Synthese von Phase-shift Nanoemulsionen mit enger Größenverteilung für Acoustic Droplet Vaporisation und Bubble-enhanced Ultraschall-vermittelte Ablation

Phase-shift Nanoemulsionen (PSNE) kann verdampft mit hoher Intensität fokussierter Ultraschall, um lokale Erwärmung und zur Verbesserung thermischen Ablation von Tumoren sein. In diesem Bericht wird die Herstellung von stabilen PSNE mit einer engen Größenverteilung beschrieben. Darüber hinaus wird der Einfluss des verdampften PSNE auf Ultraschall-vermittelte Ablation im Gewebe-ähnlichen Phantomen demonstriert.

High-Intensity Focused Ultrasound (HIFU) wird klinisch zur thermischen Ablation von Tumoren eingesetzt. Um örtliche Erwärmung und zur Verbesserung thermischen Ablation in Tumoren haben lipidbeschichteten Perfluorkohlenstoff Tröpfchen entwickelt worden, die durch HIFU verdampft werden. Das Gefäßsystem in vielen Tumoren außergewöhnlich leaky durch ihr rasches Wachstum und Nanopartikeln Lage sind, die Fensteranordnungen eindringen und passiv in Tumoren anreichern. Somit kann die Steuerung der Größe der Tröpfchen in bessere Anreicherung in Tumoren führen. In diesem Bericht wird die Herstellung von stabilen Tröpfchen in einer Phase-Shift-Nanoemulsion (PSNE) mit einer engen Größenverteilung beschrieben. PSNE wurden im Ultraschallbad eine Lipidlösung in Gegenwart des flüssigen Perfluorkohlenstoff synthetisiert. Eine enge Größenverteilung wurde durch Extrudieren der PSNE mehrfach die Verwendung von Filtern mit einer Porengröße von 100 bzw. 200 nm erhalten. Die Größenverteilung wurde über einen 7-Tages-Frist mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen. Polyacrylamide Hydrogele mit PSNE wurden in vitro Experimente vorbereitet. PSNE Tröpfchen in der Hydrogele wurden mit Ultraschall und die resultierenden Blasen verbessert lokalisierte Erwärmung verdampft. Verdampften PSNE ermöglicht schnelleres Aufheizen und verringert auch die Ultraschallintensität zur thermischen Ablation benötigt. So wird PSNE erwartet thermischen Ablation von Tumoren zu verbessern, potentiell verbessert therapeutischen Ergebnisse der HIFU-vermittelte thermischen Ablation Behandlungen.

Ein. Vorbereitung der Phase-Shift-Nanoemulsion (PSNE)

1. Lösen Sie 11 mg DPPC und 1,68 mg DSPE-PEG2000 in Chloroform
2. Verdunstet das organische Lösungsmittel, um eine trockene Lipidfilm in einem Glas-Rundkolben bilden
3. Auszutrocknen den Lipidfilm Nacht
4. Rehydrieren des Lipidfilms mit 5,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
5. Wärme-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad, bis Lipidfilm auflöst, Vortexen periodisch
6. Übertragen Lipid-Lösung in 7 ml Flasche
7. Beschallen Lipidlösung während 2 min bei 20% Stauchung
8. Dividieren Lösung in zwei Fläschchen 2,5 ml (verwerfen verbleibenden 0,5 ml)
9. 2,5 ml PBS in jede Phiole
10. Platzieren Sie jede Flasche in einer 0 ° C Eis-Wasser-Bad
11. Fügen Sie 50 ul DDFP in jedes Fläschchen
12. Beschallen jedes Fläschchen im Eis-Wasser-Bad mit den folgenden Einstellungen: 25% Amplitude, gepulsten Modus (10 sec ein, 50 s aus), 60 sec insgesamt auf Zeit
13. Transfer PSNE Lösungen für 20 ml Szintillationsgefäße
14. 5 ml PBS in jedes Fläschchen, was in 10 ml Endvolumen
15. Montieren Extruder folgenden Richtungen vom Hersteller bereitgestellten
    1. Spülen Sie jedes Teil mit VE-Wasser
    2. Das Edelstahlblech Stützscheibe in der Mitte des Filters Trägerbasis
    3. Legen Sie das Edelstahlgewebe auf der Edelstahl-Stützscheibe
    4. Mit einer Pinzette, legen einen Extruder Abfluss Disc Membran (glänzende Seite nach oben) auf dem Edelstahlgewebe
    5. Mit einer Pinzette, platzieren Sie den Extruder Filter (glänzende Seite nach oben) auf den Drain-Disc-Membran
    6. Legen Sie das kleine O-Ring auf dem Filter und platzieren Sie den thermobarrel und Extruder oben über der Trägerbasis
    7. Teilweise ziehen jedes Flügelmutter, dann ganz fest die Flügelmuttern von Hand abwechselnd
    8. Verbinden Sie den Extrudereine Stickstoff-Gasleitung
    9. Um den Extruder, Pipette 10 ml deionisiertem Wasser in den oberen Probeöffnung grundieren, verschließen Sie die Öffnung, und ziehen Sie das Entlüftungsventil
    10. Langsam das Stickstoffgas Zeile, um den Druck zu erhöhen, wodurch der Probe durch die Membranen, und sammeln der Probe aus dem Auslassschlauch
    11. Nach dem Gebrauch, in umgekehrter Reihenfolge zu zerlegen, spülen Sie die Extruder Teile mit VE-Wasser, und entsorgen Sie die Membran und Membran-Drain Disc
16. Für 100 nm Tröpfchen nur Voraussetzung PSNE durch Extrudieren 10 mal durch 200-nm-Filter
17. Extrude PSNE 16 mal durch 100 nm oder 200 nm Filter engen Größenverteilung zu erhalten

2. Vorbereitung der Polyacrylamid Hydrogel PSNE

1. Bereiten Sie 24% BSA-Lösung durch Verdünnen 1,2 g BSA-Pulver in 5 ml deionisiertem Wasser
2. Bereiten Sie 10% APS-Lösung mit verdünnter 0,1 g APS Pulver in 1 ml deionisiertem water
3. In der folgenden Reihenfolge, mischen 2,1 ml Acrylamid-Lösung, 1,2 ml Tris-Puffer, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA-Lösung und 3,6 ml deionisiertem Wasser in Kunststoffkammer
4. Wärme auf 40 ° C und unter Vakuum für 1 Stunde
5. Fügen Sie 480 ul PSNE und gründlich durch vorsichtiges Schwenken der Kunststoff-Kammer mischen.
6. Fügen Sie 12 ul TEMED und legen Sie die Kammer in einem 12 ° C Wasserbad für 2 Stunden

3. Repräsentative Ergebnisse

Eine schematische Darstellung der Einrichtung zur Ultraschall-Experimenten mit Gewebe-Nachahmung Hydrogel Phantome ist in Abbildung 1 gezeigt. Dieses Protokoll ergibt lipidbeschichteten Perfluorkohlenstoff Tröpfchen mit einer engen Größenverteilung, die stabil in Lösung sind für mindestens eine Woche. Die Größenverteilung mit dynamischer Lichtstreuung (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) gemessen wird in Abbildung 2 PSNE extrudiert mit 100 und 200 gezeigtnm Filtern. Der effektive Durchmesser PSNE über die Zeit, gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung, ist in Tabelle 1 aufgeführt, die zeigen, dass PSNE stabil sind für mindestens eine Woche. B-Modus-Bilder vor und nach PSNE Verdampfung in einem Polyacrylamid-Hydrogel, sind in Abbildung 3 dargestellt. Auch kann eine Läsion von 15 sec. der HIFU-vermittelte Erhitzen in einem Polyacrylamid-Hydrogel enthaltend Albumin und PSNE ist in Abbildung 4 dargestellt ist. Die asymmetrische Form der Läsion ist ein Ergebnis der prefocal Heizung, die aufgrund des Vorhandenseins der Blase Wolke im Ultraschallstrecke auftritt. Es ist wichtig, dass die Heiz-und prefocal Läsionsbildung aufgrund Streuung von Blasen beachten kann durch Reduktion der übertragenen akustischen Energie minimiert werden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die Ultraschall-Experimenten mit Gewebe-mimIcking Hydrogele.

Abbildung 2. Größe Verteilung der PSNE extrudiert durch 100 nm oder 200 nm Filter, gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung. Die Einheiten der Ordinate Achsen auf der Intensität des gestreuten Lichts von Teilchen einer bestimmten Größe in Bezug auf das Gesamtgewicht Streulichtintensität aus der Probe.

Abbildung 3. B-Modus-Bilder (a) vor und (b) nach PSNE Verdampfung in einem Polyacrylamid-Hydrogel. Der Pfeil zeigt die Fokalbereich wo eine Blase Wolke von PSNE Verdampfung gebildet wurde.

Abbildung 4. Bilder polyacrylamid Hydrogel enthaltend Albumin und PSNE (a) vor und (b) nach Verdampfung und Beschallung mit HIFU, demonstriert Läsionsbildung als Folge von Ultraschall-induzierten Erwärmung. Die Ultraschall-Mittenfrequenz bei 3,3 MHz. Das Ultraschallsignal bestand aus einem ersten 30-Zyklus, 6,4 W Impuls PSNE verdampfen sofort 15 sec von kontinuierlichem Ultraschall bei 0,77, gefolgt W.

Tabelle 1. Mittlerer Durchmesser und die Standardabweichung der PSNE an einem und sieben Tage nach der Extrusion mit 100 nm und 200 nm Filter.

High-Intensity Focused Ultrasound (HIFU) ist klinisch zur thermischen Ablation von Tumoren eingesetzt. ¹ Um lokale Erwärmung und zur Verbesserung thermischen Ablation in Tumoren haben lipidbeschichteten Perfluorcarbon Tröpfchen entwickelt worden, die durch die HIFU verdampft werden. Das Gefäßsystem in vielen Tumoren außergewöhnlich leaky durch ihr rasches Wachstum. ² somit in der Lage, die Nanopartikel Fenestrationen eindringen und passiv in Tumoren anreichernden, ein Vorgang, der erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung bekannt. ³ Es wurde gezeigt, dass Nanopartikel zwischen 70 und 200 nm sammeln effizient in Tumoren. ⁴ Das Verfahren in diesem Bericht beschrieben eine stabile Phase-Shift-Nanoemulsion (PSNE) der Lipid-beschichteten Perfluorcarbon Tröpfchen mit einer engen Größenverteilung. In der Vergangenheit wurden die meisten Studien verwendet polydispersen Größenverteilungen PSNE, aber neuere Studien zur Herstellung PSNE mit enger Größenverteilung fokussiert.5, 6 Das Extrusionsverfahren in dieser beschriebenen Protokoll erlaubt es, die Größe zu kontrollieren, um den Prozentsatz von Tröpfchen systemisch verabreicht, die innerhalb Tumoren anreichern wird zunehmen.

Der Kern der Dodecafluorpentan Nanotröpfchen eine Siedetemperatur von 29 ° C. ^7. Somit ist es wichtig, eine niedrige Temperatur während jedem Schritt der Herstellung PSNE aufrechtzuerhalten. Ultraschallbehandlung erhöht die Temperatur der Lösung, jedoch unter Verwendung eines gepulsten Ultraschallbehandlung Sequenz und Plazieren der Probe in einem Eis-Wasser-Bad während der Beschallung kann Verdampfung zu reduzieren. Sobald die lipidbeschichteten Tröpfchen gebildet haben, steigt die Siedetemperatur über 60 ° C aufgrund der Oberflächenspannung. ⁸ PSNE Verdampfung ist temperatur-und druckabhängig und hängt auch von der Größe und der Zusammensetzung der flüssigen Perfluorkohlenstoff Tröpfchen. ⁹ Beispielsweise es wurde festgestellt, dass Peak rarefactional Drücken oberhalb 3,8 MPa erforderlich wurden zu 200 verdampfenDDFP Tröpfchen nm bei 37 ° C ^10: Beschichtung die Tröpfchen mit Lipiden konjugiert mit Poly (ethylenglykol) (PEG)-Fusion hemmt, wodurch die Stabilität der Größe PSNE über mehrere Tage. Zusätzlich wurde dokumentiert, dass PEG kann die Zirkulationszeit von Lipiden basierenden Vesikeln, ^11-13, die den Anteil von systemisch verabreichtem PSNE die in lokalisierten Tumoren anreichern erhöhen erhöhen. ^{14, 15}

Die Perfluorkohlenstoff Tröpfchen können in einem Gewebe-Nachahmung Polyacrylamidhydrogel Phantom albuminhaltige zur in vitro Studien thermischen Ablation ausgesetzt. ¹⁶ Die PSNE beladenen Hydrogele sind für die Bewertung der Verdampfung Schwellenwerte sowie studiert Läsionsbildung vom Bubble-enhanced HIFU-vermittelte Heizung nützlich . Die Hydrogele absorbieren und akustischer Energie in Wärme, und sobald die Temperatur in dem Hydrogel übersteigt 58 ° C, Albumin in den Hydrogel denaturiert und undurchsichtig. ¹⁷ Weil die Hydrogele optisch transparent sind, ist es möglich, Proteindenaturierung in Echtzeit zu beobachten. Verdampfen des in den Hydrogelen PSNE schafft Blasen, die verwendet werden, um die Effizienz von Ultraschall-vermittelte Heizung zu erhöhen. Mit einer konzentrierten Wandler, PSNE Verdampfung und bubble-enhanced Heizung kann lokalisiert werden, wodurch unerwünschte Erwärmung in den dazwischen liegenden biologischen Medien (dh Gewebe). In den Phantome, das verdampfte Blasenwolke enthaltene Ultraschallstrahl Ausbreitungsrichtung beeinträchtigen und dazu führen prefocal beheizt werden, vorausgesetzt die akustische Leistung einen Schwellenwert überschreitet. Unterhalb dieser Schwelle ist die gestreute Energie zu niedrig, um Gewebe in der Region prefocal abzutragen; folglich die abgetragene Volumen wird auf die Lage des Blasenwolke beschränkt. Die Verwendung von PSNE um lokale Erwärmung in vivo zu erhöhen, verbessern könnte Ergebnisse der HIFU Tumorablation Therapien. Als erster Schritt wurde eine Extrusion basierendes Protokoll entwickelt worden, um zu steuerndie Größe eng verteilten PSNE. Verwendung PSNE dispergiert innerhalb optisch transparenten Gewebe-Nachahmung Hydrogele, ist es möglich, die Auswirkungen der verdampften PSNE auf Ultraschall-vermittelte Heiz-und thermischen Ablation untersuchen. Abgabe therapeutischer Mittel und Nanopartikeln auf den Tumor in vivo Kern bleibt eine Herausforderung aufgrund der erhöhten interstitiellen Druck, die dort vorhanden. Es ist wahrscheinlich, dass PSNE würde vorzugsweise innerhalb des Tumors Umfang an und kann nicht leicht durchdringen den Tumor Kern. Studies in Hydrogele haben gezeigt, dass Blasen können akustische Energie in Richtung des Wandlers was abgetragenen Volumina im prefocal Region umzuleiten. Dieses Phänomen tritt auf, wenn das übertragene akustische Leistung einen bestimmten Schwellwert überschreitet. Somit ist es möglich, zu lokalisieren blasenfreie verbesserte Tumorablation zum Tumorperipherie Mithilfe Leistungseinstellung sowie ablatieren den inneren Kern durch Reflektieren akustischer Energie aus Blasen im distalen Rand auf einem höheren powe geschaffenr Einstellung. Darüber hinaus würde präzisen Ablation des Tumors Peripherie, die eine Beschädigung des umliegenden gesunden Gewebes verhindert immer noch einen bedeutenden Durchbruch und könnte damit bisher nicht resektablen Tumoren chirurgisch entfernt werden. Obwohl es Unterschiede zwischen in vivo Situation und der Gewebe-Nachahmung Hydrogele sind, sind die Phantome nützlich für das Verständnis der physikalischen Mechanismen von Ultraschall-enhanced Erhitzen mit PSNE, um die Ultraschall-Parameter für thermische Ablation optimieren. Dies sind wichtige Schritte für die Umsetzung die Verwendung von PSNE zur Verbesserung der Ultraschall-vermittelte Ablation aus dem Labor in die Klinik.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Arbeit wurde von einer BU / CIMIT Applied Healthcare Engineering-Promotionsstipendium, ein National Science Foundation eine stärkere Beteiligung Forschung Initiation Grant in Engineering (BRIGE) und den National Institutes of Health (R21EB0094930) unterstützt.