Стереотаксическая имплантация и внутричерепных

Мы описываем комплексный метод для точного, стереотаксической имплантации клеток человека глиобластомы мозга в мозг голым мышам и последующим последовательным В естественных условиях Визуализации для контроля роста и ответа на лечение результирующей ксенотрансплантатов.

Мультиформная глиобластома (GBM) является полноценным первичным раком мозга с медиана выживаемости только 14,6 месяцев у людей, несмотря на стандартные три-метод лечения, состоящий из хирургической резекции, послеоперационной лучевой терапии и химиотерапии темозоломида ^1. Новые терапевтические подходы, четко, необходимых для улучшения выживаемости пациентов и качество жизни. Разработке более эффективных стратегий лечения будет помогали животных моделях GBM, что повторять заболевания человека позволяют пока последовательного отображения, чтобы контролировать рост опухоли и ответ на лечение. В этой статье мы описываем нашу технику для точной имплантации стереотаксической био-imageable клеток GBM рака в головной мозг голым мышам в результате опухолевых ксенотрансплантатов, что повторять ключевые клинические особенности GBM ^2. Этот метод дает опухолей, которые являются воспроизводимыми и находятся в точных анатомических местах, позволяя в визуализации естественных условиях биолюминесцентного для серийного контроля внутричерепной рост ксенотрансплантатов и ответ на лечение ^3-5. Этот метод также хорошо переносится животными с низкой периоперационной заболеваемости и смертности.

А. дооперационном опухолевых клеток подготовки

1. Трансдукции U251 клетки глиобластомы с лентивирусов вектор экспрессии (pGreenFire, System Biosciences) стабильно экспрессируют ген люциферазы светлячка.
2. Эти клетки были выращены в 10 мл Модификация полной Дульбекко в среде Игла (DMEM), который состоит из DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина, стрептомицина, и 1% заменимых аминокислот в T75 культуре ткани колбу инкубации при 5% С0 ₂ и 37 ° C.
3. Выполните стандартную культуры клеток, начиная с мытья клеток с фосфатным буферным раствором (PBS), а затем trypsinizing.
4. Quench трипсина с полной DMEM, передавать решение в 50 мл коническую колбу и определяют концентрацию клеточного помощью счетчика Coulter.
5. Центрифуга собранных клеток в полной DMEM в течение 3 мин при примерно 3000 оборотов в минуту.
6. После центрифугирования аспирации изF средствах массовой информации, оставляя только осадок клеток в нижней части 50 мл коническую колбу.
7. Рабочие быстро, чтобы предотвратить клетки от высыхания, вновь приостановить клеток в объеме свежей полной DMEM для достижения желаемой концентрации 50000 клеток / мкл и трансфер в 2 мл стерильной флакон помещают на лед.
8. Клетки на льду должны быть кратко встряхивали на низком уровне примерно каждые 20 мин, чтобы предотвратить клеточную адгезию. Клетки могут быть безопасно использованы для имплантации внутричерепных до двух часов после размещения на льду.

B. Ортотопическая Имплантация ксенотрансплантата

1. Взвешивание обнаженной бестимусным NCr мыши (Nu / Nu), чтобы установить базовый, предимплантационной веса. Мы обычно выбирают мышей 6-10 недель с весом от 17 до 24 граммов.
2. 1 час перед имплантацией, предварительно лекарствами мышь с 5 мг / кг нестероидные противовоспалительные препараты мелоксикама с помощью подкожных инъекций для лечения послеоперационной боли и воспаления.
3. Anesthetizе животное с внутрибрюшинного введения кетамина / ксилазина смеси в дозе 140 мг / кг и 10 мг / кг соответственно.
4. Убедитесь, что мышь достаточно наркозом путем оценки спонтанной реакцией животного на ноги шнура. Если животное реагирует на ноги крайнем случае, задержать процедуру, пока анестезия может вступить в силу или рассмотреть вливание дополнительной анестезии (<25% от первоначальной суммы).
5. Подготовка наркозом мышь для позиционирования в Stoelting Цифровой Только для мыши стереотаксической платформа (Stoelting Inc), зацепив резца мыши зубов в укусе бар рыла фиксатор и ужесточение нос хомут на морду, обеспечивая при этом голова мыши на Уровень плоскости.
6. Передача сдержанной мыши, чтобы Stoelting платформы стереотаксической, настройка расположения животного, так что кончики уха баров на хвостовом конце ушного канала. После черепно-на-каудальном позиционирования животного была adjusТед, обеспечить укуса препятствием для стереотаксической рамы. Мышь должна быть покоится на отопление фирма пластиковые пластины (Harvard Apparatus) крепится с помощью ленты Stoelting платформы для обеспечения обратной связью регулирование температуры во время операции.
7. Отрегулируйте высоту уха баров по мере необходимости, а затем продвигать ухо баров в хвостовой части ушной канал, обеспечивая их так, что голова мыши в уровне плоскости и иммобилизованных на пальце ощупь. Тщательно отслеживайте признаки дыхательной недостаточности после размещения ухо баров. Ослабить и повторно положение, если животное находится в бедственном положении.
8. Вставьте смазывать кончик ректального датчика температуры подключены к TCAT-2DF регулятор температуры (Harvard Apparatus), чтобы контролировать температуру животного и обеспечить управление с обратной связью, чтобы нагревательный элемент расположен под мышь, чтобы поддерживать температуру тела животного при 36 ° С в течение процедуры.
9. Применение глазной мази для глаз, чтобы prèveNT сушки.
10. Применить бетадин решение верхней части головы мыши для дезинфекции разреза, избегая глаз.
11. Выполните ноги щепотку, чтобы подтвердить мыши находится в бессознательном состоянии, обеспечивая небольшое количество дополнительных кетамин / ксилазина (<25% от начальной дозы) в случае необходимости.
12. Очистите 0,45 мм заусенцев сверла (Stoelting), прикрепленной к дрели (Foredom Microdrill) с помощью алкоголя площадку, а затем стерилизовать сверло в стеклянный шарик стерилизатор (Germinator 500, CellPoint Scientific) в течение 15 сек, погружая только сверло в стерилизатор бисера.
13. Используя стерильный скальпель, сделать разрез 0,75 см в продольном направлении в середине головы простирается от уровня глаз каудально. Подтвердите визуализации брегмы.
14. Установите сверло держателя Stoelting платформы и поместить сверла (Foredom Microdrill) с 0,45 мм заусенцев сверла (Stoelting) в держатель сверла, закрепив его в этом положении.
15. Поместите сверло точно над тОн брегмы, а затем нулевым из X, Y, Z координаты цифровой дисплей стереотаксической. Переместить кончик сверла в положение 2 мм задняя и 1,5 мм сбоку от брегмы в правое полушарие головного мозга и буровых в череп животного с буровой Foredom, прокалывая только кости. Стерильным ватным тампоном может использоваться, чтобы аккуратно убрать края разреза для облегчения визуализации черепа.
16. Удалить сверло и сверло держатель из стереотаксической платформы.
17. Прикрепить Nanomite инжектор шприцевой насос (Harvard Apparatus) в стереотаксической платформы.
18. Снимите клетки от льда и либо мягко вихрь флакон, содержащий опухолевые клетки с короткими импульсами или слегка щелкнуть флаконе повторно приостанавливать клеток. Составьте 7 мкл клеточной суспензии через 30 размера 1 "длинные плоские иглы конические прикреплены к 10 мкл шприц (шприц Hamilton). Избегайте больших пузырьков воздуха в шприце. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в первые 6 мкл жидкости белыйич будет общем объеме вводится в мышь. Мелкие пузырьки воздуха в оставшихся 1 мкл не имеют никакого беспокойства. Избегайте повторных ничья окна клеточной суспензии, если можно свести к минимуму повреждения клеток.
19. Расположите загруженный шприца в шприц инжектор. Использование спиртом салфеткой, удалите все жидкости клеточной суспензии, которая появляется на кончике иглы, чтобы предотвратить загрязнение участка разреза с раковыми клетками, которые могут привести к опухоли растут в экстракраниальных пространстве.
20. Установить насос-форсунка для доставки 6,0 мкл при скорости 0,5 мкл / мин. 1 мкл суспензии клеток, оставшихся в шприце после имплантации гарантирует, что пузырьки воздуха, которые часто собирают в шприц не вводят в животное. Инъекции пузырьки воздуха может привести к фатальным воздушной эмболии.
21. Переход иглу шприца в отверстие заусенцев поддержания иглу строго перпендикулярно (90 градусов) к черепу. Как только игла прошла череп, из нуля координат,Точные на стереотаксической цифровой дисплей, а затем медленно продвигаться кончик иглы в течение 4 мин, пока не достигнет глубины 2,5 мм. Игла проходит через кору и часть задней гиппокампа. X, Y, Z координаты для стереотаксической имплантации были выбраны для создания сбоку расположена опухоль в пределах полушария, избегая повреждения важных структур мозга, таких как таламус и близость к желудочкам таким образом, снижая вероятность посеве спинномозговой жидкости с опухолевыми клетками , что может привести к нежелательным опухолей спинного мозга. Заднем месте по отношению к брегмы был выбран, чтобы уменьшить вероятность большого, местно-распространенной опухоли язвы на орбиту. Пауза с иглой на глубину в течение 2 минут, а затем инициировать имплантации клеток.
22. Во время имплантации, высушить черепа неоднократно с копьем губки микрохирургические, чтобы удалить опухоль содержащие жидкость, которая, возможно, кипятят из заусенцев отверстие воимплантация. Избегайте нарушения иглу с микрохирургической губки. Удаление этой жидкости должно снизить вероятность роста опухоли в экстракраниальных пространстве.
23. После инъекции завершен, оставить иглу в мозг в течение примерно 2 мин, а затем медленно извлеките иглу в течение 3-4 мин.
24. Ослабьте ухо баров и морду фиксатор и снимите мышь от стереотаксической аппаратуры.
25. Закройте заусенцев отверстие в черепе стерильным воском кости, сданные на хранение трения воск взад и вперед по заусенцев отверстие от деревянных конце стерильной ватным аппликатором. Продолжать применение костного воска, пока отверстие полностью герметична и кости сургучом заусенцев отверстие находится на одном уровне с соседними черепа.
26. Re приближенных краям разреза стерильным ватные тампоны и применять ветеринарные клей ткани, чтобы запечатать рану, стараясь избежать воздействия клея на глаза животного.
27. Наконец, поместите курсор мыши над грелку установить до 37 °C, пока животное приходит в себя. Передача животным вернуться к своей первоначальной клетки один раз мышью оповещения и реагирования.

C. Bioluminescent Imaging (BLI) по контролю за ростом опухоли и ответ на терапию

Краткая инструкция следить за биолюминесцентного изображений.

1. Anesthetize мышей, имплантированных опухолей в камере с 2% изофлурана и кислорода.
2. В то время как мыши под наркозом, вводят их подкожно или внутрибрюшинно 60 мкл D-люциферин соли калия разводят в PBS до концентрации 50 мг / мл.
3. Включите поток анестезии в нос конусов в биолюминесцентного сканеров и быстро передавать мышей к сканеру размещения их морды в носу конусами.
4. Позиция черных разделители между мышами ограничить кровотечение биолюминесцентного сигнала от опухоли с высокой интенсивностью сигнала на соседние опухоли намного ниже сигнала.
5. ИспользованиеПрограммное обеспечение живого образа, делать частые последовательного воздействия на общей продолжительностью до 30 минут после времени впрыска D-люциферин. Мы выступаем за установление Время экспозиции на "Авто", чтобы ограничить вероятность того, под или передержке изображения. Ни одна экспозиция должна быть> 5 мин.
6. Выполните повторить биолюминесцентного изображений через определенные промежутки времени. Серийный еженедельно изображение является разумным выбором для многих продольных эксперименты по проверке реакции на лечение.
7. После приобретения изображений, используйте Жизнь программу изображений программное обеспечение для анализа опухолей, опираясь области интереса (ROI) вокруг каждой опухоли в каждом изображении, приобретенных в ходе сессии биолюминесцентного изображений. Нанесите второй, меньший области, представляющие интерес для нижней стороны каждой мыши в каждом изображение в качестве фона области интереса, чтобы исправить биолюминесцентного сигнала опухоли в зависимости от степени фоновой интенсивности биолюминесценции сигнала. Мы предпочитаем использовать "Сияние" настройки, а не "Графы" в качестве выходногозначения для биолюминесцентного сигнала.
8. Экспорт ROI результатов в Excel и определить максимальную фон с поправкой на биолюминесцентного сигнала для каждой мыши.
9. Повторите биолюминесцентного изображений, как указано для последовательного контроля роста опухоли. В наших экспериментах, мы проводим еженедельные BLI. Мы предпочитаем определения максимального сигнала BLI для данного изображения сессии, принимая частые воздействия в течение 5 - 30 мин после введения D-люциферин.

D. Представитель Результаты

Это стереотаксической техники имплантации связано с успешным опухоли принять скоростью 90-100% и с низкой периоперационной смертности, которые, как правило, менее 5%. Риск непреднамеренных побочных эффектов является также низкая с этой техникой, в том числе таких осложнений, как посев спинного мозга от опухолевых клеток, имплантированных в желудочки, или экстракраниальных рост опухоли или от посева разрез с опухолевыми клетками или ненадлежащее закрытие отверстия заусенцевllowing внутричерепных опухолей расширить через отверстие в черепе.

EX VIVO анализа опухолевых ксенотрансплантатов продемонстрировали ожидаемые области гипоксии, повышение VEGF выражения и некроза. Флуоресцентная микроскопия для зеленого флуоресцентного белка (GFP) стабильно выразил нашего GBM линии клеток показало инфильтративный характер этих ксенотрансплантатов.

На рисунке 1 показаны результаты типичной успешной имплантации стереотаксической из GBM клеток в мозг мыши. Это Т2-взвешенных МРТ головного мозга сканирование мозга мыши осуществляется с 9,4 Тесла магнит 21 дней после имплантации с методикой, описанной здесь. Рисунок 1 показывает одну внимание опухоль в правом полушарии (контур в розовый) измерения 19 мм ³ что локализуется в точные координаты места имплантации.

На рисунке 2 показаны результаты визуализации с использованием биолюминесцентного технич iques описано здесь для группы из 10 мышей с имплантированными опухолями стереотаксически, которые были равномерно стратифицированную на основе максимальной интенсивности биолюминесценции сигнал, чтобы получить или облучения головы (4 х 4 Гр ежедневно фракции) или отсутствие лечения вообще. В этом эксперименте биолюминесцентного изображений показывает, что лучевая терапия подавляет пролиферацию имплантированных опухолей, в результате чего без увеличения обнаружить биолюминесцентного сигнала, в то время как сигнал существенно увеличивается в макете облученным контролем опухоли, из-за снят распространения раковых клеток.

Рисунок 1 (Video). Корональных МРТ участков головного мозга мыши содержащие U251 глиобластомы опухоли с контурного объема опухоли (в розовом). Сканирование проводилось с использованием спинового эха Т2 взвешенных протокол по 9,4 сканера Тесла. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

RE 2 "SRC =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
Рисунок 2. 10 мышей с имплантированными опухолями стереотаксически глиобластомы обрабатывали либо внешней лучевой терапии до 16 Гр за 4 фракции или отсутствием лечения. Мыши были обследованы с биолюминесцентного изображений до начала лечения и еженедельно после начала лечения. На графике представлены относительные биолюминесценции рассчитывается как среднее изменение раза, где кратное изменение определяется как отношение текущего максимального значения BLI предварительной обработке максимальное значение BLI.

Метод стереотаксической имплантации раковых клеток у мышей, описанные в этой статье воспроизводимо производит опухолей, которые достаточно резюмировать инфильтративный и быстрого роста картину клинического глиобластомы мультиформной ^{2, 6-8.} Этот метод особенно хорошо подходит для экспериментов стратификации мышей равномерно к разным группам лечения опухолей, где воспроизводимых сопоставимого размера и биологические свойства и в определенных анатомических местах желательно. Стереотаксической имплантации опухолевых клеток с использованием методов мы описываем должны быть легко достижимы большинство поступательной научно-исследовательских лабораторий ^7,9-11.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарны д-р Эндрю Холландер, Сара Дэвис, Ли Шуман, Тим Дженкинс, и д-р Сюй Xiangsheng за их квалифицированную помощь. Мы признаем, поддержка доктор Энн Кеннеди. BCB была поддержана на обучение радиационной биологии Грант C5T32CA009677. JFD была поддержана на карьеру Burroughs Wellcome премии за медицинской ученых (1006792). JLB была поддержана на SuperS грант (5 R25 CA140116-03). Мы хотели бы поблагодарить д-р Стив Хан которого поощрение и поддержка помогли сделать наши исследования возможности. Мы также хотели бы поблагодарить Университета Пенсильвании Nano-Bio интерфейса Center (NBIC) и д-р Деннис Дишер за поддержку и полезные замечания. Мы признаем, Малый фонда изображениями животных (SAIF) из университета Пенсильвании для использования их МРТ и оптический / Биолюминесценция Услуги Core. Эти методы были разработаны в рамках проектов, которые были при поддержке Национального института здоровья (RC1 CA145075 и K08 NS076548-01).