Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Мы описываем получения коллоидных квантовых точек с минимальным гидродинамическим размер одной молекулы флуоресцентной микроскопии. По сравнению с обычными квантовыми точками, эти наночастицы близки по размерам к глобулярных белков и оптимизированы для одной молекулы яркость, устойчивость против фотостарения, а также устойчивость к неспецифического связывания с белками и клетками.

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology ^1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.

Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation ⁵. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large ^4,6,7.

Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past ^8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed Hg_xCd_1-xSe core coated with an insulating Cd_yZn_1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, Hg_xCd_1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

Следующие процедуры синтеза включает стандартные воздуха без техники и использования вакуума / инертной газовой трубе; подробной методологии можно найти в ссылках 10 и 11. Бюллетени для всех потенциально токсичных и легковоспламеняющихся веществ необходимо проконсультироваться с использованием и все легковоспламеняющихся и / или воздушно-лабильные соединения должны быть аликвоты в перегородке-запечатанных флаконов в ящике для перчаток или перчатки сумки.

1. Синтез селенида кадмия ртути (Hg _х Cd _1-х Se) Quantum Dot сердечников

1. Подготовить 0,4 М раствор селена в trioctylphosphine (TOP). Добавить селена (0,316 г, 4 ммоль) в 50 мл 3-колбу, а затем эвакуировать и заполнить аргоном с помощью линии Шленка. В воздухе свободный условиях (сухого азота или аргона), добавить 10 мл TOP и тепла до 100 ° C при перемешивании в течение 1 часа, получая прозрачный, бесцветный раствор. Охладите раствор до комнатной температуры и установить колбу в сторону.
2. В 250 мл 3-колбу, добавляют оксид кадмия (CdO 0,0770 г, 0,6 ммоль), tetradecylphosphonic кислоты (TDPA, 0,3674 г, 1,32 ммоль) и октадецена (ОДУ, 27,6 мл), и эвакуировать решения с использованием линии Шленка при перемешивании. Увеличение температуры до 100 ° C и эвакуировать еще 15 минут для удаления низкокипящих примесей точки.
3. В атмосфере аргона или азота, нагреть смесь до 300 ° С в течение 1 ч до полного растворения CdO. Решение будет меняться от красноватого цвета с прозрачным и бесцветным. Охладите раствор до комнатной температуры.
4. Добавить гексадециламин (HDA, 7,0 г) к кадмию решение, нагреть до 70 ° C, и эвакуировать. После постоянного давления достигается, повышение температуры до 100-110 ° C и рефлюкс раствор в течение 30 мин. Переключение клапана Шленка линии инертного газа и вставить термопару непосредственно в раствор.
5. В воздухе без условий, добавить дифенилфосфина (DPP, 100 мкл) к решению и увеличить температуру до 310 ° C. Удалить 7,5 мл 0,4 М ТОП-Se решения(3 ммоль селен) в одноразовый пластиковый шприц прилагается к 16 иглы.
6. Как только температура в равновесие при 310 ° C, установить регулятор температуры до 0 ° C и быстро вводить ТОП-Se решение непосредственно в кадмий решение. Решение будет меняться от бесцветного до желто-оранжевого и температура быстро падает и снова вырасти до ~ 280 ° C. Через 1 мин реакции, снимите колбу с нагревательным кожухом и быстро прохладной струей воздуха до температуры ниже 200 ° C.
7. Когда температура достигает ~ 40 ° C, разбавляют 30 мл гексана, большинство из оставшихся предшественника кадмия осядет из раствора. Удалить этот осадок центрифугированием (5.000 мкг, 10 мин).
8. В каждой из шести 50 мл коническую трубку полипропилена центрифуги, развести 12 мл сырого раствора нанокристаллов с 40 мл ацетона, центрифуга (5.000 мкг в течение 10 мин), и осторожно сливают и отбросить супернатант.
9. Растворите nanocrystal гранул в гексане (25 мл общего объема). Извлеките этот раствор 3 раза с равным объемом метанола, сохраняя верхнюю фазу. Для третьего добычи, объем метанола может быть скорректирована до ~ 15 мл для получения концентрированного раствора гексана чистой КТ CdSe примерно 200 мкМ. Типичный выход из этой реакции составляет 3 мкмоль нанокристаллов CdSe диаметром 2,3 нм (50-60% выход реакции).
10. Определить диаметр нанокристаллов и концентрации путем измерения UV-Vis спектра поглощения и консультаций с размером облегающие схема Mulvaney и его коллеги ¹² и исчезновения корреляций Bawendi и сотрудников ^13. См. Приложение для деталей.
11. Mercury катионообменная: нанокристаллы могут быть частично обменивались с ртуть красного смещения спектров поглощения и флуоресценции. Смешайте следующие вместе с тем в 20 мл стеклянный флакон с stirbar (эта реакция может быть расширена по желанию): 3 мл гексана, 2 мл хлороформа, 1 мл 200 мкМ CdSe QD решения (200 нмоль), 15 мкл олеиламин (УПВ) и 500 мкл 0,1 М раствора Hg (OT) ₂ в хлороформе. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ могут быть получены путем взаимодействия ацетата ртути и octanethiol в метаноле (см. приложение). В качестве катион доходов обменной реакции, степень красного смещения можно контролировать с UV-Vis абсорбционной спектрофотометрии. После того, как желаемое полоса поглощения была достигнута, измерения поглощения раствора нанокристаллов при 350 нм и определить новый коэффициент экстинкции, предполагая, что концентрация нанокристаллов не изменилась (30,7 мкМ в этом примере). Quench реакции путем удаления непрореагировавшего ртути: добавить 5 мл декана, 10 мл гексана, и 7 мл метанола и извлечения решения, сохраняя верхнюю фазу, содержащую нанокристаллов. Извлечение в два раза больше гексаном и метанолом, и регулировать громкость метанола так, чтобы верхняя фаза ~ 7 мл. Если фазы медленного отделить, решение может быть центрифугировали (5000 мкг,10 мин). Добавить 100 мкл TOP 100 мкл УПВ, и 100 мкл олеиновой кислоты в нанокристаллы затем 40 мл ацетона, чтобы вызвать осадки. Сбор нанокристаллов с помощью центрифугирования и разогнать в 3-гексана мл. Центрифуга снова, чтобы удалить нерастворимые компоненты и определения концентрации нанокристаллов снова, используя новый коэффициент экстинкции при 350 нм. Разрешить решение нанокристаллов в возрасте не менее 24 часов при комнатной температуре, прежде чем переходить к следующему шагу.

2. Рост сульфида кадмия цинка (Zn Cd _{у 1-й} S) Shell

1. Подготовить 0,1 М решениях корпуса предшественника в 50 мл 3-горлую колбы. Кадмий предшественника: кадмия ацетата гидрата (230,5 мг, 1 ммоль) и 10 мл олеиламин (УПВ). Цинк предшественника: ацетат цинка (183,5 мг, 1 ммоль) и 10 мл УПВ. Сера предшественника: серы (32,1 мг, 1 ммоль) и 10 мл ОДУ. Под вакуумом, нагревать каждое решение с обратным холодильником в течение 1 часа, получая четкие решения, а затем взимать с аргоном. Сера решение можетбыть охлажден до комнатной температуры, но кадмия и цинка прекурсоров поддерживается на уровне 50 ° C. Расчет количества оболочки предшественника можно найти в работе 14.
2. Добавить к 3-колбу: Hg _х Cd _{1-X SE} КТ (120 нмоль, 2,3 нм в диаметре), ОДУ (2 мл), и trioctylphosphine азота (TOPO, 250 мг). Эвакуировать от гексана при комнатной температуре на линии Шленка. Увеличение температуры до 100 ° C и обратным холодильником в течение 15 мин. Изменение клапан Шленка линия аргон или азот и вставьте термопары в раствор нанокристаллов.
3. Повышение температуры до 120 ° C, добавляют 0,5 монослоя серы решения предшественника (140 мкл), и позволяют реакции протекать в течение 15 мин. Малые аликвоты (<50 мкл) могут быть удалены с помощью стеклянного шприца для контроля за ходом реакции с помощью флуоресцентной и / или UV-Vis абсорбционной спектрофотометрии. Повышение температуры до 140 ° C, добавляют 0,5 монослоя кадмия решение предшественника (140 мкл), и позволяют протекания реакции в течение 15 мин. Добавить 500 мкл безводного OLA к реакционному раствору.
4. При 160 ° С добавляют 0,5 монослоя серы решения предшественника (220 мкл) с последующим равным количеством цинка решение предшественника при 170 ° С 15 мин между каждым добавлением. Затем при температуре 180 ° C добавьте 0,25 монослоя серы решения предшественника (150 мкл) и цинка раствор предшественника интервалом в 15 мин.
5. Охладите раствор до комнатной температуры и снова вычислить новый коэффициент экстинкции для этих частиц с помощью UV-Vis спектре, предполагая, что число нанокристаллы не изменилось (120 нмоль в 3,8 реакционный раствор мл). Хранить реакции раствора в виде сырой смеси в морозильной камере; нанокристаллы могут быть разморожены и очищают по мере необходимости, используя тот же метод, описанный в разделах 1.8 и 1.9.
6. Нанокристаллы могут быть охарактеризованы с помощью электронной микроскопии, UV-Vis спектроскопии поглощения и флуоресцентной спектроскопии. Квантовый выход может бытьрассчитанный абсолютно использованием интегрирующей сферы или относительно, по сравнению с известными стандартными методами ведения 15.

3. Фазового перехода

1. Добавить очищенные ядро / оболочка Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й S КТ (5 мл, 20 мкМ) в 50 мл 3-колбу и удаления гексана в высоком вакууме с получением сухой пленки. Наполните колбу с аргоном, добавляют безводный пиридин (3 мл) к фильму наночастиц и тепла в суспензии до 80 ° C. В течение 1-2 часов наночастицы полностью растворяются.
2. Добавить 1-тиоглицерин (1 мл) к раствору и перемешивали при 80 ° C в течение 2 часов. Затем охлаждают раствор до комнатной температуры и добавляют триэтиламин (0,5 мл) для депротонирования тиоглицерин. Перемешать в течение 30 мин. Раствор мутнеет после добавления триэтиламина из-за плохой растворимости полярных нанокристаллов в этой смеси растворителей.
3. Передача QD раствора в 50 мл коническую трубку продолжение центрифугиaining смесь из 20 мл гексана и 20 мл ацетона, и хорошо перемешать. Изолировать осажденного нанокристаллов с помощью центрифугирования (5.000 мкг, 10 мин) и промыть осадок ацетоном.
4. Растворите QD гранул в ДМСО (5 мл) с ванной ультразвуком, а затем центрифуги (7.000 мкг, 10 мин), чтобы удалить возможные агрегаты. Определить концентрацию наночастиц от UV-Vis спектра поглощения. Это решение чисто КТ должны быть использованы в течение 3 часов, а поверхность тиолов может медленно окисляется в условиях окружающей среды в воздух.
5. Развести QD решение 10 мкм или менее с ДМСО и перенести в 50 мл колбу. Подготовить 5 мг / мл раствора тиолированного полиакриловой кислоты (синтез описан в приложении) в ДМСО. Добавить полимерный раствор (0,15 мг полимера на нмоль КТ) по каплям к QD решение при перемешивании и дегазации раствора при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Очистите КТ / раствор полимера с аргоном и тепла до 80 ° С в течение 90 мин. Затем охлаждают раствор до комнатной температурыг каплям добавляют равный объем 50 мМ борат натрия, рН 8. Перемешать в течение 10 мин.
7. Очищают КТ с помощью диализа (20 кДа отсечки) в 50 мМ борат натрия, рН 8, а затем сосредоточиться частиц с помощью центробежного фильтра (10 кДа обрезания). Определить концентрацию от UV-Vis спектра поглощения.

4. PEG покрытия

1. В 4 мл стеклянный флакон с stirbar, смешайте 1 нмоль КТ в боратного буфера с 40000 х молярный более 750 Da monoamino-полиэтиленгликоля (30 мг, 40 мкмоль). Если конкретные функциональные химические должна быть добавлена ​​к нанокристаллов (например, гидразид или малеимида), она может быть введена путем замены доли амино-ПЭГ с гетеробифункциональных амино-ПЭГ (30% молярной доли обычно хорошо работает). Разведите раствор нанокристаллов до 1 мкм с боратный буфер. Эта реакция может быть расширена по желанию.
2. Подготовка свежий раствор DMTMM (20 мг, 72 мкмоль) в ДМСО (144 мкл). Это решение может быть кратко нагревается иnder струей теплой водопроводной воды или погружается в ванну ультразвуком, чтобы полностью растворить DMTMM. Быстро добавить 25000 х молярный избыток этого 0,5 М раствора DMTMM (50 мкл) в КТ решения и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Повторите шаг 4,2 четыре раза для насыщения поверхности нанокристаллов с PEG. Наконец, добавьте 200 мкл 1 М Трис-буфера для гашения реакции и очистить нанокристаллов использованием диализ, центробежные фильтры, или ультрацентрифугирования.
4. Нанокристаллы могут быть проанализированы для монодисперсности, гидродинамический размер и заряд поверхности методом жидкостной хроматографии, электрофореза в агарозном геле, и флуоресцентной микроскопии. Для определения гидродинамических размер и распределение по размерам с использованием автоматизированной жидкостной хроматографии (GE AKTAprime Plus), использовать Superose 6 колонку, скорость потока 0,5 мл / мин с элюент PBS буфера и поглощения обнаружения при 260 или 280 нм. Сравнить раз наночастиц элюирования с тех стандартов молекулярной массы. Для агарозном геле электрофотографическихсопротивления, подготовить 0,5% агарозном геле в 50 мМ борат натрия буфером (рН 8,5) или 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,4), смешайте 1 мкм образцы с 10% глицерина и нагрузки в скважины, и работать на 100 В в течение 30 мин . Изображение нанокристаллов в геле с использованием УФ палочки рукой или УФ-просвечивания и для возбуждения флуоресценции. Чтобы изображение нанокристаллов на одном уровне молекул с помощью флуоресцентной микроскопии, развести частиц до 0,2 нМ в 10 мМ фосфатного буфера, падение 2,5 мкл раствора на стекло покровное, и осторожно поместите второй покровное в верхней части жидкого шарика распространяться пленки между покровные. Изображение поверхности связанных частиц с помощью высокой числовой апертуры объектива (в идеале, по крайней мере, 1,40) в любом эпифлуоресцентной или TIRF режиме при возбуждении на длинах волн 400-580 нм и электронно-умножение CCD камера. Точные параметры изображения будет варьироваться между микроскопии установки.

На рисунке 2 представлена ​​представитель спектры поглощения и флуоресценции для CdSe нанокристаллов, Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов после катионного обмена, и Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й нанокристаллы S после оболочку роста. Нанокристаллов CdSe есть основной квантовый выход флуоресценции около 15% (в том числе длинноволновой глубокие ловушки выбросов), но эта эффективность падает до менее чем 1% после обмена ртути, вероятно, из-за носителей заряда ловушек вводится через поверхностный атом нарушению ^9. Однако рост тонкой оболочки _у Cd Zn _1-й S повышает эту эффективность более чем на 70%, что в значительной степени сохраняется после передачи воды (50% является типичной). В отличие от нанокристаллов CdSe / _у Cd Zn _1-й S без ртути включения потерять значительную часть своих квантовый выход в воду, если толстая оболочка выросли. Таким образом, путем включения ртути в основных nanocrystaл, небольшой размер нанокристаллов может быть сохранена (см. TEM на рисунке 3) без потери яркости. Важно отметить, что укупорки с Cd _у Zn _1-й S сдвигает спектр в красной из-за утечки электронных носителей заряда в материал оболочки; этот сдвиг составляет около 20-30 нм ядра CdSe ^16, и увеличивается с увеличения содержания ртути в ядре (до 100 нм).

Использование 2-х ступенчатый фазовый переход в воде имеет решающее значение для получения однородного населения нанокристаллов, которые не требуют дальнейшего Размер сортировке, чтобы удалить кластеров и агрегатов. На первом этапе, нанокристаллы передаются в ДМСО с использованием 1-тиоглицерин, который вытесняет олеиламин на поверхности нанокристаллов. Тиоглицерин затем заменили линейную полидентатным полимера, в результате чего очень стабильные частицы с минимальным увеличением размера гидродинамических в результате органического покрытия (<4 нм ВКЛАДна гидродинамический диаметр). Гель-хроматограммы изображенный на рисунке 4а подтверждает, что размер похож на conalbumin (75 кДа), и после модификации с 750 Da амино-PEG, размер увеличен до всего лишь 12 нм, похож на антитела IgG . PEG модификации нейтрализует заряд поверхности, что подтверждается в электрофореза в агарозном геле эксперимента изображена на рисунке 4б. Мы регулярно использовать гель-хроматографии и гель-электрофореза для быстрого характеристика размера, распределения по размерам, и поверхностного заряда. Динамическое рассеяние света и дзета-потенциометрии также может быть использован, однако сечения рассеяния этих частиц сверхмалых очень мало, и мы обнаружили, что результаты от коммерческих документов, не воспроизводимые. Рисунке 5а эпифлуоресцентной микрофотография эти нанокристаллы, нанесенных на покровное стекло и возбуждении 545 нм видимый свет. Эти нанокристаллы легко O. bserved на одной молекуле уровне 30 кадров в секунду с электронно-умножение ПЗС-камеры рисунке 5б показывает, что число флуоресцентных частиц, наблюдаемых в каждом кадре колеблется с течением времени с непрерывным возбуждением, это связано с сочетанием мигать и фотодеградации . Мигает доминирует в первом ~ 7 минут до окислительного фотодеградации медленно становится очевидной.

Рисунок 1. Схематическое изображение процедуры синтеза наночастиц. (А) кадмия и селена прекурсоров реагировать генерировать CdSe нанокристаллов, которые рассматриваются с ртутью octanethiolate, вызывая частичный Cd → Hg катионообменная с получением Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов тройной сплав. Оболочка Cd _у Zn _1-й S затем выросла на ядре использования кадмия ацетат, ацетат цинка и серы. (Б) Как синтhesized, эти нанокристаллы покрыты неполярных органических лигандов (олеиламин). Для растворения этих частиц в водных буферах, лиганды заменить полидентатным лиганда полимер, который ковалентно связан с амино-PEG.

Рисунок 2. Оптические свойства Hg _х Cd _1-х Se / Zn Cd _у нанокристаллов _1-й S. (А) Поглощение (черный) и флуоресценции (красный) CdSe нанокристаллов ядер, Hg _х Cd _{1-X SE} ядра после катионного обмена, и Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й нанокристаллы S после оболочку роста . Спектры смещены для ясности (б) Спектры флуоресценции Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й S с разными относительными количествами включения ртути. Синий спектр изображен ядер с нулевым содержанием ртути (х = 0, CdSe).

Рисунок 3. Передачи электронного микроскопа (а) и распределение частиц по размерам (б) Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й S нанокристаллов, показывая средний диаметр ± стандартное отклонение 3,2 ± 0,6 нм.

Рисунок 4. Гидродинамическая характеристика Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й КТ S в водном растворе. (А) Размер исключение хроматограмме нанокристаллов покрытие полидентатным лиганда полимера до (красный) и после (синий) конъюгации с амино-PEG. Молекулярная стандартов белка веса указанных выше участков. (Б) агарозном гель-электрофореза эксперимент КТ в буфере бората натрия (рН ~ 8,5) до (слева) И после (справа) конъюгации с амино-PEG. Также отмечена стрелкой и полярность электродов указаны на правой, показывая, что до сопряжения нанокристаллов миграцию как анионные частицы и ПЭГилированный нанокристаллов электростатически нейтральным.

Рисунок 5. Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й S КТ адсорбированных на стекло покровное в фосфатный буфер, полученную с эпифлуоресцентной микроскопии. (А) QD изображение, полученное при 33 кадрах в секунду. Изображение 15 мкм х 15 мкм. (Б) количество флуоресцентных квантовых точек в поле зрения при непрерывном освещении в течение 20 мин с ртутные дуговые лампы с 545 нм (30 нм полосовой) возбуждения фильтра и 625 нм (20 нм полосовой) излучения фильтров и 100x 1,4 NA цели. Измерения от 3 поля зрения были усреднены в течение 20 мин при 12,5 кадра в секунду.

По сравнению с обычными CdSe квантовых точек, тройной сплав ртути _х Cd _{1-X SE} нанокристаллы могут быть настроены по размеру и длине волны флуоресценции самостоятельно. Размер первой выбранной в процессе синтеза нанокристаллов CdSe ядра, а длина волны флуоресценции выбран вторичной ртути катионообменная шаг, который существенно не изменяет размер нанокристаллов ^9. Важно, чтобы очищенная Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов для инкубации при комнатной температуре в течение по крайней мере за 24 часа до укупорки. Это позволяет некоторым слабо адсорбированные катионы ртути диффундируют в решетке нанокристаллов. Не позволяя этот процесс происходит, вторая полоса флуоресценции в ближней инфракрасной часто наблюдается в связи с гомогенной нуклеации HgS нанокристаллов от диссоциированных ионов ртути.

В примере, приведенном в этой работе, мы подготовили CdSe ядра размером около 2,3 нм, которые могут бытьнастроились флуоресценции между 550-800 нм после укупорки, изменяя количество ртути включены в основной решетки. С 2,5 монослоя оболочки, окончательный диаметр этих квантовых точек было около 3,2 нм, что существенно наименьший размер наночастицы, которые мы можем подготовить, который является одновременно достаточно photostable и достаточно ярким для одной молекулы томография (коэффициент экстинкции около 350000 М ^-1 см ^-1 при 400 нм и квантовым выходом около 50% в воде). Эти нанокристаллы существенно ярче и photostable, чем ранее описанные нанокристаллов с сопоставимыми размерами, которые излучают на этом спектральном диапазоне (например, CdTe, InAs, InP). Как и большинство флуорофоры, флуоресценция из этих частиц на одном уровне молекулы прерывистый (мигающий) ^5,6.

В некоторых случаях, это может быть выгодно использовать несколько больший нанокристаллов. При использовании большего CdSe нанокристаллов ядро, флуоресценция bandwiDTH уже, после обмена катиона ртути. Типичные флуоресценции ширина пика Hg _х Cd _1-х нанокристаллов Se с выбросом в 600-650 нм окна на 50-70 нм на 2,3 ядра нм и 40-50 нм для 3,2 нм ядрах. Таким образом, больше нанокристаллов позволяют больше возможностей для спектрального мультиплексирования. Кроме того, увеличение размера будет также увеличить сечение поглощения нанокристаллов. Увеличение толщины слоя CdS временной оболочке также увеличить яркость, а в дальнейшем продлить флуоресценции стабильность во время возбуждения. Размер CdSe ядра может быть увеличена просто увеличение продолжительности CdSe синтеза ядра, и контроль за эффективным размером через UV-Vis абсорбционной спектрофотометрии.

Мы обнаружили, что водная КТ, покрытые карбоновых кислот, склонных к неспецифической адсорбции клеток и белков, и что нейтрализация их сильный отрицательный заряд в физиологических буферов крitical для минимизации неспецифические взаимодействия ^17. В приведенных здесь примерах мы использовали короткие цепи ПЭГ для нейтрализации поверхностного заряда и поддержания стабильности в воде. PEG могут быть введены в основной цепи полимера либо до привязанности к КТ или после нанесения покрытия. Обе процедуры приводят к почти нейтральных частиц, но те первые покрытием с карбоксильными-полимерных существенно меньше, по-видимому в связи с улучшением полидентатным взаимодействия с поверхностью. Для полной нейтрализации поверхности с PEG, мы обнаружили, что повторный того карбоновой кислоты, активирующие агенты необходимо в связи с коротким периодом полураспада реактивных видов. Мы используем DMTMM на место чаще реагентов карбодиимида (например, EDC) благодаря улучшению стабильности DMTMM в хранении и за счет повышения эффективности реакции в воде ^18.

Наконец, важно отметить, что квантовые точки и много других типов нанокристаллов содержащиецитотоксических элементов ^5. Кадмий и ионы ртути может повлиять на нормальные процессы живых клеток и организмов и может быть канцерогенным ^19-21. Однако цитотоксичность обычных CdSe / ZnS нанокристаллов был широко изучен, и было сообщено, что надежно покрытие нанокристаллов со стабильными органическими лигандами не вызывают открыто цитотоксического ответа по сравнению с их составные элементы, просто потому, что их токсичные элементы эффективно поглощенных вдали от окислителей ^5. Кроме того, для одиночных молекул и обработки изображений, токсических эффектов маловероятно из-за чрезвычайно малых концентрациях, используемых для работы с изображениями (обычно от 1 нМ или менее), который на несколько порядков меньше, чем наступление обнаружены токсические эффекты (50-100 нм). Большинство из одной молекулы экспериментов осуществления КТ на сегодняшний день использовали коммерчески доступные CdSe / ZnS нанокристаллов, которые существенно больше, чем описано здесь. По минимизации пanocrystal размер, общее число поверхностных атомов на одну частицу, а общее количество токсичных атомов в частице значительно снижается, тем самым снижая общий потенциал для токсикологического воздействия. Включение ртути в нанокристаллических ожидается дальнейшее снижение токсичности потенциал, как двухвалентной ртути, как известно, менее токсичны, чем двухвалентное кадмия во многих типах клеток ^19-21.

Нет конфликта интересов объявлены.

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Hong Yi в Университете Эмори Основные микроскопии для визуализации комплексной электронной микроскопии. Эта работа была организована NIH гранты (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338, и 1K99CA154006-01).