Method Article
우리는 단일 분자 형광 이미징을위한 최소화 유체 역학적 크기 콜로이드 양자 점의 준비에 대해 설명합니다. 기존의 양자 점에 비해,이 나노 입자는 구형 단백질의 크기와 비슷합니다 및 단일 분자 밝기, photodegradation에 대한 안정성 및 단백질과 세포에 특이 현상 바인딩에 대한 저항에 최적화되어 있습니다.
단일 분자 이미징은 biomolecular 기능의 메커니즘을 이해하고 세포 생물학 1-4 기초 분자 행동의 공간과 시간적 이질성을 시각화를위한 중요한 도구입니다. 이미지의 관심 개별 분자를로, 일반적으로 형광 태그 (염료, 단백질, 구슬, 또는 양자 점)에 복합 및 epifluorescence 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 관찰합니다. 염료와 형광 단백질 수십 년 동안 형광 이미징의 의지가되는 것되었습니다 있지만, 자신의 형광 신호의 전체 손실되기 전에 관찰 몇 초 만에 항복, 개별 분자를 관찰 할 필요가 높은 광자 fluxes에서 불안정합니다. 라텍스 구슬 및 염료 표시된 구슬은 개선 신호 안정성을 제공하지만, deleteriously 연구 아래에있는 분자의 확산과 동작을 변경할 수 있습니다 획기적으로 큰 유체 역학적 크기의 비용. ntent는 "> 양자 점 (QDs)은이 두 문제가 정권 사이의 균형을 제공합니다.이 나노 입자는 반도체 재료로 구성되어 있으며 photodegradation 5 뛰어난 저항과 hydrodynamically 소형 크기 설계 할 수 있습니다. 따라서 최근 몇 년 동안 QDs 사용 설정에 역할을되었습니다 단일 분자 수준에서 복잡한 macromolecular 문제의 장기 관찰. 그러나 이러한 입자는 여전히 이러한 자신의 크기가 여전히 4,6 너무 큰 세포 세포질과 분열 neuronal 신경 등 사람들이 많은 분자 환경에서 장애 확산을 전시 할 수 발견되었습니다 , 7.
콜로이드 안정성, photostability, 밝기, 그리고 과거 8,9에 소형 QDs의 유틸리티를 방해 한 특이 현상 바인딩 오프셋을 균형하면서 최근 우리는 코어와 최소화 유체 역학적 크기 QDs의 표면 코팅을 설계했습니다. 이 문서의 목적은 입증하는 것입니다절연 카드뮴 Y 아연 1 Y S 쉘, 짧은 폴리에틸렌 글리콜과 수정 multidentate 고분자 리간드들과의 코팅 (코팅 합금 HG X CD 1-X 놈들이 코어 구성이 최적화 된 nanocrystals의 합성, 수정, 및 특성, PEG) 체인 (그림 1). 기존의 CdSe의 nanocrystals에 비해, HG X CD 1-X 놈들이 합금은 강화 된 세포의 신호 대 노이즈 비 세포 독성 눈에 보이는 파장의 여기에 붉은 색과 가까운 적외선 파장에서 형광, 형광의 큰 양자 수율을 제공합니다. Multidentate 폴리머 코팅 유체 역학적 크기를 최소화하기 위해 폐쇄와 평면 형태의 nanocrystal의 표면에 바인딩, 그리고 PEG는 세포와 분자에 특이 현상 바인딩을 최소화하기 위해 표면 전하를 중화. 최종 결과는 550-800 nm의 12 나노 미터 근처에있는 총 유체 역학적 크기 사이의 방출과 밝은 형광 nanocrystal입니다. 이들에많은 수용성 구형 세포의 단백질, 그리고 기존의 PEGylated QDs (25-35 nm 정도)보다 실질적으로 더 작은으로 보자 크기까지 다양합니다.
다음 합성 절차는 표준 공기 무료 기술과 진공 / 불활성 가스 매니 폴드의 사용을 포함, 자세한 방법론은 참조 10 호와 11 호에서 찾을 수 있습니다. 모든 잠재적 인 독성 및 가연성 물질에 대한 MSDS는 사용하기 전에 조언을해야하고 모든 가연성 및 / 또는 공기 불안정한 화합물은 글러브 박스 나 장갑 가방에 심장 - 밀봉 된 병에 aliquoted해야합니다.
1. 머큐리 카드뮴 셀렌의 합성 (HG X CD 1-X SE) 양자 도트 코어
2. 카드뮴 아연 황화물의 성장 (CD Y 아연 1-Y S) 쉘
3. 단계 전송
4. PEG 코팅
그림 2는 CdSe nanocrystals, 양이온 교환 후 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals, 그리고 HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 쉘 성장 후 1-Y S nanocrystals을위한 대표 흡수 및 형광 스펙트럼을 도시한다. 핵심 CdSe의 nanocrystals는 양자 15% 근처에 형광 수율 (긴 파장 깊은 트랩 방출 포함)하지만 효율성이 표면 원자 방해 구를 통해 소개 캐리어 트랩을 청구 할 가능성이 때문에 수은이 교환 한 후 1 % 미만으로 떨어되어 있습니다. 그러나 카드뮴 아연 Y 1 Y S의 얇은 껍질의 성장은 주로 물 (50 % 전형적인)로 전송 한 후 유지 70 % 이상,이 효율성을 향상. 두꺼운 껍질이 성장하지 않는 반면, 수은 설립없이 CdSe / CD Y 아연 1 Y S nanocrystals 물에서의 양자 수율의 실질적인 일부를 잃게됩니다. 따라서 핵심 nanocrysta에 수은을 통합하여나, nanocrystal의 작은 크기는 밝기를 희생하지 않고 (그림 3의 TEM 참조) 유지 될 수 있습니다. 이 변화는 CdSe 코어 16 20-30 nm의 주위에 있으며, 증가와, 그 카드뮴 Y 아연 1 Y S와 캡핑하면 쉘 소재로 전자 충전 사업자의 누출로 인해 빨간색으로 스펙트럼을 주던 있습니다하는 것이 중요합니다 (최대 100 나노 미터)의 핵심에서 수은 함량을 증가합니다.
물 2 단계 상 전송의 사용은 클러스터 및 집계를 제거하려면 정렬 추가로 크기를 요구하지 않습니다 nanocrystals의 균일 한 인구를위한 중요합니다. 첫 번째 단계에서, nanocrystals가 nanocrystal의 표면에 oleylamine을 displaces 1 thioglycerol를 사용하여 DMSO으로 전송됩니다. Thioglycerol는 다음 유기 코팅 (<4 nm의 contributi에서 발생하는 유체 역학적 크기 최소한의 증가와 함께 매우 안정적인 입자의 결과로, 선형 multidentate 폴리머로 대체됩니다유체 역학적 직경)를 선택합니다. 도 4a에 도시 된 크기 제외 크로마토 그램의 크기가 conalbumin (75 kDa)의 비슷되었음을 확인하고, 750 다 아미노 PEG로 변경 한 후, 크기는 약 12 nm의에 IgG 항체와 유사한 증가 . PEG 수정은 그림 4b에 도시 된 아가로 오스 겔 전기 영동 실험에서 확인 표면 전하를 중화. 우리는 정기적으로 신속하게 크기의 특성, 크기 분포, 그리고 표면 전하에 대한 크기 배제 크로마토 그래피와 겔 전기 영동을 사용합니다. 동적 광 분산 및 제타 potentiometry도하지만 산란이 ultrasmall 입자의 단면은 매우 작고, 우리는 상업 악기의 결과가 재현되지 사실을 발견 한 사용할 수 있습니다. 그림 5A 이러한 nanocrystals의 epifluorescence 현미경이 상에 증착 보여줍니다 유리 coverslip와 545 nm의 눈에 보이는 빛으로 흥분. 이러한 nanocrystals은 쉽게 O 아르. 전자 - 배가 CCD 카메라와 초당 30 프레임의 단일 분자 수준에서 bserved 그림 5b는 각 프레임에서 관찰 형광 입자의 수는 지속적으로 여진과 시간이 지남에 변동을 나타냅니다,이 점멸하고 photodegradation의 조합 때문입니다 . 산화 photodegradation 천천히 명백한되기 전에 점멸 첫 번째 ~ 7 분 동안 장악.
nanoparticle 합성 절차의 그림 1. 도식의 묘사. (가) 카드뮴과 셀레늄 전구체는 HG X CD 1-X 놈들의 3 원 합금 nanocrystals를 얻을 수 있도록 부분 카드뮴 → HG의 양이온 교환을 유도 수은 octanethiolate로 취급됩니다 CdSe nanocrystals을 생성하는 반응. 카드뮴 아연 Y 1 Y S의 쉘 그런 다음 카드뮴 아세테이트, 아연 아세테이트, 그리고 유황을 사용하여 핵심 성장하고 있습니다. (B) synt으로hesized이 nanocrystals는 무극성 유기 리간드 (oleylamine)으로 코팅되어 있습니다. 수성 버퍼에서 이러한 입자를 solubilize하려면 리간드는 covalently 아미노 PEG에 커플 링된다 multidentate 고분자 리간드와 대체됩니다.
그림 2. 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 1 Y S nanocrystals의 광학 특성. (A) 흡수 (검은 색)와 CdSe nanocrystal 코어의 형광 스펙트럼 (빨간색), HG X CD 1-X 놈들 코어 양이온 교환 후, 그리고 HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 쉘 성장 후 1-Y S nanocrystals . 스펙트럼은 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 수은 설립의 다른 상대적인 양 1-Y S의 명확성 (B) 형광 스펙트럼에 대한 오프셋입니다. 파란 스펙트럼은 제로 수은 함량 (X = 0, CdSe)와 코어를 도시한다.
그림 3. 전송 전자 현미경 (A) 및 (b) 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 1 Y S의 nanocrystals의 입자 크기 분포는 평균 직경 ± 3.2 표준 편차 ± 0.6 nm의을 보여줍니다.
그림 4. 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 수용액 1-Y S QDs의 유체 역학적 특성. (A) nanocrystals의 크기 제외 크로마토 그램은 아미노 PEG에 (파란색) 활용하기 전에 (빨간색)와 후 multidentate 고분자 리간드로 코팅. 분자량 단백질 표준은 플롯 위에 표시됩니다. 이전 나트륨 borate 버퍼에있는 QDs의 (B) 아가로 오스 겔 전기 영동 실험 (산도 ~ 8.5) (왼쪽아미노 PEG까지)과 후 (오른쪽) 활용. 잘은 음이온 입자와 PEGylated nanocrystals이 electrostatically 중성 그대로 활용하기 전에 nanocrystals 마이그레이션을 보여, 화살표 및 전극 극성 오른쪽에 표시됩니다가 표시되어 있습니다.
그림 5. HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 1 Y epifluorescence 현미경과 이미지로 인산 버퍼에 유리 coverslip에 adsorbed S의 QDs. (A) QD 이미지는 초당 33 프레임 획득하였습니다. 이미지는 15 μm X 15 μm이다. 545 나노 미터 (30 나노 미터 대역 통과) 여기 필터와 수은 아크 램프가있는 20 분 및 625 nm의 (20 나노 미터 대역 통과) 방출 필터 및 100x 1.4 NA 목표에 대한 지속적인 조명 중 한 시야 당 형광 QDs의 (B) 수입니다. 보기의 3 분야의 측정은 초당 12.5 프레임 20 분 이상 평균되었습니다.
기존의 CdSe 양자 점에 비해, 삼원 합금 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals는 크기와 독립적으로 형광 파장에서 조정 할 수 있습니다. 크기가 처음 CdSe nanocrystal 코어의 합성 중에 선택되어 있으며, 형광 파장은 실질적으로 nanocrystal 크기 9 변경하지 않는 보조 수은 양이온 교환 단계에서 선택됩니다. 그것은 정화 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals이 상한 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 배양 할 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 약하게 adsorbed 수은 양이온의 일부가 nanocrystal 격자로 확산 할 수 있습니다. 이 과정은 가까운 적외선에서 두 번째 형광 밴드 발생 할 수없이 자주 dissociated 수은 이온의 HgS nanocrystals의 균일 한 핵으로 인해 관찰된다.
이 작품에 표시된 예제에서, 우리는 할 수있는 2.3 나노 미터 가까운 크기 CdSe 코어를 준비핵심 격자에 포함 수은의 양을 변경하여 캡핑 후 550-800 nm의 사이 형광에 주목 해 주시기 바랍니다. 2.5 monolayer 쉘을 통해 이러한 QDs의 최종 직경은 본질적으로 우리는 단일 분자 이미징을 위해 충분히 photostable와 충분히 밝은 모두입니다 준비 할 수있는 작은 크기의 nanoparticle (350,000 근처 흡광 계수 M -1 cm입니다, 3.2 nm의 근처 400 나노 미터와 물 50 % 가까이 양자 수율에서 -1). 이러한 nanocrystals은 실질적으로 밝게하고이 스펙트럼 범위 (예 : CdTe, InAs, InP)을 통해 방출 비교 크기가 이전에 설명 nanocrystals보다 더 photostable 있습니다. 대부분의 fluorophores과 마찬가지로, 단일 분자 수준에서 이러한 입자의 형광은 (점멸) 5,6 간헐적입니다.
일부 응용 프로그램의 경우는 다소 큰 nanocrystals를 사용하여 도움이 될 수 있습니다. 큰 CdSe nanocrystal 코어, 형광 bandwi를 사용하여dth는 수은 양이온 교환 후 좁은입니다. 600-650 nm의 창에서 방출와 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals에 대한 일반적인 형광 피크 폭은 2.3 nm의 코어를위한 50-70 nm의와 3.2 nm의 코어에 40-50 nm의 수 있습니다. 따라서, 큰 nanocrystals는 스펙트럼 멀티플렉싱을위한 더 큰 용량을 사용할 수 있습니다. 또한, 크기를 늘리면 마찬가지로 nanocrystals의 흡수 단면이 높아집니다. CDS 중간 쉘 층의 두께를 증가하면 밝기를 증가하고, 더 여기 중에 형광 안정성을 연장합니다. CdSe 코어 크기는 CdSe 코어 합성 기간을 연장하고, UV-VIS 흡수 분광 광도법을 통해 효과적인 크기를 모니터링하여 간단하게 증가 될 수있다.
우리는 카르 복실 산으로 코팅 수성 QDs는 세포와 단백질 특이 현상 흡착 경향이있는 것으로 나타났습니다, 그리고 생리 버퍼에서의 강한 부정적인 요금의 중화는 CR입니다특이 현상의 상호 작용 17을 최소화하기위한 itical. 여기 예제에서, 우리는 표면 전하를 중화하고 물에 안정성을 유지하기 위해 짧은 체인 PEG를 사용했습니다. PEG는 QDs에 첨부하기 전이나 코팅 후에 폴리머 백본에 도입 할 수 있습니다. 절차 거의 중성 입자의 결과,하지만 복실 폴리머있는 사람 첫째 코팅 모두 표면의 개선 multidentate 상호 작용으로 인해 아마도, 실질적으로 작습니다. PEG를 갖춘 표면 중화를 들어, 카르 복실 산의 활성화 에이전트의 반복 또한 인해 반응성 종의 반감기 짧은에 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 때문에 향상된 스토리지에 DMTMM의 안정성 및 물 18에 개선 반응 효율로 인해 더 많은 일반적인 carbodiimide의 시약의 장소 (예 : EDC)에 DMTMM 사용합니다.
마지막으로, nanocrystals의 양자 점 및 다른 많은 종류가 포함되어 있습니다하는 것이 중요합니다세포 독성 요소 5. 카드뮴 및 수은 이온 살아있는 세포와 생물의 일반적인 프로세스에 영향을 미칠 수 있으며, 발암 19-21있을 수 있습니다. 그러나 기존의 CdSe / ZnS의 nanocrystals의 세포 독성이 널리 연구되었고 그 사람들의 독성 요소가 효율적으로 산화 대리인 멀리 격리 아르 단순히 때문에, 안정적인 유기 리간드와 견고 코팅 nanocrystals가 자신의 구성 요소에 비해 명백히 세포 독성 반응을 유도하지 않는 것이보고되었습니다 5. 또한, 단일 분자 이미징 응용 프로그램, 독성 효과는 감지 독성 효과 (50-100 NM)의 발병보다 더 작은 크기의 명령 이미징 (일반적으로 1 나노 미터 이하)에 사용되는 매우 작은 농도에 가능성 때문입니다. 날짜로 QDs을 구현하는 단일 분자 실험의 대부분은 상업적으로 이용 가능한 CdSe / 여기에 설명 된 것보다 실질적으로 큰 ZnS의 nanocrystals을 활용하고 있습니다. n을 최소화하여anocrystal 크기는 입자와 입자 당 독성 원자의 총 개수에 따라 표면 원자의 총 수는 실질적으로이를 toxicological 미치는 영향에 대한 총 잠재력을 감소 감소된다. nanocrystal에 수은의 결합은 이가의 수은이 많은 세포 유형 19-21에서 이가의 카드뮴보다 독성이 알려져있다으로 독성 가능성을 더욱 줄일 것으로 예상된다.
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
저자는 전자 현미경 영상에 모리 대학의 통합 현미경 코어에서 박사 홍콩 이순신 감사드립니다. 이 작품은 (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 및 1K99CA154006-01) NIH 교부금의 후원했다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
셀렌 | 시그마 - 알드리치 | 229865 | |
트라이-N-octylphosphine | Strem | 15-6655 | 97%, 순수한 공기 불안정 |
산화 카드뮴 | 시그마 - 알드리치 | 202894 | 높은 독성 : 사용주의 |
Tetradecylphosphonic 산 | PCI 합성 | 4671-75-4 | |
Octadecene | 알파 Aesar | L11004 | 기술 등급 |
Hexadecylamine | 시그마 - 알드리치 | H7408 | |
Diphenylphosphine | 시그마 - 알드리치 | 252964 | 발화 |
수은 아세테이트 | 시그마 - 알드리치 | 456012 | 높은 독성 : 사용주의 |
1 Octanethiol | 시그마 - 알드리치 | 471836 | 강한 냄새 |
올레산 | 시그마 - 알드리치 | W281506 | |
아연 아세테이트 | 알파 Aesar | 35,792 | |
아세테이트 하이드레이트를 카드뮴 | 시그마 - 알드리치 | 229490 | 높은 독성 : 사용주의 |
Oleylamine | 피셔 과학 | AC12954 | 공기 불안정 |
황 | 시그마 - 알드리치 | 344621 | |
Trioctylphosphine 산화 | Strem | 15-6661 | 99% |
피리딘 | VWR | EM-PX2012-6 | 무수의 |
Thioglycerol | 시그마 - 알드리치 | M1753 | 강한 냄새 |
Triethylamine | 시그마 - 알드리치 | 471283 | 무수의 |
투석 관 | 스펙트럼 연구소 | 131342 | 20 kDa의 차단 |
원심 필터 | Millipore | UFC801024 | 10 kDa의 차단 |
Monoamino-PEG | Rapp Polymere | 12 750-2 | 750 다 |
DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium 염화물 수화물 | 알파 Aesar | H26333 | |
AKTAprime 플러스 크로마토 그래피 시스템 | GE 헬스 케어 | ||
Superose 6 300분의 10 GL 크로마토 그래피 칼럼 | GE 헬스 케어 | 17-5172-01 | |
아가로 오스, OmniPur | VWR | EM-2120 | |
충수 수은 octanethiolate의 합성 : 천천히 1 octanethiol (. 3 EQ)와 실온에서 메탄올의 수산화 칼륨 (. 3 EQ)의 감동 솔루션에 수은 아세테이트 (1. EQ)의 메탄올 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 여과를 통해 수은 (II) octanethiolate의 침전물을 분리, 에테르와 메탄올 한 번으로 두 번 씻어하고, 진공 후 건조합니다. multidentate 폴리머의 합성 : 30 분에 아르곤과 150 ML 세 목이 술병과 거품의 25 ML의 dimethylformamide (DMF)에 polyacrylic 산 (1 G, 1773 다) 디졸브. 10 ML의 DMF의 cysteamine (374 MG, 4.87 mmol)의 무수 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 활발한 저어가있는 방 온도에서 천천히 무수 diisopropylcarbodiimide을 추가 (DIC, 30 triethylamine (170 μl, 1.22 mmol) 다음 분, 그리고 반응이 60에서 72 시간 동안 진행 할 수 있습니다 ° C. 이상 736 MG, 5.83 mmol) 반응을 해소하고, 실온에서 2 시간에 휘몰아 치기 (501 MG, 6.41 mmol) 메르 캅토 에탄올을 추가합니다. 회전 증발을 통해 DMF를 제거하고 얼음처럼 차가운 아세톤의 2시 1분 혼합물의 추가와 고분자 분리 : 클로로포름, 원심 분리 한 다음 있습니다. 디 에틸 에테르, 그리고 반복으로 다시 ~ 5 ML 무수 DMF, 필터에 고분자를 침전 분해. 아르곤에 따라 진공 및 매장에 따라 제품을 말린다. CdSe 코어 직경의 결정 : UV-VIS 흡수 스펙트럼에서의 긴 파장 피크 (예를 들면 그림 2A의 CdSe에 약 498 nm 정도)입니다 처음 exciton 피크 (λ, NM에서)의 파장을 결정하고,를 사용하여 Mulvaney와 동료 (12)의 곡선 크기 조정 :
CdSe nanocrystal 농도의 결정 : CdSe nanocrystals의 광학 명확한 솔루션의 배경 - 공제 UV-VIS 스펙트럼에서, 350 nm의 파장에서 흡수를 결정한다. 시리얼 dilutions는 광 흡수가 맥주의 법칙의 선형 범위 내에 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. nanocrystal 농도 (QD, M의가)에서 다음과 같은 방정식으로 nanocrystal 직경 (D, NM에서), 광학 흡수 값 (A 3sa) 및 큐벳 경로 길이 (L, cm에서)에 연결해에 의해 결정될 수있다 Bawendi와 동료 (13)의 경험적 상관 관계 : |
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