцитов и те, которые содержат ранних стадий паразита.

Здесь мы описываем методологию для обогащения населения конце паразитов сцене с магнитной колонны, которая поддерживает хорошие жизнеспособности паразитов ^10.После выполнения этой процедуры, одинокие культуры может быть возвращен в инкубатор, чтобы остальные паразиты продолжают расти.

Все действия протокола, за исключением центрифугирования, должны проводиться внутри капюшона, чтобы сохранить образец стерильности.

1. Поздняя стадия изоляция P. тропической-инфицированных эритроцитов

Все поздних стадиях Plasmodium-инфицированных эритроцитов могут быть разделены с этой методологией, поскольку hemozoin, который придает парамагнетизма на паразита, является общим метаболита в род. Высокой паразитемии (3-10%) в культуре рекомендуется, чтобы получить лучшие урожаи с этим протоколом, хотя и типичная культура будет содержать 2-4% гематокрит (объемная доля красных кровяных телец) и 1-8% паразитемии (процент инфицированных красные кровяные клетки). Паразиты могут культивироваться как описано Trager и Янсен ^1.

1. Простые, составные установки должны быть собраны для каждого шизонт процедуры изоляции. Для этого, LS колонны, магнитный сепаратор MidiMACS и MACS MultiStand от Miltenyi Biotec (рис. 1 ) используются. Во-первых, приложите магнитный сепаратор на металлической подставке, а затем поместить магнитную колонку на сепараторе.
2. В отдельной трубке (использовать 50 мл conicals повсюду), смешать 23,2 мл RPMI 1640 и 750 мкл 7,5% гидрокарбоната натрия для создания рабочего раствора. Есть дополнительные трубки под рукой для отбрасывания и сбора проточной паразита культуры.
3. Добавьте 3 мл рабочего раствора на колонку, чтобы уравновесить его, и отбросить проточные в трубку.
4. Добавить 8 мл P. тропической культуры в колонну, убедившись, что, как только последняя часть работы решения были вытеснены из колонны по культуре, приемной трубки заменить на сборе один, чтобы начать восстановление несвязанных культуры. Это необходимо, чтобы избежать разбавления культуру дальше.
5. Как только поток культуры через колонку прекратилось, добавить 1 мл рабочего раствора нажать на оставшиеся эритроциты из колонны.
6. Стиральные шаг: добавить еще 3 мл рабочего раствора в колонну и собирать течет жидкость в «выбытия» трубку, чтобы избежать разбавления культуры сохраняются как проточные в другой трубке.
7. Элюирование: После 3 мл прошли через колонку, отсоединить последний от стенда и разместить его на вершине 15 мл трубки.
8. Опять же, добавить 3 мл рабочего раствора в колонну. Этот шаг элюируется эритроцитов заражены паразитами конце этапа, что были пойманы в ловушку в бисер колонны.

Примечание: На данный момент, и в зависимости от количества паразитов необходимо, начать новый раунд / с коллекцией, очевидно, с учетом ограничений в паразитемии в оригинальной культурой. Колонки могут быть повторно использованы, пока поток сохраняет устойчивое состояние.

9. Концентрация собранные паразиты: центрифуги 15 мл пробирку, содержащую элюата в течение 5 мин при 150 мкг при комнатной температуре, чтобы сформировать темные гранулы из пораженных эритроцитов.
10. Удалить супернатант, оставляя достаточно жидким, чтобы занять очень небольшую выборку и определяют концентрацию и общий выход через микроскопию (см. шаг 2).
11. В этот момент, если изоляции и захвата поздно паразиты этапе осуществляется удовлетворительно, инкубировать культуры собраны снова со свежими средствами массовой информации.
12. Развести собранные паразиты в объеме и решения необходимых для последующих экспериментов.

2. Чистоты и выхода анализ

1. Проверка концентрации паразитов, полученные с помощью гемоцитометр и подсчета под световым микроскопом. Чтобы подсчитать, добавить 10 мкл смеси собранных паразитов и средств массовой информации под прикрытием скольжения гемоцитометра. Подсчитайте количество паразитов в четырех квадрантах гемоцитометр и разделите общее количество на 4. Умножьте это число на 10 ^4, чтобы получить концентрацию зараженноеrythrocytes на мл.

Примечания: а) концентрация смеси будет решаться пользователем в момент ресуспендированием гранул, добавляя больше или меньше среднего. Предложила рабочая концентрация составляет 5,5 х 10 ⁴ schizontes в мкл (обычно это достигается путем добавления 100-300 мкл на собранные паразиты). Если 20 мкл этой концентрации добавляют в конечном объеме 100 мкл смеси СМИ и эритроцитов, паразитемии около 1% в типичном 4% гематокрит культуры будут получены. б) Счетная под гемоцитометр должен быть быстрым, так как эритроциты начала лизиса как образец высыхает внутри камеры. Зараженные эритроциты, которое должно быть большинство, покажет темно пятно, которое отличает их от не инфицированной них.

2. Выполните тонкий слой Гимза для оценки чистоты коллекции, фиксируя слайды очень быстро в 10% метанола, сушка их, и погружение тподоле в 20% раствор Гимза разбавляют дистиллированной водой. Пятно слайды в течение 10 мин, после чего они могут быть высушены на воздухе и исследуют под микроскопом. Паразитемии значительно выше 70% должны быть достижимыми.

На рисунке 2, культуре, проходящих через магнитную колонке показано, до (А) и после процедуры (B). От одного до двух инфицированных эритроцитов, как правило, видели на поле 100X увеличение, как показано на рисунке 2, со стрелками, указывающими на зараженные эритроциты на рисунке 2А. В обычной процедуре, начиная с культурой на 5% паразитемии (рис. 2A), выполнение этой процедуры обычно производит эритроциты с паразитемии 97% -100% (рис. 2В). Обогащение паразитемии порядка 20X легко достижимо, и несколько проходов культуры через колонку можно добиться высокого выхода P. тропической поздней стадии-инфицированных эритроцитов, по мере необходимости или по желанию.

Рисунок 1. Типичная схема магнитной компоненты. MIDI магнитные колонки, магнитный сепаратор и подставки ставятся вместе, как показано здесь.

Рисунок 2. А) Типичные 5% несинхронизированных паразита содержимое перед обогащением. 1 мкл образца паразитов, собранных с помощью этого магнитного процедура Гимзе окрашивается и рассматривается в 100-кратном увеличении. От одного до трех инфицированных эритроцитов, как правило, рассматривается в любой области сферы (отмечены стрелками). B) паразита содержимое после обогащения. 1 мкл образца собранного паразитов через эту процедуру магнитной Гимзе окрашивается и рассматривается в 100-кратном увеличении. Паразитемии сейчас 99%.

В пробирке культуру паразита малярии P. тропической обладают ограниченным паразитемии, причем более половины из красных кровяных клеток неинфицированных на самом высоком распространение точка культуре. Для большинства исследовательских экспериментов, желательно, чтобы работать только с инфицированными эритроцитами. С этой целью разделения технику необходимо разделить культуру в соответствии с инфекцией. Полезные методы включают в себя использование стрептолизин вывода permeabilize и лизировать неинфицированных эритроцитов ¹¹ и ряд вариаций дифференциального центрифугирования которые используют различные плотности две группы. Некоторые из этих методов включают желатин флотации ¹² и использования Plasmion ^13, но самое распространенное вещество используется для создания слои различной плотности для улавливания различных эритроцитов среднего градиента плотности Percoll, которые могут представлять некоторые токсичностью для паразитов ^14.

Мы гауже использовали метод впервые описал Павла и дальнейший анализ на ^{15 Trang, 16,} основанный на парамагнитные свойства haemozoin, инертных кристаллов производится переваривание гемоглобина паразита. Как сообщалось в другом месте в нашей группе, этот метод является неинвазивным и, кажется, не влияют на паразита, как указано в нормальное состояние после обращения возможность вторжения свежие эритроциты, по сравнению с вторжением цены паразитов подвергают обогащению Percoll центрифугирования в градиенте ^{10, 14, 17.} В дополнение к этой выгоде, если культура имеет большое количество зараженных эритроцитов, может быть больше, чем одна коллекция шаг, так как связывающую способность колонны может быть недостаточно, чтобы вместить всех паразитов контента сразу. Таким образом, собранной культуры могут быть переданы через колонку несколько раз, пока достаточно паразитов, собранных для данного последующих экспериментов.

Коллекция P. тропической пунктсайты с использованием магнитных шариков простой, быстрый и требует только настольная центрифуга, в отличие от дифференциального центрифугирования методы, которые нуждаются в большой и дорогостоящий пол центрифуги и которая также требует тщательной обработки образцов.

Некоторые приложения культуры обогащения использование вторжения паразитов в анализах, где, начиная паразитемии строго контролируется во всех образцах, использование собранных паразитов для извлечения hemozoin, инертных кристаллов общим для семьи Plasmodium, использование высокой плотности паразиты для подготовки к микроскопический анализ, а также извлечение ДНК только паразитов, когда они смешиваются с другими клетками крови. Это последнее приложение может быть использовано для анализа клинических образцов генетически определить формы малярии они заражены и сделать осознанный терапевтический план.

Нам нечего раскрывать.

Эта работа финансировалась грантом PRB-009 для CS и докторские стипендии для LC, от Secretaría Насьональ де Ciencia у Tecnología (SENACYT), Панама.