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Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.
Seit der Gründung von Langendorff 1, bleibt die isoliert perfundierten Herzen ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es wird jedoch nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die das Herz auf der Arbeit im Kontext der physiologischen Vor-und Nachlast Druck durchzuführen erfordern gut geeignet. Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 zu etablieren. Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Dieses Modell, jedoch nicht, eine richtig geladen rechte Ventrikel (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell als eine Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert 8 zu halten.
Bei der Untersuchung der metabolischen Wirkungen von myokardialer Verletzung, wie Ischämie, ist es oft notwendig, um die Position des betroffenen Gewebes zu ermitteln. Dies kann durch Abbilden erfolgen die Fluoreszenz von NADH (die reduzierte Form von Nikotinamidadenindinukleotid) 9-11, vor ein Coenzym in großen Mengen in den Mitochondrien. NADH-Fluoreszenz (fNADH) einen in der Nähe linear inverse Beziehung zu den lokalen Sauerstoffkonzentration 12 und liefert ein Maß für mitochondriale Redoxzustand 13. fNADH Bildgebung während hypoxischen ischämischen Zuständen und als Farbstoff-freies Verfahren verwendet worden, um hypoxischen Regionen 14, 15 zu identifizieren und um das Fortschreiten der Überwachunghypoxischen Bedingungen im Laufe der Zeit 10.
Das Ziel der Methode ist die mitochondriale Redoxzustand biventrikulären arbeiten Herzen während der Protokolle, die die Rate der Myozyten-Stoffwechsel verändern oder zu veranlassen Hypoxie oder erstellen Sie eine Kombination aus beiden zu überwachen. Herz aus weißen Neuseeland-Kaninchen wurden zu einem biventrikulären arbeiten Herzen System (Hugo Sachs Elektronik) angeschlossen und perfundiert mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Lösung 16 bei 37 ° C Aorten-, LV, Lungenarterie, und links und rechts atriale Drücke aufgezeichnet wurden. Die elektrische Aktivität wurde unter Verwendung eines monophasischen Aktionspotentials Elektrode. Um das Bild zu fNADH wurde Licht von einer Quecksilberlampe gefiltert (350 ± 25 nm) und verwendet, um das Epikard zu beleuchten. Emittierte Licht wurde filtriert (460 ± 20 nm) und abgebildet werden mit Hilfe einer CCD-Kamera. Änderungen in der epikardialen fNADH der biventrikulären arbeiten Herzen bei verschiedenen Herzfrequenzen werden vorgestellt. Die Kombination des Herzens Modell und fNADH Bildgebungbietet ein neues und wertvolles experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von akuten kardialen Pathologien im Zusammenhang mit realistischen physiologischen Bedingungen.
1. Einrichten für das Studium
2. Herz Exzision
3. Biventrikulären Kanülierung
4. Signalerfassung: Drücke, monophasische Aktionspotentiale und fNADH
5. Offline-Verarbeitung von fNADH Images
6. Repräsentative Ergebnisse
Front-und basalen Ansichten eines biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Herstellung sind in Abbildung 1 dargestellt. Die linksventrikuläre Druck wurde durch Navigieren eines Druckwandler Katheter (Millar SPR-407) an der Aortenklappe und in die linke Herzkammer. Aorten, Pulmonalarterie und linksventrikulären Druck (LVP) sind in 1C gezeigt. Diastolischen LVP ist in der Regel zwischen 0 und 10 mmHg. Die minimale diastolische Aortendruck beträgt etwa 60 mmHg. Systolische LVP ist abhängig von Fülldruck (die Vorspannung oder LA-Druck) und Kontraktilitätund optimalerweise zwischen 80 und 100 mmHg beträgt. Die maximale Aortendruck und maximale LVP sollte eng übereinstimmen, wie in 1C gezeigt.
Einphasige Aktionspotentialen (MAPs) mit einer schnellen Depolarisation und Repolarisation Phase, die typisch für Kaninchenherzen sind, werden in 1D gezeigt. MAPs können relativ leicht von einem öffentlichen Herzen aufgezeichnet, aber haben in der Regel kleine Bewegungsartefakte während der Diastole, wie in 1D gezeigt. MAPs sind nützlich für die Bestätigung erfolgreich Mitnahme des Herzens (capture) während der Stimulation und kann auch verwendet, um lokale elektrophysiologischen Veränderungen durch Ischämie oder anderen akuten Störungen zu messen. Ein EKG kann auch durch Eintauchen des Herzens in ein Bad von warmen Superfusat und Anordnen einer Elektrode in dem Bad auf der linken und rechten Seite des Herzens gemessen werden. Eine dritte indifferente Elektrode wird entweder in das Bad eingesetzt, vom Herzen oder an der Aorta.Ein EKG liefert Informationen über die globale Anregungs-und Repolarisation Prozess, der nützlich für die Bewertung des gesamten elektrischen Funktion und aufschlussreich für das Vorhandensein von Ischämie ist.
fNADH Bildgebung zeigt Veränderungen in der mitochondrialen Redox Zustand des Herzens, die verwendet werden, um die Raumzeit-Progression von ischämischen oder hypoxischen Regionen gemessen werden kann. Für diese Studie wurde epikardialen fNADH gemessen, um Veränderungen der Redox-Status während drei Stimulationsfrequenzen bei Zykluslängen (CLs) von 300, 200 und 150 ms zu überwachen. Durchschnittliche fNADH Werte aus einer Region of Interest (roter Kasten, Abbildung 2) zeigen, dass die Grundlinie fNADH Ebenen als die Zykluslänge verkürzt wird steigen. Wenn Stimulationsfrequenz liegt in der Nähe des Sinusrhythmus (CL = 300 ms) Baseline fNADH Niveau relativ konstant ist. Als Zykluslänge wird unterhalb von 300 ms, Baseline fNADH Ebenen Anstieg, wobei der größte Anstieg bei der kürzesten CL (150 ms) verkürzt. Hochauflösende fNADH Bildgebung des gesamten vorderen Flächebei 200 und 400 Schlägen pro Minute wird in Abbildung 3 dargestellt. fNADH Ebenen bei 200 bpm waren konstant und räumlich homogen. Bei 400 bpm, erhöht fNADH Ebenen im Wesentlichen durch das Epikard. Deutliche räumliche Heterogenität wurde mit den höchsten Zuwächsen, die innerhalb der septalen Regionen des RV und LV beobachtet.
Die fNADH Signal oszilliert mit Kontraktion (Bewegungsartefakte) und die Frequenz der Schwingung entspricht Herzfrequenz (Abbildung 2). In biventrikulären Kanülierung, wird die Basis des Herzens durch 4 Kanülen, die um das Herz an einem Schwingen während der Kontraktion zu verhindern hilft, gehalten. Daher ist Schwingungsamplitude immer weniger als jeder längeren Zeitskala (5-10 sec) Trends in fNADH, die durch Ischämie oder Hypoxie verursacht werden.
Abbildung 1. Typische Drücke und monophasischen Aktionspotentialen von einer isolierten biventrikulären arbeiten raBBIT Herzen. A. Basal Ansicht des Herzens, in die vier Kanülen: 1, Aorten, 2, Lungenarterie, 3, linke atriale und 4, das rechte atriale B. Vorderansicht des Herzens, in den linken Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel. (RV). C Repräsentative Druck. Top: linksventrikuläre Druck (durchgezogene Linie) und der Aortendruck (gepunktete Linie). Unten:. Pulmonalen Druck D. Repräsentative monophasischen Aktionspotentialen. Das Signal wird mit dem Druck in Panel C gezeigt ausgerichtet Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. fNADH Abbildung eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Oben: Eine Karikatur des Sichtfeldes (links) und drei fNADH Bilder angezeigt werden. Die entsprechende Pacing-Zyklus Länge (CL) für jedes Bild angezeigt.Die Region von Interesse für die fNADH Signal im unteren Bereich wird durch die rote Box gekennzeichnet. Die Spitze des monophasischen Aktionspotentials Elektrode auf der rechten Seite der Region von Interesse zu sehen. Das Epikard wurde beleuchtet mit dem Quecksilber-Lampe und Lichtleiter, wie in Abbildung 5 dargestellt. Nur der epikardialen Oberfläche rund um die Region von Interesse wurde beleuchtet. Unten: Durchschnittliche fNADH für die Region von Interesse angezeigt durch die rote Box in der oberen Abdeckung. Durchschnittliche fNADH steigt mit reduzierter Zykluslänge.
Abbildung 3. fNADH Bilder des vollen vorderen Oberfläche eines isolierten biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen. Das Herz war Tempo aus der RA bei 200 bpm und 400 bpm. fNADH abgebildet wurde (2 fps, 128x128 Pixel bei einer Auflösung von 0,4 mm), während die Beleuchtung des gesamten vorderen Epikard mit zwei Hochleistungs-LEDs (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).
Die isolierte Langendorff perfundierte Herz bleibt ein prominentes Werkzeug zur Untersuchung der kardialen Physiologie 2. Es ist besonders nützlich in Studien von Herzrhythmusstörungen, insbesondere solchen, die Fluoreszenz-Bildgebung der Transmembranpotential 20 zu verwenden. Ein Vorteil ist, dass die gesamte Epikard des isolierten Herzen 21, 22 beobachtet werden kann. Ein weiterer Vorteil ist, dass, im Gegensatz zu Blut, Perfusion mit einer klaren kristalloiden Pufferlösung nicht mit Fluoreszenz-Signale stören. Eine Einschränkung ist, dass die Langendorff-Technik nicht für die Untersuchung der kardialen Metabolismus, die oft das Herz, die Arbeit im Rahmen der physiologischen und Nachlast Druck durchzuführen gut geeignet.
Um die Relevanz von isolierten Herzen Vorbereitungen für metabolische Studien, Neely eingeführt Modifikationen an der Langendorff-Technik, um entsprechende linksventrikulären (LV) Vor-und Nachlast Druck 3 etablieren zu erheben.Das Modell ist als die isolierte LV Arbeits-Herz-Modell bekannt und wurde ausgiebig auf Leistung und Stoffwechsel LV 6.4 Studie verwendet. Der LV Arbeits Herz-Modell ist besser als die Langendorff Modell für funktionelle Auswertungen, aber es bietet keine ordnungsgemäß geladen rechten Herzkammer (RV). Demmy et al. ersten berichteten von einer biventrikulären Modell (LV & RV) als Modifikation des LV Arbeiten Herzmodell 7, 8. Sie fanden, dass das Schlagvolumen, Herzzeitvolumen, und der Druck in der Entwicklung von Herz-Modus zu arbeiten LV biventrikulären Arbeitsmodus 8 konvertiert verbessert. Ein ordnungsgemäß geladen RV verbessert auch die septalen Funktion durch Verminderung abnormalen Druckgradienten über der Scheidewand. Biventrikulären arbeiten Herzen hat sich gezeigt, Aorten-Ausgang, Lungen fließen, bedeuten Aortendruck, bedeuten pulmonalen Blutdruck, Herzfrequenz und myokardialen ATP und Kreatinphosphat Ebenen für bis zu 3 Stunden 8 zu halten. Biventrikulären arbeiten Herzen Studien verwenden in der Regel Herzen from kleine Tiere wie Ratten und Kaninchen, weil die Herzleistung und das erforderliche Volumen des Perfusat viel geringer als für Herzen von größeren Tieren sind. Allerdings haben biventrikulären arbeiten Herzen Studien durchgeführt, mit Herzen von Schweinen, Hunden und sogar Menschen 23, 24.
Die metabolischen Bedarf von isolierten Herzen in biventrikulären Arbeitsmodus ist wesentlich höher als die der Langendorff-Perfusion. Es ist wichtig, dass das Perfusat Lösung genug Sauerstoff und metabolischen Substrat biventrikulären Herzfunktion zu unterstützen. Standard-kristalloiden Pufferlösungen, wie Krebs-Henseleit-16, 17, 25 oder Tyrodes 26, 27 haben Sauerstofflöslichkeiten so hoch wie 5,6 mg / L. Wenn diese Lösungen mit Carbogen (ein Gas Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2) werden vergast und enthalten geeignete metabolischen Substrat (Glucose, Dextrose, und / oder Natriumpyruvat), sind sie geeignet für biventrikulären arbeiten Herzen schlagen in Normal Sinus Preise (ca. 180 bpm für ein Kaninchen).
Metabolische steigender Nachfrage für schnelle Rhythmen und die Menge an Sauerstoff in Standard Perfusaten gelöst möglicherweise nicht genug, um vollständige Unterstützung für eine biventrikuläre arbeiten Herz, das bei hohen schrumpft. Kristalloiden Pufferlösungen mit Erythrozyten oder gemischt mit Vollblut haben in der Arbeit Herzen Präparate verwendet worden, um ausreichend Sauerstoff Verfügbarkeit zu gewährleisten. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Hinzufügen Erythrozyten zu einer Krebs-Henseleit-Lösung der Verbesserung der Arbeitsbedingungen Herzfunktion während strenge Stimulation Protokolle und auch die Häufigkeit von Kammerflimmern 16. Eine Einschränkung der Verwendung von Erythrozyten oder Mischungen aus Vollblut ist, dass Hämoglobin wird Lichtwellenlängen, die für die Fluoreszenz-Bildgebung 13 verwendet werden. Andere Substrate, wie Albumin, kann auch gegeben, um Lösungen zu Herzen Perfusat Lebensfähigkeit zu verlängern und die Ödeme 28 steht.
Während der Fluoreszenz-Bildgebung die Intensität des Anregungslichts hoch sein sollte und die Lichtverteilung sollten einheitlich sein. Eine gleichmäßige Beleuchtung ist nicht immer einfach aufgrund der Krümmung der epikardialen Oberfläche. In unseren Studien haben wir Bild fNADH durch Filterung Licht (350 ± 25 nm) von einer Quecksilberlampe. Verzweigter Lichtleiter wird verwendet, um die UV-Licht auf der epikardialen Oberfläche zu leiten. Einheitliche Beleuchtung kann durch entsprechende Positionierung der beiden Ausgangs Aderendhülsen erreicht werden. UV-LED-Lichtquellen ebenfalls verwendet werden, wie wir in 3 gezeigt haben. LED-Quellen sind relativ billig, so dass mehrere Quellen könnten in ein bildgebendes System aufzunehmen. LEDs können auch geradelt werden ein-und ausschalten mit hohen Raten an Anregungslicht mit der Bildaufnahme synchronisiert werden.
Photobleichen von NADH sollte 29 durch Reduzierung der Zeit von Gewebe Beleuchtung minimiert werden. Dies kann durch Radfahren die Beleuchtung ein-und ausschalten mit einem Elektronenmikroskop durchgeführt werdenIC-Shutter und eine Lampe oder mit einer LED-Beleuchtungssystem und einem Controller. Falls die Beleuchtung mit dem Herzzyklus synchronisiert ist, dann fNADH Bildaufnahme kann der Diastole beschränkt werden, was Bewegungsartefakt in der Fluoreszenz-Signale zu reduzieren. Ausschaltpunkt Beleuchtung und die Bildaufnahme unter Verwendung eines Drucksignals, wie LV-Druck, wäre eine Möglichkeit, dies zu tun.
In unseren Studien haben wir festgestellt, dass Veränderungen in fNADH pro Zeiteinheit mehr sein kann als 5X höher bei 400 bpm als bei 200 bpm. Dies deutet darauf hin, dass schnelle Rhythmen der Redox-Zustand des Herzens zu erhöhen. Ob dies durch Hypoxie oder die Unfähigkeit von Myozyten, NADH zu NAD zu oxidieren verursacht + schnell genug, um die Akkumulation von NADH zu vermeiden, ist noch nicht geklärt.
Die Leistung eines biventrikulären Herz arbeitet Vorbereitung ist abhängig von mehreren Faktoren ab. Eine der wichtigsten besteht darin, geeignete Vor-und Nachlast Druck gesetzt, um die physiologische nachahmenBedingungen, die der Untersuchung sind. Insbesondere müssen die LV-Nachlast (Aortendruck) eingestellt werden, um systemische Druck vertreten werden. Wenn sie zu hoch ist, wird die LV nicht in der Lage, den Druck zu überwinden, was zu Aufstoßen. Der Druck, der zu niedrig ist, wirken sich nachteilig auf Koronarperfusion. Der LV Vorspanndruck (linken atrialen Druck) ebenfalls eingestellt, um eine enddiastolischen Volumen, die für das experimentelle Protokoll bereitzustellen.
fNADH Abbildung von lebenden Gewebes ist eine etablierte Art der Fluoreszenz-Imaging-13. Seine Anwendung auf Herzgewebe wurde von Barlow und Chance dargestellt, wenn sie von markanten Erhebungen fNADH innerhalb regional ischämischen Gewebe nach Ligatur eines Herzkranzgefäßes 14 berichtet. Ihre Bilder wurden auf fNADH Film mit einem Oszilloskop Fairchild Kamera-und UV-Blitzfotografie aufgezeichnet. Coremans et al. erweitert auf diesem Konzept mit der NADH Fluoreszenz / UV-Reflexion Verhältnis zu Messe der metabolischen Zustand des Epikard von Langendorff Blut-perfundierten Rattenherzen 30. Ein videofluorimeter wurde für die Bildgebung verwendet und Daten wurde mit einem Videorecorder. Später, Scholz et al. verwendet einen Spektrographen und der Photodiode Array durchschnittliche fNADH aus einem großen Bereich des LV zu messen. Dieser Ansatz reduziert die Auswirkungen der epikardialen Fluoreszenz Heterogenitäten und lokale Varianten im Umlauf, während enthüllen makroskopischen arbeitsbedingte Variationen fNADH 31. Dieser Ansatz ist ähnlich Computing durchschnittliche fNADH Ebenen für eine Region von Interesse in allen Frames eines fNADH Bilddatenstatz, wie in 2 dargestellt. Wie wir in diesem Artikel vorgestellt haben, bietet die heutige Technologie High-Speed-CCD-Kameras und digital gesteuerte Hochleistungs-UV-Strahlern. Diese Technologien ermöglichen die räumlich-zeitliche Dynamik der fNADH und Herz-Stoffwechsel in den Genuss vieler neuer Perspektiven untersucht werden. Die relativ geringe Kosten bei der die Optik und die Lichtquelle ist fNADH Bildgebung ein nützliches Zubehör für die konventionelle Herz-optische Mapping-Systeme. 9, 32
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der NIH (R01-HL095828 zu Kay MW) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemikalie | Firma | Katalog-Nummer | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911-500G | |
CaCl 2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
MgSO 4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
NaHCO 3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
KH 2 PO 4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968-500G | |
NaPyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256-25G | |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418-100G |
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