Separazione dei

Le proprietà paramagnetiche di emozoina sono utilizzati per isolare fasi avanzate della Plasmodium falciparum-Infetti globuli rossi crescono in coltura. Il metodo è semplice e veloce e non influenza le capacità invasive successive dei parassiti.

A differenza di altre specie di Plasmodium, P. falciparum possono essere coltivate in laboratorio, che facilita lo studio ^1. Mentre la parassitemia ottenuto può raggiungere il limite ≈ 40%, l'investigatore tiene normalmente la percentuale intorno al 10%. In molti casi è necessario isolare il parassita contenenti globuli rossi (RBC) da quelli non infetti, ad arricchire la cultura e procedere con un dato esperimento.

Quando P. falciparum infetta il eritrociti, il parassita si degrada e si nutre da emoglobina ^{2, 3.} Tuttavia, il parassita deve fare i conti con una molto tossica contenente ferro eme parte ^{4, 5.} Il parassita sfugge sua tossicità trasformando l'eme in un polimero a cristalli inerte chiamato haemozoin ^{6, 7.} Questa molecola contenente ferro viene memorizzato nel suo vacuolo alimentare e il metallo in esso ha uno stato ossidativo che differisce da quella in eme ^8. Stato ferrico di ferro nel emeozoin le conferisce una proprietà paramagnetica assente negli eritrociti non infetti. Come il parassita invade raggiunge la maturità, il contenuto di haemozoin aumenta anche ^9, che conferisce paramagnetismo ancora di più le ultime fasi di P. falciparum all'interno degli eritrociti.

Sulla base di questa proprietà paramagnetica, le ultime fasi di P. falciparum infetto-globuli rossi possono essere separati facendo passare la cultura attraverso una colonna contenente biglie magnetiche. Queste perle diventare magnetico quando le colonne che li contengono sono disposti su un supporto magnetico. RBC infetti, a causa della loro paramagnetismo, verrà intrappolata all'interno della colonna, mentre il flusso attraverso conterrà, per la maggior parte, eritrociti infetti e quelle contenenti fasi iniziali del parassita.

Qui, descriviamo la metodologia per arricchire la popolazione di parassiti fase avanzata con colonne magnetiche, che mantiene una buona redditività parassita ^10.Dopo aver eseguito questa procedura, la cultura distaccato può essere restituito ad un incubatore per consentire ai parassiti rimanenti per continuare a crescere.

Tutte le fasi del protocollo, tranne per centrifugazioni, deve essere effettuato all'interno di una cappa di mantenere il campione sterile.

1. Fase tardiva isolamento di P. falciparum con infezione da Eritrociti

Tutte le fasi tardive di eritrociti infettati dal Plasmodium possono essere separati con questa metodologia, in quanto emozoina, che conferisce paramagnetismo sul parassita, è un metabolita comune al genere. Una parassitemia elevata (3-10%) nella cultura si consiglia di ottenere i migliori rendimenti con questo protocollo, anche se una cultura tipica conterrà 2-4% dell'ematocrito (percentuale in volume dei globuli rossi) e 1-8% parassitemia (percentuale di infetti globuli rossi). I parassiti possono essere coltivate come descritto da Trager e Jansen ^1.

1. Un semplice, multi-parte di setup deve essere montato per ogni procedura di isolamento schizonte. Per questo, le colonne LS, un separatore magnetico MidiMACS e un MultiStand MACS da Miltenyi Biotec (Figura 1 ) vengono utilizzati. In primo luogo, collegare il separatore magnetico per il supporto metallico e poi posto la colonna magnetica sul separatore.
2. In un tubo separato (utilizzare 50 ml conicals tutta), miscelare 23,2 ml di RPMI 1640 e 750 ml di bicarbonato di sodio 7,5% per creare la soluzione di lavoro. Hanno tubi aggiuntivi a disposizione per scartare e raccolta del flusso passante della cultura parassita.
3. Aggiungere 3 ml della soluzione di lavoro per equilibrare la colonna per esso, e scartare il flusso passante in un tubo.
4. Aggiungere 8 ml di P. falciparum cultura alla colonna, facendo in modo che non appena l'ultima parte della soluzione di lavoro è stato spinto fuori della colonna dalla cultura, il tubo di ricezione è sostituito da quello di raccolta per iniziare il recupero della cultura non legato. Ciò è necessario per evitare di diluire la cultura ulteriormente.
5. Una volta che il flusso della cultura attraverso la colonna è cessato, aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro per spingere gli RBC rimanenti su colonna.
6. Fase di lavaggio: aggiungere un'altra 3 ml della soluzione di lavoro alla colonna e raccogliere il liquido scorre nel tubo "scarto" per evitare di diluire la coltura viene salvato come flusso passante nel tubo altra.
7. Eluizione: Dopo il 3 ml sono passati attraverso la colonna, staccare quest'ultimo dal supporto e posizionarlo sopra un tubo 15 ml.
8. Nuovamente, aggiungere 3 ml di soluzione di lavoro per la colonna. Questo passaggio eluisce gli eritrociti infettati da parassiti fase avanzata che sono stati intrappolati nelle sfere della colonna.

Nota: A questo punto, a seconda della quantità di parassiti necessario avviare un altro giro / s di raccolta, ovviamente nei limiti della parassitemia nella cultura originale. La colonna può essere riutilizzato finché il flusso mantiene uno stato stazionario.

9. Concentrazione dei parassiti raccolti: Centrifugare la provetta 15 ml contenente l'eluato per 5 min a 150 xg a temperatura ambienteper formare un pellet scuro dagli eritrociti parassitati.
10. Rimuovere il surnatante lasciando abbastanza liquido per prendere un campione molto piccolo e determinare la concentrazione e il rendimento totale mediante microscopia (vedere il punto 2 riportato di seguito).
11. In questo momento, se l'isolamento e la cattura dei parassiti fase avanzata si realizza in modo soddisfacente, incubare la coltura raccolto nuovamente con mezzi freschi.
12. Diluire i parassiti raccolti nel volume e soluzione necessaria per successivi esperimenti.

2. Purezza e Analisi Rendimento

1. Controllare la concentrazione di parassiti ottenuti utilizzando un emocitometro e conteggio al microscopio ottico. Per contare, aggiungere 10 microlitri della miscela dei parassiti raccolti e il supporto sotto il vetrino del emocitometro. Contare il numero di parassiti nei quattro quadranti della emocitometro e dividere il numero totale di 4. Moltiplicare quel numero per 10 ⁴ per ottenere la concentrazione di posta infettorythrocytes per ml.

Note: a) La concentrazione della miscela sarà deciso dall'utente al momento della risospensione del pellet, aggiungendo più o meno media. Una concentrazione suggerito di lavoro è 5,5 x 10 ⁴ schizontes per microlitri (si tratta in genere ottenuto con l'aggiunta di 100-300 pl ai parassiti raccolti). Se 20 pl di questa concentrazione viene aggiunto ad un volume finale di 100 microlitri mix di media ed eritrociti, una parassitemia di circa 1% in una tipica cultura ematocrito 4% sarà ottenuta. b) sotto il conteggio emocitometro deve essere veloce, dal momento che gli eritrociti iniziare lisi come si asciuga del campione all'interno della camera. Eritrociti infetti, che dovrebbe essere la maggior parte, mostra un interno macchie scure, che li differenzia da quelli non infetti.

2. Eseguire un sottile strato Giemsa per valutare la purezza della collezione fissando i vetrini molto rapidamente in 10% metanolo, essiccazione, e immergendo torlo in una soluzione al 20% di Giemsa diluita con acqua distillata. Colorare i vetrini per 10 min, dopo di che può essere essiccato con aria ed esaminate al microscopio. Un parassitemia ben al di sopra del 70% dovrebbe essere realizzabile.

In figura 2, la cultura passa attraverso la colonna magnetica viene mostrato, prima (A) e dopo il procedimento (B). Uno a due eritrociti infetti sono di solito visto su un campo ingrandimento 100X, come mostrato in figura 2, con le frecce rivolte verso eritrociti infetti in Figura 2A. In una tipica procedura, a partire da una coltura al 5% parassitemia (Figura 2A), le prestazioni di questo procedimento produce solitamente eritrociti con una parassitemia del 97% -100% (Figura 2B). Arricchimento della parassitemia dell'ordine di 20X è facilmente realizzabile, e più passaggi della cultura attraverso la colonna può ottenere una resa elevata di P. falciparum in ritardo-fase-eritrociti infettati, se necessario o desiderato.

Figura 1. Configurazione tipica dei componenti magnetici. La colonna MIDI magnetico, il separatore magnetico e il supporto sono messi insieme come illustrato qui.

Figura 2. A) tipico 5% non sincronizzato contenuto parassita prima di arricchimento. A 1 ml di campione dei parassiti raccolti attraverso questa procedura Giemsa magnetico è stato macchiato e visualizzato con ingrandimento 100X. Da uno a tre eritrociti infetti sono di solito visto in ogni settore del campo di applicazione (segnato con frecce). B) contenuto Parasite dopo arricchimento. A 1 ml di campione dei parassiti raccolti attraverso questa procedura magnetico è Giemsa macchiato e visualizzato con ingrandimento 100X. Parassitemia è ora al 99%.

Nelle culture in vitro di parassita della malaria P. falciparum mostrano una parassitemia limitata, con più della metà dei globuli rossi non infettate nel punto più alto proliferazione di cultura. Per esperimenti più ricerca, è desiderabile lavorare solo con gli eritrociti infetti. A tal fine, una tecnica di separazione è necessario dividere la coltura secondo l'infezione. Metodi utili includono l'uso di streptolisina O a permeabilize e Lyze gli RBC non infetti ¹¹ e una serie di variazioni di centrifugazioni differenziali che sfruttano la diversa densità dei due gruppi. Alcuni di questi metodi includono flottazione gelatina ¹² e l'uso di Plasmion ¹³ ma la sostanza più comune utilizzato per creare strati di densità diverse per intrappolare le diverse cellule rosse del sangue è il gradiente di Percoll media densità, che possono presentare una tossicità ai parassiti ^14.

Ci have utilizzato una prima tecnica descritta da Paul e ulteriormente analizzati mediante Trang ^{15, 16,} in base alla proprietà di haemozoin paramagnetico, un cristallo inerte prodotto dalla digestione di emoglobina dal parassita. Come riportato altrove dal nostro gruppo, questo metodo non è invasivo e non sembrano influenzare il parassita, come indicato dalla normale dopo-trattamento capacità di invasione di eritrociti freschi, rispetto ai tassi invasione di parassiti sottoposti ad arricchimento per Percoll centrifugazione in gradiente di ^{10, 14, 17.} In aggiunta a questo vantaggio, se la cultura ha un numero elevato di eritrociti infetti, ci possono essere più di una fase di raccolta, dato che la capacità di legame della colonna può non essere sufficiente a contenere tutti i contenuti parassita in una volta. Pertanto, la coltura raccolto può essere passato attraverso la colonna più volte fino parassiti sufficienti vengono raccolti per un dato esperimento successivo.

La raccolta di P. falciparum parasiti con l'uso di perline magnetiche è semplice, veloce e richiede solo una centrifuga da banco, a differenza delle tecniche di centrifugazione differenziale che necessitano di una centrifuga pavimento grande e costoso e che richiede anche meticolosa manipolazione dei campioni.

Alcune applicazioni di arricchimento cultura sono l'uso dei parassiti in saggi di invasione dove la parassitemia partenza è rigorosamente controllata in tutti i campioni, l'utilizzo dei parassiti raccolti per estrarre emozoina, il cristallo inerte comuni alla famiglia Plasmodium, l'uso di una elevata densità di parassiti per preparare analisi al microscopio, e l'estrazione del DNA di parassiti solo quando vengono miscelati con altre cellule ematiche. Quest'ultima applicazione potrebbe essere utilizzato per analizzare campioni clinici per identificare geneticamente il ceppo di malaria sono infettati con essi e fa un piano informata terapeutico.

Non abbiamo nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione PRB-009 per CS e una borsa di studio di dottorato di LC, dal Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.