Синтез Фазовый наноэмульсии с узким распределением размера для акустической испарения капель и Bubble повышенной ультразвуковой аблации-опосредованной

Фазовый наноэмульсий (PSNE) может быть испаряется использованием высокой интенсивности сфокусированного ультразвука для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции опухолей. В этом докладе, подготовка стабильного PSNE с узким распределением по размерам описывается. Кроме того, влияние PSNE испаренного на УЗИ-опосредованной абляции показано в ткани имитирующие фантомы.

Высокая интенсивность сфокусированного ультразвука (HIFU) используется в клинике для термической абляции опухолей. Для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции при опухолях, липидного покрытые капель перфторуглеродов были разработаны, которые могут быть испаряется HIFU. Сосудистой во многих опухолях аномально вытекающей из-за их быстрого роста, и наночастицы способны проникать fenestrations и пассивно накапливаться в опухолях. Таким образом, контролируя размер капель может привести к лучшему накопления в опухоли. В этом докладе, подготовка стабильного капель в фазовом наноэмульсии (PSNE) с узким распределением по размерам описывается. PSNE были синтезированы ультразвуком липидной раствора в присутствии жидких перфторуглеродов. Узким распределением по размерам был получен путем экструзии PSNE несколько раз, используя фильтры с порами размером 100 или 200 нм. Распределение по размерам была измерена в 7-дневный срок с использованием динамического рассеяния света. Polyacrylamide гидрогелей, содержащих PSNE были подготовлены в пробирке эксперименты. PSNE капель в гидрогели были испарения с ультразвуком и в результате пузырей усиливается локальному нагреву. Испаряясь PSNE обеспечивает более быстрый нагрев, а также снижает интенсивность ультразвука необходимых для тепловой абляции. Таким образом, PSNE как ожидается, повысит тепловой абляции при опухолях, потенциально улучшения терапевтических результатов HIFU-опосредованной тепловые процедуры абляции.

1. Подготовка этапа смены наноэмульсии (PSNE)

1. Растворите 11 мг ДПФХ и 1,68 мг DSPE-PEG2000 в хлороформе
2. Выпаривают органическом растворителе с образованием сухой пленки липидов в стеклянную круглодонную колбу
3. Осушать липидной пленки ночь
4. Увлажняет липидной пленки с 5,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS)
5. Тепло решение в 45 ° С водяной бане до растворения липидной пленки, периодически встряхиванием
6. Передача липидного раствора в 7 мл флаконе
7. Разрушать ультразвуком липидной решение в течение 2 мин при 20% амплитуды
8. Разделить решение в двух флаконов по 2,5 мл каждый (отбросить оставшиеся 0,5 мл)
9. Добавить 2,5 мл PBS в каждом флаконе
10. Место каждого флакона в 0 ° C ледяной бане
11. Добавить 50 мкл DDFP в каждом флаконе
12. Разрушать ультразвуком каждого флакона в ледяной бане, используя следующие параметры: 25% амплитуды, импульсный режим (10 сек на, 50 сек пауза), 60 сек Всего на время
13. Transfer PSNE решения по 20 мл ампулы сцинтилляционных
14. Добавьте 5 мл PBS в каждую пробирку, в результате чего в 10 мл конечного объема
15. Соберите экструдеров следующих направлениях предоставленной производителем
    1. Промыть каждую часть деионизированной водой
    2. Положите диск из нержавеющей стали поддержку в центре фильтра базу поддержки
    3. Поместите сетку из нержавеющей стали на вершине диск из нержавеющей стали
    4. С помощью пинцета, поместить диск экструдер сливной мембраны (блестящей стороной вверх) на сетку из нержавеющей стали
    5. С помощью пинцета, поместить в экструдер фильтр (блестящей стороной вверх) на мембране диска сливной
    6. Аккуратно положите небольшое кольцо на фильтр и поместите thermobarrel и экструдер верх над базу поддержки
    7. Частично завинтите каждом крыле гайки, а затем полностью затяните крыла гайки от руки в переменном моды
    8. Подключите экструдералинии газообразного азота
    9. Премьер-экструдер, пипетки 10 мл деионизированной воды в верхнем порту образца, ограничить открытие и затяните вентиляционный клапан
    10. Медленно откройте линии газообразного азота, чтобы увеличить давление, заставляя образца через мембраны, а также сбор образцов от розетки трубы
    11. После использования, разбирать в обратном порядке, промыть экструдер частей деионизированной водой, и отказаться от мембранный фильтр и диск мембраны сливной
16. За 100 нм капли только предварительное условие PSNE путем выдавливания в 10 раз до 200 нм фильтра
17. Extrude PSNE 16 раз до 100 нм и 200 нм фильтра для получения узким распределением по размерам

2. Подготовка Полиакриламид гидрогель, содержащий PSNE

1. Подготовить 24% BSA решение путем разбавления 1,2 г порошка BSA в 5 мл деионизированной воды
2. Подготовить 10% APS решение разбавленной 0,1 г порошка APS в 1 мл деионизированной водоснаг
3. В следующем порядке, смешать 2,1 мл раствора акриламида, 1,2 мл трис-буфера, 0,1 мл 10% APS, 4,5 мл 24% BSA решение, и 3,6 мл воды в пластиковой камере
4. Нагреть до 40 ° C и место под вакуумом в течение 1 часа
5. Добавить 480 мкл PSNE и тщательно перемешать, осторожно вращая пластиковой камере.
6. Добавить 12 мкл TEMED и поместить камеру в 12 ° С водяной бане в течение 2 часов

3. Представитель Результаты

Схема установки для ультразвуковых экспериментов с тканями имитирующие фантомы гидрогель показано на рисунке 1. Этот протокол приводит к липидной покрытием перфторуглеродов капель с узким распределением по размерам, которые являются стабильными в растворе, по крайней мере неделю. Размер дистрибутива измеряется динамического рассеяния света (90Plus анализатор размера частиц, Brookhaven Instruments, Holtsville, Нью-Йорк) показана на рисунке 2 для PSNE экструдированного использовании 100 и 200нм фильтра. PSNE эффективного диаметра с течением времени, измеряется с помощью динамического рассеяния света, приведены в таблице 1, демонстрируют, что PSNE стабильны в течение по крайней мере недели. B-режим изображения PSNE до и после испарения в полиакриламидном гидрогеле показано на рисунке 3. Кроме того, поражение образуется на 15 секунд HIFU-опосредованной отопления в полиакриламидном гидрогель, содержащий альбумин и PSNE показано на рисунке 4. Асимметричная форма поражения является результатом prefocal отопление, которое происходит из-за наличия пузырей облако в ультразвуковом пути. Важно отметить, что prefocal отопления и поражения формирование в связи с разбросом от пузыри могут быть сведены к минимуму за счет сокращения передаются акустической мощности.

Рисунок 1. Принципиальная схема экспериментальной установки для ультразвуковых экспериментов с тканями МИМIcking гидрогелей.

Рисунок 2. Распределение по размерам PSNE выдавливается через 100 нм и 200 нм фильтра, измеряется с помощью динамического рассеяния света. Единиц по оси ординат оси в зависимости от интенсивности рассеянного света от частиц определенного размера по отношению к общей интенсивности рассеянного света от образца.

Рисунок 3. B-режим изображения (а) до и (б) после PSNE испарения в полиакриламидном гидрогеля. Стрелка указывает фокальной области, где пузырь облако было сформировано PSNE испарения.

Рисунок 4. Изображения polyacrиламида гидрогель, содержащий альбумин и PSNE (а) до и (б) после испарения и ультразвуком с HIFU, демонстрируя поражение формирование в результате ультразвукового вызванных отопления. Частота ультразвуковых центра составила 3,3 МГц. Ультразвуковой сигнал состоял из начальных 30-цикле, 6,4 Вт импульс для испарения PSNE, сразу после 15 секунд непрерывной ультразвуковой на 0,77 В.

Таблица 1. Средний диаметр и стандартное отклонение PSNE на один и семь дней после экструзии при 100 нм и 200 нм фильтра.

Высокая интенсивность сфокусированного ультразвука (HIFU) используется в клинике для термической абляции опухолей. ¹ Для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции при опухолях, липидного покрытые капель перфторуглеродов были разработаны, которые могут быть испаряется HIFU. Сосудистой во многих опухолях аномально вытекающей из-за их быстрого роста. ² Таким образом, наночастицы способны проникать fenestrations и пассивно накапливаются в опухоли, процесс, известный как повышенной проницаемости и удержания (EPR) эффект. ³ было показано, что Наночастицы между 70 и 200 нм накапливаются наиболее эффективно в опухолях. ⁴ процедуры, описанной в настоящем докладе производит стабильный фазовый наноэмульсии (PSNE) липидного покрытые капель перфторуглеродов с узким распределением по размерам. В прошлом, большинство исследований использовали полидисперсного распределения по размерам PSNE, но последние исследования были сосредоточены на производстве PSNE с узким распределением по размерам.5, 6 экструзионного метода, описанного в этом протоколе позволяет контролировать размер для того, чтобы увеличить процент капель вводят системно, что будет накапливаться в опухолях.

Додекафторпентан ядро нанокапелек имеет температуру кипения 29 ° C. ⁷ Таким образом, он является важным для поддержания низкой температуры на каждом этапе PSNE подготовки. Озвучивание повышается температура раствора, но с использованием импульсной последовательности обработки ультразвуком и размещении образца в ледяной бане в течение ультразвуком может уменьшить испарение. После липидного покрытые капель формируются, температура кипения повышается выше 60 ° C за счет поверхностного натяжения. ⁸ PSNE испарения от температуры и давления-зависимых и также зависит от размера и состава жидких капель перфторуглеродов. ⁹ Например, было установлено, что пик разрежения давления выше 3,8 МПа были необходимы, чтобы испарить 200нм DDFP капель при 37 ° C. ¹⁰ Покрытия капель с липидами сопряженных с поли (этиленгликоль) (ПЭГ) ингибирует синтез, увеличивая таким образом размер стабильности PSNE в течение нескольких дней. Кроме того, было документально подтверждено, что PEG может увеличить время циркуляции на основе липидов везикул, ^11-13, которые могут увеличить долю системно вводили PSNE, которые накапливаются в локализованных злокачественных новообразований. ^{14, 15}

Перфторуглеродов капель может быть приостановлено в ткани имитирующие полиакриламидного гидрогеля фантомные содержащего альбумин в пробирке термических исследований абляция ^16. PSNE загруженных гидрогелей полезны для оценки испарения пороги, а также изучение поражения от формирования пузырей повышенной HIFU-опосредованной отопления . Гидрогелей поглощать и преобразовывать акустической энергии в тепло, и когда температура в гидрогель превышает 58 ° C, альбумина в гидрогель денатурирует и становится непрозрачным^17. Потому что гидрогели оптически прозрачный, то можно заметить, денатурации белков в реальном времени. Испарение PSNE в гидрогели создает пузыри, которые используются для повышения эффективности ультразвуковых-опосредованной отопления. Использование сосредоточены преобразователя, PSNE испарения и пузырей повышенной отопления может быть локализована, что позволяет избежать нежелательного нагрева при вмешательстве биологических средах (например, ткани). В фантомы, испаренный Облако пузырь может повлиять на распространение ультразвукового луча и привести prefocal отопления, при условии, акустическая мощность превышает пороговое значение. Ниже этого порога, разбросанные мощности слишком низкая, чтобы удалять ткани в области prefocal, следовательно, удаленной объем ограничен расположения пузыря облака. Использование PSNE для повышения локальный нагрев в естественных условиях потенциально может улучшить результаты лечения опухолей HIFU аблации. В качестве первого шага, экструзии на основе протокола была разработана для управленияРазмер узко распределенных PSNE. Использование PSNE диспергированные в оптически прозрачной ткани имитирующие гидрогели, можно исследовать влияние PSNE испаренного на УЗИ-опосредованной отопления и тепловой абляции. Доставка терапевтических агентов и наночастиц в опухоли ядро в естественных условиях остается проблемой из-за увеличения интерстициального давления, которые находятся там. Вполне вероятно, что PSNE бы преимущественно накапливаются в опухоли периферии и, возможно, не легко проникают в опухоль ядра. Исследования, проведенные в гидрогели показали, что пузыри могут перенаправить звуковой энергии к датчик в результате абляции объемы в prefocal региона. Это явление происходит, когда передается акустическая мощность превышает определенный порог. Таким образом, можно локализовать пузырь повышенной абляции опухоли к периферии опухоли с использованием одного параметра питания, а также удалять внутреннее ядро, отражая акустической энергии от пузырьков создан в дистальном крае на более высоком ПауГ настройки. Кроме того, точное удаление опухоли периферии, что позволяет избежать повреждения окружающих здоровых тканей будет по-прежнему представляют собой значительный прорыв и потенциально могли позволить ранее не резектабельными опухоли должны быть удалены хирургическим путем. Хотя существуют различия между в естественных условиях и ткани имитирующие гидрогели, фантомы полезны для понимания физических механизмов ультразвукового повышенной отопления с PSNE с целью оптимизации параметров ультразвукового для тепловой абляции. Эти важные шаги для перевода использовании PSNE для повышения ультразвуковой абляции-опосредованного из лаборатории в клинику.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа была поддержана BU / CIMIT прикладных инженерных Здоровье Predoctoral стипендий, Национальный научный фонд расширения участия исследований Посвящение Грант Engineering (мостом) и Национального института здоровья (R21EB0094930).