NADH флуоресценции изолированных бивентрикулярной рабочей Кролик сердца

Цель состоит в том, чтобы следить за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния изолированного сердца в рамках физиологических преднагрузки и постнагрузки давления. Бивентрикулярной рабочая модель сердца кролика представлен. Высокое разрешение пространственно-временной флуоресценции НАДН используется для контроля митохондриальных окислительно-восстановительное состояние эпикарда ткани.

Since its inception by Langendorff¹, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology². However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures³. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism^4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model^{7, 8}. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode⁸. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours⁸.

When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)^9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration¹² and provides a measure of mitochondrial redox state¹³. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions^{14, 15} and to monitor the progression of hypoxic conditions over time¹⁰.

The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution¹⁶ at 37 °C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left & right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350±25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460±20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.

1. Установка для исследования

1. Подготовьте четыре литра изменения Кребса Хензелайта ¹⁶ (в мМ: 118 NaCl, 3.30 KCl, CaCl 2,00 _2, 1.20 MgSO _4, 24,0 NaHCO _3, 1,20 KH ₂ PO _4, 10,0 глюкозы, 2,00 NaPyruvate, и 20,0 мг / л альбумина ). Решение должно быть подготовлено как можно ближе к началу эксперимента, как это возможно. РН должен быть скорректирован до 7,4 после стерильной фильтрации (размер пор: 22 мкм, Corning). Решение осмоляльность должна быть между 275 и 295 мОсм / кг.
2. Промыть все трубы и камеры рабочего сердце системы с очищенной водой. Запуск насосов, пока вся вода была удалена из системы.
3. Добавить целлюлозы мембранные фильтры (размер пор: 5 мкм, Advantec) в соответствии с каждой из перфузионного насоса (Langendorff перфузии насос, насос левого перфузии сердца и подходящий насос перфузия сердца).
4. Выполнение калибровки по двум точкам (0 и 60 мм рт.ст.) для каждого датчика давления.
5. Включите воду ванны. Нагретой оборотной воды ванны (Cole Palmer) используется, чтобы нагреть воду рубашкой труб и теплообменников. Перфузат предварительно подогревается в отдельной ванне (Oakton Instruments). Обе ванны устанавливаются для поддержания температуры раствора 37 ° C.
6. Включите насос для обеспечения циркуляции перфузат в замкнутом цикле. Перфузат проходит через оксигенаторы микрофибры (hemofilters) газом с 95% O ₂ и 5% CO ₂ на 80 кПа. Кислородсодержащие перфузат затем проходит через теплообменники сохранить его при температуре 37 ° C перед входом в сердце катетер.

2. Сердце Удаление

1. Начните с установки работающем сердце, чтобы система работала в режиме постоянного Langendorff давления. Установить давление аорты блок в пределах от 50 до 60 мм рт.
2. Обезболить кролика с внутримышечной инъекции кетамина (44 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). После того, как кролик седативные, фенобарбитала (50 мг / Kг) и гепарин (2000 U) внутривенно через предельную вены уха или боковой подкожной вены на внутренней стороне задних конечностей.
3. Когда кролик полностью не отвечают, как определено отсутствие боли рефлекс, грудной полости быстро открылась, перикард разрезается, аорта зажимается, а сердце и легкие вырезаны. На этом этапе легких следует, находящийся в сердце, чтобы помочь с выделением легочные вены.
4. Изолировать и вводить иглу аорты с диаметром 5 мм канюлю, который прилагается к шприц с 60 мл перфузат и 200 единиц гепарина. Закрепите аорты в канюлю размером шва шелком нуля и медленно нажимайте на шприц, чтобы очистить сердце кровью.

3. Бивентрикулярной катетеризации

1. Подключите сердца аорты блок работающем сердце системы. Предотвращение попадания воздуха в аорту, которая может привести к коронарной эмболии. Лучше всего прикрепить канюлю аорты блОка, приближаясь к аортальной разъем под косым углом и позволяет перфузат осторожно капать из разъема в канюли в то время как он прикреплен.
2. В то время как сердце перфузии в режиме постоянного Langendorff давления, удаления жира и соединительной ткани и найдите следующие суда: нижней и верхней полой вены, непарной вены, легочные артерии, легочные вены.
3. Перевязывать верхней полой вены. Разрежьте легочной артерии чуть ниже, где она разветвляется на правую и левую легочные артерии.
4. Группа всех остальных судов (легочные вены) между сердцем и легкими и перевязывать их все с помощью одного шва. Удалить легких.
5. Сокращение маленькое отверстие в углу ушка левого предсердия. Убедитесь, что LA наполнен перфузат. Вводить иглу Лос-Анджелеса, обеспечивая при этом канюля полностью заполнен перфузат в то время как она вставлена. Сшивать канюлю придаток Лос-Анджелесе.
6. Поверните налево со стороны насоса (насос № 2), чтобы обеспечить поток тОн левого предсердия. Установите давление предварительной нагрузки между 2 - 6 мм и отрегулировать ± 2 мм рт.ст., как определено расширение предсердия.
7. Включите сердце работающем сердце режим выключения насоса Langendorff (насос № 1).
8. На мгновение снижение аортального давления до 10 мм, а затем постепенно увеличивать его в пределах от 80 до 100 мм рт. Это позволит аортальный клапан открываться и работать, как при нормальных физиологических условиях. Конечное давление постнагрузки будет зависеть от сократимости ЛЖ. Он должен быть установлен на значение, которое составляет около 20 мм меньше, чем пиковое давление ЛЖ.
9. LV сердечного выброса может быть определено путем измерения скорости потока перфузат выхода аорты блока (мл / мин). Нормальный сердечный выброс составляет от 14,77 и 16,43 мл / мин на 100 г массы тела ¹⁷ и среднем 340 мл / мин в течение 2,2 кг кролика. Аортального давления должна быть похожа на сигнал давления показано на Рисунке 1.
10. Вводить иглу через РА яnferior полой вены. Убедитесь, что оба РА и канюли полностью заполнены перфузат и вставить канюлю, не допуская образования воздушных пузырей. Сшивать канюли в вену.
11. Включите правой стороны насоса (насоса № 3), чтобы обеспечить поток в правое предсердие. Установить давление примерно на 3 мм рт.
12. Убедитесь, что RV наполнен перфузат и вводить иглу легочной артерии. Убедитесь, что канюля полностью заполнен перфузат пока он не будет вставлен предотвращает образование воздушных пузырей. Сшивать канюли в легочную артерию.

4. Сигнал приобретения: давление, Монофазные потенциалы действия, и fNADH

1. После катетеризации бивентрикулярной завершена, аккуратно вставьте катетер датчик давления (Миллар) в аорту через аорту канюли. Осторожно навигации это прошлое аортального клапана и в LV. Мониторинг сигнала LV давление, чтобы обеспечить надлежащее расположение катетера. Например давления LV показанона рисунке 1.
2. Осторожно нажмите на монофазные электродный потенциал действия против желудочка эпикарда. Мониторинг сигнала для достижения соответствующих измерений потенциала действия. Незначительные артефакты движения в сигнал нормально.
3. Поместите электрод биполярный стимула на правое предсердие ходить по сердцу. В нашем протоколе, сердца были темп на длины циклов между 300 и 150 мс, что соответствует 200 и 400 ударов в минуту, соответственно.
4. Измерьте температуру поверхности эпикарда ЛЖ. Если исследование предполагает, что температура будет поддерживаться на уровне 37 ° С, затем поместить сердце в водяной рубашкой камеры сердца или погрузить сердце в нагретой ванне superfusate для поддержания постоянной температуры в сердце.
5. Установите CCD камера (Андор IXON DV860, 128x128 пикселей) и фокусировку так, что соответствующее поле зрения не наблюдается. Камера подключается к рабочей станции и изображения, полученные в 2 кадра в секунду использованием Андор SOLIS Softwaповторно.
6. Включите свет ртутной лампы до начала съемки. Свет направляется через возбуждение фильтр (350 ± 25 нм технологии Chroma) и в волоконно-оптических световодов (Horiba Jobin Yvon модель 1950-1M) для освещения поверхности сердца. Ослабление УФ-свет через световод мало. УФ-освещенности может быть также предусмотрено использование мощных светодиодных система, состоящая из светодиодных прожекторов (Mightex PLS-0365-030-S) и блок управления (Mightex SLC-SA04-US).
7. Выключите свет комнаты и свести к минимуму любой освещенности. Цель наконечники световода (или светодиодных прожекторов) на сердце, чтобы добиться равномерного освещения эпикарда. Излучаемого NADH флуоресценции (fNADH) проходит через фильтр излучения (460 ± 20 нм технологии Chroma) и изображено ПЗС-камеры.
8. Мониторинг fNADH изменения с течением времени, выбрав регион интерес использование изображений программное обеспечение. Выберите live-режиме обновления для контроля средней интенсивности пикселей в регионе ое интерес.
9. Сердце должно быть функционирует в рабочем режиме бивентрикулярной для получения соответствующего давления. fNADH уровней должна быть низкой и стабильной поверхности эпикарда, чтобы подтвердить достаточный коронарной перфузии. На данный момент в изучении конкретных экспериментальных протокола должны быть осуществлены для проверки гипотезы.
10. Когда исследование завершено, удалить сердце от системы и слить все перфузат. Промойте трубы системы и камеры с очищенной водой. Для планового обслуживания, система должна периодически промывать Mucasol решение или раствором перекиси водорода, по мере необходимости.

5. Автономная обработка изображения fNADH

1. Один из способов сравнить NADH данных (fNADH (I, J, T)) между экспериментов является нормализация каждой флуоресценции изображение при использовании эталонного изображения (fNADH (I, J, T ₀₎₎ из набора ^9, как показано в приведенном ниже уравнении . Еще один способ нормализовать NADH флуоресценции на плТуз небольшой кусочек стекла уранила в поле зрения до эксперимента ^{9, 18, ​​19.} Уранила стекло флуоресценции (450 - 550 нм) при освещении ультрафиолетовым светом, чтобы обеспечить сигнал, который может быть использован в качестве стабильного ссылки.

6. Представитель Результаты

Передняя и базальные виды бивентрикулярной рабочий подготовке сердце кролика показано на рисунке 1. Давления в левом желудочке измеряли с помощью навигации катетер датчик давления (Миллар SPR-407) мимо аортального клапана и в левый желудочек. Аорты, легочной артерии, левого желудочка и давление (ППЖ), показаны на рис 1С. Диастолическое LVP, как правило, от 0 до 10 мм рт. Минимальная диастолического давления в аорте составляет около 60 мм рт. Пик систолическое LVP зависит от давления наполнения (предварительная нагрузка или давление LA) и сократимостьи, оптимально, должно быть от 80 до 100 мм рт. Максимальное давление аорты и максимально LVP должны точно соответствовать, как показано на рисунке 1С.

Монофазные потенциалы действия (MAP) с быстрой фазы деполяризации и реполяризации фазы, характерные для кролика сердца показано на рисунке 1D. Карты могут быть записаны относительно легко из договаривающихся сердце, но, как правило, небольшие артефакты движения во время диастолы, как показано на рисунке 1D. Карты полезных для подтверждения успешного увлечения сердца (захват) во время стимуляции, а также может быть использован для измерения местных электрофизиологические изменения, связанные с ишемией или других острых возмущений. ЭКГ также может быть измерена путем погружения сердца в ванне с теплой superfusate и размещения электродов в ванне на левую и правую стороны сердца. Третий индифферентный электрод либо помещаются в ванну, от сердца, или присоединяется к аорте.ЭКГ будет представлена ​​информация о глобальных возбуждения и реполяризации процесс, который используется для оценки общей электрической функции и для выявления наличия ишемии.

fNADH изображений показывает изменения в митохондриальных окислительно-восстановительное состояние сердца, которое может быть использовано для измерения пространственно-временной прогрессии ишемического или гипоксического регионах. Для этого исследования, эпикарда fNADH была измерена для мониторинга изменений в окислительно-восстановительного состояния в течение трех стимуляции ставки на длины циклов (КЛ) 300, 200 и 150 мс. Средние значения fNADH из области интересов (красная коробка, рисунок 2) показывают, что базовые уровни fNADH увеличиваться длительность цикла сокращается. Когда ходил скорость близка к синусового ритма (CL = 300 мсек), базовый fNADH уровне относительно постоянной. Как длины цикла сокращается до 300 мс, базовый fNADH уровней увеличения, при этом наибольшее увеличение в кратчайшие CL (150 мс). Высокое разрешение изображения fNADH полной передней поверхностина 200 и 400 ударов в минуту показано на рисунке 3. fNADH уровне 200 ударов в минуту были постоянными и пространственно однородной. На 400 ударов в минуту, fNADH уровней значительно возросла во всем эпикарда. Значительная пространственная неоднородность наблюдается наибольший рост имеет место в регионах перегородки ПЖ и ЛЖ.

Сигнал fNADH колеблется с сокращением (движение артефакт), а частота колебаний соответствует частота сердечных сокращений (рис. 2). В бивентрикулярной катетеризации, основания сердца проводится на 4 канюли, которая помогает предотвратить раскачивание сердца во время сокращения. Таким образом, амплитуда колебаний всегда меньше, чем больше масштаб времени (5-10 сек) тенденции в fNADH, вызванных ишемией и гипоксией.

Рисунок 1. Типичные давления и монофазные потенциалы действия с изолированной бивентрикулярной рабочий раbbit сердце. А. Базальная вид на сердце показывает четыре канюли: 1, аорты, 2, легочной артерии, 3, левого предсердия и 4, в правом предсердии B. Передняя вид на сердце показывает левого желудочка (ЛЖ) и правого желудочка. (RV). С. давления представителя. Top: давления в левом желудочке (сплошная линия) и аортального давления (пунктирная линия). Внизу:. Давление в легочной D. представитель монофазные потенциалы действия. Сигнал выравнивается с давлением показан на панели C. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. fNADH визуализации изолированных бивентрикулярной рабочий кролика сердце. Top: мультфильм поля зрения (слева) и три fNADH изображения показано на рисунке. Соответствующая длина цикла стимуляции (CL) указан на каждом изображении.Регион представляет интерес для fNADH сигнала в нижней панели указывается красной рамкой. Кончик электрода монофазный потенциал действия видна справа от интересующей нас области. Эпикарда была освещена помощью ртутной лампы и световода, как показано на рисунке 5. Только эпикарда поверхности, окружающих область интереса был освещен нижний. Средняя fNADH для региона интерес, проявленный красный прямоугольник в верхней панели. Среднее увеличение fNADH с уменьшением длины цикла.

Рисунок 3. fNADH изображения полного передней поверхности изолированного бивентрикулярной рабочий кролика сердце. сердце темп из Армении в 200 ударов в минуту и 400 ударов в минуту. fNADH удалось сфотографировать (2 кадра в секунду, 128х128 пикселей с разрешением 0,4 мм), а освещал всю переднюю эпикарда с помощью двух мощных светодиодов (Mightex PLS-0365-030-S, 365 нм, 4% яntensity, 50 мВт).

Изолированной Langendorff перфузии сердце остается известный инструмент для изучения физиологии сердца ^2. Это особенно полезно при изучении нарушений сердечного ритма, особенно те, которые используют флуоресценции трансмембранного потенциала ^20. Преимуществом является то, что весь эпикарда изолированного сердца можно наблюдать ^{21, 22.} Еще одним преимуществом является то, что, в отличие от крови, перфузии с четким буферного раствора кристаллоидов не мешает флуоресценции. Ограничение в том, что техника Langendorff не очень хорошо подходит для исследования сердечной обмена веществ, которые часто требуют сердце для выполнения работ в рамках физиологических преднагрузки и постнагрузки давления.

Чтобы поднять значимость изолированных препаратов сердце метаболических исследований, Нили введены изменения в технику Langendorff для создания надлежащих левого желудочка (ЛЖ) преднагрузки и постнагрузки давление ^3.Эта модель известна как изолированное LV модель сердца рабочих и широко используется для изучения LV производительность и обмен веществ ^4-6. Сердце LV рабочая модель превосходит модели Langendorff для функциональной оценки, но он не обеспечивает надлежащим образом загружены правого желудочка (ПЖ). Demmy соавт. впервые сообщили бивентрикулярной модели (LV и RV), а изменение сердца LV рабочая модель ^{7, 8.} Они обнаружили, что ударный объем, сердечный выброс и давление развития улучшились в сердцах преобразован из рабочего режима в LV бивентрикулярной режим работы ^8. Правильно загружена RV также улучшает функцию перегородки, уменьшая ненормальный градиентов давления на перегородку. Бивентрикулярной рабочий сердца было показано, что поддержание аорты выход, легочный кровоток, средний аортального давления, среднего давления в легочной артерии, сердечный ритм и инфаркта АТФ и уровень креатина фосфата до 3 часов ^8. Бивентрикулярной рабочих исследований сердца обычно используют сердца птОМ мелких животных, таких как крысы и кролики, потому что сердечный выброс и необходимый объем перфузат намного меньше, чем для сердца крупных животных. Тем не менее, бивентрикулярной рабочих исследований сердца были проведены с использованием сердца свиней, собак и даже людей ^{23, 24.}

Метаболических спроса изолированных сердца бивентрикулярной режима работы значительно выше, чем у перфузии Langendorff. Важно, что перфузат решение обеспечить достаточное количество кислорода и метаболическим субстратом для поддержки бивентрикулярной функции сердца. Стандартный буфер кристаллоидных растворов, таких как Кребса-Хенселейта ^{16, 17, 25} или ^{26 Tyrodes, 27,} у кислорода растворимость выше, чем 5,6 мг / л Когда эти решения с газом карбогена (газ смесь 95% O ₂ и 5% CO ₂₎ и содержать соответствующие метаболические подложки (глюкоза, декстроза, и / или пируват натрия), они хорошо подходят для рабочего бивентрикулярной сердца бьются в нормеАль синус ставки (примерно 180 ударов в минуту для кроликов).

Метаболический увеличивается спрос на быстрый ритм и количество кислорода, растворенного в стандартной perfusates может быть не достаточно для полной поддержки бивентрикулярной работающем сердце сжимается, что при высоких скоростях. Кристаллоидные буферных растворов, содержащих эритроциты или смешанный с цельной крови были использованы в подготовке рабочих сердца обеспечивать достаточное наличие кислорода. Предыдущие исследования показали, что добавление эритроцитов Кребса Хензелайта улучшить рабочие функции сердца во время строгих протоколов стимуляции, а также снижает частоту фибрилляции желудочков ^16. Ограничение использования эритроцитов или смеси цельной крови является гемоглобин, который мешает световых волн, которые используются для флуоресценции ^13. Другие субстратов, таких как альбумин, также могут быть добавлены к перфузат решение продлить жизнеспособность сердца и уменьшения отека ^28.

В флуоресценции интенсивности возбуждающего света должна быть высокой и распределение света должно быть равномерным. Достижение равномерное освещение не всегда легко из-за кривизны поверхности эпикарда. В наших исследованиях мы fNADH изображения путем фильтрации света (350 ± 25 нм) с ртутной лампой. Раздвоенного оптоволоконного световода используется для направления ультрафиолетового излучения на поверхности эпикарда. Равномерное освещение может быть достигнуто путем соответствующего позиционирования двух наконечников производства. УФ светодиодных источников света также может быть использован, как мы показали на рисунке 3. Светодиодные источники являются относительно недорогими, так что несколько источников могут быть включены в системы визуализации. Светодиоды также можно циклически и выключается при высокой скорости синхронизации возбуждения светом с захвата изображения.

Фотообесцвечивания NADH должно быть сведено к минимуму ²⁹ за счет сокращения времени ткани освещения. Это может быть сделано на велосипеде освещение и выключается с помощью электронногоIC затвора и лампы или светодиодные системы освещения и управления. Если освещение синхронизировано с сердечным циклом, то fNADH захвата изображений может быть ограничено диастолы, что приведет к сокращению движения артефакт в флуоресценции. Освещение Trigging и получения изображений помощью давления сигнала, таких как давление Л.В., будет одним из способов сделать это.

В наших исследованиях мы обнаружили, что изменения в fNADH в единицу времени может быть больше 5 раз выше 400 ударов в минуту, чем на 200 ударов в минуту. Это означает, что быстрый ритм поднять окислительно-восстановительное состояние сердца. Так или иначе это связано с гипоксией или неспособность миоциты для окисления NADH в NAD + достаточно быстро, чтобы избежать накопления NADH еще вопрос без ответа.

Производительность бивентрикулярной работающем сердце препарата зависит от множества факторов. Одним из наиболее важных является создание соответствующего давления преднагрузки и постнагрузки, чтобы имитировать физиологическоеусловий, которые находятся под следствием. В частности, постнагрузку ЛЖ (аортального давления) должны быть скорректированы для представления системного давления. Если она слишком высока, LV не будет в состоянии преодолеть давление, в результате регургитации. Давление, которое слишком низко отрицательно скажется коронарной перфузии. Давление LV преднагрузку (давление в левом предсердии), также должны быть скорректированы обеспечить конечного диастолического объема, который подходит для экспериментальных протоколов.

fNADH изображений живых тканей является признанным способом флуоресценции ^13. Его применение в сердечной ткани было проиллюстрировано Барлоу и шанс, когда они сообщили поразительно высоте fNADH в региональном ишемической ткани после перевязки коронарной ¹⁴ судна. Их fNADH изображения были записаны на пленку с помощью камеры Fairchild осциллограф и УФ съемке со вспышкой. Coremans соавт. расширили это понятие помощью NADH флуоресценции / UV отражения отношение к измерениюе метаболическое состояние эпикарда Langendorff перфузии крови крыс сердца ^30. Videofluorimeter была использована для обработки изображений и данных, записанные с помощью видеокамеры. Позже, Шольц и соавт. использовали спектрограф и фотодиод массива для измерения средней fNADH с большой площадью LV. Такой подход снизил эффект эпикарда флуоресценции неоднородностей и локальные изменения в циркуляции при выявлении макроскопические связанные с работой изменения fNADH ^31. Этот подход похож на вычисление среднего уровня fNADH для региона, интерес для всех кадров данных fNADH изображения, как показано на рисунке 2. Как мы уже представлены в этой статье, современная технология обеспечивает высокую скорость ПЗС-камеры с цифровым управлением и мощными прожекторами УФ. Эти технологии позволяют пространственно-временной динамики fNADH и сердечного метаболизма для изучения многих новые перспективы. Относительно недорогой оптики и источник света делает еNADH изображений полезный аксессуар для обычных сердечных оптических систем отображения. ^{9, 32}

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа была поддержана грантом из NIH (R01-HL095828 к МВт Kay).