داخل الجمجمة وزراعة المجسم

وصفنا طريقة متكاملة لغرس ودقيقة المجسم من خلايا ورم أرومي دبقي الأشكال في أدمغة الفئران عارية والمسلسل لاحقة في الجسم الحي التصوير لمراقبة النمو والاستجابة للعلاج من الأعضاء المستمدة من الحيوانات الناتجة.

ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) هو عالي الجودة سرطان الدماغ الأولية مع بقاء متوسط ​​فقط 14.6 شهر في البشر على الرغم من العلاج ثلاثي طريقة القياسية التي تتكون من استئصال الجراحي، ما بعد الجراحة والعلاج الإشعاعي العلاج الكيميائي temozolomide ^1. هناك حاجة واضحة النهج العلاجي الجديد لتحسين بقاء المريض ونوعية الحياة. ويمكن ان يدعم تطوير استراتيجيات أكثر علاج فعال من نماذج حيوانية من أن ألخص GBM الأمراض التي تصيب البشر حتى الآن السماح التصوير المسلسل لمراقبة نمو الورم والاستجابة للعلاج. في هذه الورقة، ونحن لدينا لوصف أسلوب غرس المجسم الدقيق الحيوي imageable الخلايا السرطانية GBM في أدمغة الفئران عارية مما أدى إلى ورم الأعضاء المستمدة من الحيوانات أن ألخص المظاهر السريرية الرئيسية للGBM ^2. هذه الطريقة تعطي الأورام التي هي قابلة للتكرار وتقع في مواقع التشريحية الدقيقة في الوقت الذي تسمح في مجال التصوير bioluminescent الجسم الحي لرصد متسلسل داخلالجمجمة النمو طعم أجنبي والاستجابة للعلاجات ^3-5. وهذا الأسلوب أيضا جيد التحمل من قبل الحيوانات مع المراضة والوفيات المنخفضة المحيطة بالجراحة.

A. الخلايا السرطانية قبل العملية إعداد

1. تنبيغ ورم أرومي دبقي الأشكال U251 الخلايا مع ناقلات lentiviral التعبير (pGreenFire، نظام العلوم البيولوجية) للتعبير عن ثابت الجين وسيفيراز اليراع.
2. كانت تزرع هذه الخلايا في 10 مل من تعديل Dulbecco كاملة من المتوسطة النسر (DMEM)، التي تتألف من DMEM تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية في قارورة زراعة الأنسجة T75 تفرخ في 5٪ C0 ₂ و 37 ° C.
3. أداء معيار زراعة الخلايا، بدءا غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، يليه trypsinizing.
4. إخماد التربسين مع DMEM كاملة، نقل الحل لقارورة 50 مل المخروطية وتحديد تركيز الخلوية باستخدام عداد كولتر.
5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا تحصد في DMEM كاملة لمدة 3 دقائق في حوالي 3،000 دورة في الدقيقة.
6. بعد الطرد المركزي، نضح منو وسائل الإعلام ولم يبق إلا على بيليه من الخلايا في أسفل القارورة 50 مل المخروطية.
7. العمل بسرعة لمنع الخلايا من الجفاف، اعادة تعليق الخلايا في حجم DMEM كاملة جديدة لتحقيق التركيز المطلوب من 50،000 خلية / ميكرولتر ونقل إلى قارورة معقمة 2 مل توضع على الجليد.
8. وينبغي الخلايا على الجليد لفترة وجيزة vortexed على إعداد منخفض كل ~ 20 دقيقة لمنع التصاق الخلية. ويمكن استخدامها بأمان لخلايا زرع داخل الجمجمة ما يصل الى اثنين بعد ساعات من وضع على الجليد.

B. زرع طعم أجنبي مثلي

1. تزن عارية المجلس الوطني للمقاومة athymic الماوس (نو / نو) لإنشاء خط الأساس، قبل زرع الوزن. نختار عادة الفئران 6-10 أسابيع من العمر مع الأوزان بين 17 و 24 غراما.
2. 1 ساعة قبل الزرع، قبل مداواة الماوس مع 5 ملغ / كغ من meloxicam غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات عن طريق الحقن تحت الجلد لعلاج ما بعد الجراحة الألم والالتهاب.
3. Anesthetizه الحيوان حقنة داخل الصفاق مع مزيج من الكيتامين / زيلازين بجرعة 140 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم على التوالي.
4. تأكد من أن الفأر هو تخدير بما فيه الكفاية من خلال تقييم استجابة الحيوان من تلقاء أنفسهم إلى قرصة أخمص قدميه. إذا كان الحيوان يستجيب لقرصة أخمص القدمين، تأجيل إجراء التخدير حتى تصبح سارية المفعول أو تفكر في ضخ التخدير إضافية (<25٪ من المبلغ الأصلي).
5. إعداد الماوس تخدير لتحديد المواقع في الرقمية Stoelting فقط لمنصة المجسم الماوس (Stoelting شركة) من خلال تركيب الماوس، القواطع في شريط دغة من restrainer الخطم وتشديد المشبك الأنف على الخطم مع ضمان رأس الماوس، على طائرة المستوى.
6. نقل الماوس ضبط النفس إلى منصة المجسم Stoelting، وتعديل المواقع من الحيوانات بحيث نصائح من القضبان الأذن هي في نهاية الذيلية من قناة الأذن. وبمجرد الحيوان الجمجمة إلى الذيلية تحديد المواقع adjusتيد وتأمين شريط دغة إلى الإطار المجسم. يجب أن يستريح الماوس على لوحة التسخين شركة البلاستيك (هارفارد جهاز) مع تأمين الشريط إلى منصة Stoelting لتوفير التغذية المرتدة التي تسيطر عليها تنظيم درجة الحرارة أثناء الجراحة.
7. ضبط ارتفاع أشرطة الأذن عند الضرورة ومن ثم دفع قضبان الأذن في الجزء الذيلية من قناة الأذن، وتأمين لهم بحيث رئيس الماوس، هو في طائرة وثبتوا على مستوى مسة الإصبع. ترصد بعناية بحثا عن علامات على الضائقة التنفسية بعد وضع قضبان الأذن. تخفيف وإعادة الموقف إذا كان الحيوان هو في محنة.
8. إدراج غيض مشحم من تحقيق درجة حرارة الجسم متصلة تحكم درجة الحرارة TCAT-2DF (هارفارد جهاز) لمراقبة درجة حرارة الحيوان وتوفير السيطرة على ردود الفعل على لوحة التسخين وضعه تحت الماوس للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 36 ° C خلال الإجراء.
9. تطبيق مرهم للعين للعيون لpreveNT التجفيف.
10. تطبيق حل betadine إلى أعلى الرأس الماوس، لتطهير موقع شق، مع الحرص على تجنب العينين.
11. أداء قليل اصبع القدم لتأكيد الماوس فاقد الوعي، وتقديم كمية صغيرة من الكيتامين إضافية / زيلازين (<25٪ من الجرعة الأولي) إذا لزم الأمر.
12. تنظيف الحفر 0،45 مم لدغ بت (Stoelting) تعلق على الحفر (Foredom Microdrill) باستخدام لوحة الكحول وتعقيم ثم قمة الحفر في التعقيم حبة الزجاج (Germinator 500، CellPoint العلمية) لمدة 15 ثانية، تخبط فقط لقمة الحفر في جهاز التعقيم الخرز.
13. باستخدام مشرط معقم، وجعل شق طولي 0.75 سم في منتصف فروة الرأس يمتد من مستوى العينين نحو caudally. تأكيد التصور من bregma.
14. إرفاق حامل الحفر إلى منصة Stoelting ووضع الحفر (Foredom Microdrill) مع قليل مم 0،45 الحفر لدغ (Stoelting) في حامل الحفر، وتأمين في الموقف.
15. ضع قمة الحفر بالضبط على رانه bregma ثم صفر خارج X، Y، Z إحداثيات العرض المجسم الرقمي. نقل غيض من الحفر إلى مم 2 موقف الخلفي والجانبي 1.5 مم إلى bregma في نصف الكرة المخية اليمنى والحفر في الجمجمة الحيوان مع الحفر Foredom، وثقب فقط العظام. ويمكن استخدام ممسحة قطنية معقمة لسحب بلطف حواف الجرح لتسهيل التصور من الجمجمة.
16. إزالة الحفر والحفر حامل من منصة المجسم.
17. إرفاق مضخة محقنة Nanomite حاقن (هارفارد جهاز) إلى منصة المجسم.
18. إزالة الخلايا من الجليد وإما دوامة بلطف القارورة التي تحتوي على الخلايا السرطانية مع نبضات قصيرة أو نفض الغبار بلطف القارورة لاعادة تعليق الخلايا. رسم بنسبة 7 ميكرولتر من التعليق الخلية من خلال مقياس لمدة 30 1 "إبرة طويلة شطبة شقة تعلق على حقنة 10 ميكرولتر (هاميلتون الحقنة). تجنب فقاعات الهواء الكبيرة في المحقنة. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في 6 ميكرولتر الأولي من السوائل WHوسوف يكون التراث الثقافي غير المادي إجمالي حجم حقنها في الماوس. فقاعات الهواء الصغيرة في ميكرولتر 1 المتبقية من أي قلق. تجنب تكرار التعادل المنبثقة من التعليق الخلية إذا أمكن للحد من الأضرار التي لحقت الخلايا.
19. وضع حقنة تحميلها في حقنة حاقن. باستخدام لوحة الكحول، وإزالة أي من الخلية السوائل التعليق الذي يظهر في رأس الإبرة لمنع التلوث من موقع شق مع الخلايا السرطانية التي قد تؤدي إلى الورم المتزايد في الفضاء خارج القحف.
20. تعيين مضخة حقن لتسليم 6،0 ميكرولتر بمعدل قدره 0.5 ميكرولتر / دقيقة. وميكرولتر 1 من التعليق الخلية المتبقية في المحقنة بعد زرع يضمن أن لا يتم حقن فقاعات الهواء التي تجمع كثير من الأحيان في المحقنة إلى الحيوان. يمكن حقن فقاعات الهواء يؤدي إلى انسداد الطيران المميتة.
21. دفع إبرة حقنة في حفرة لدغ الحفاظ على الإبرة عمودي (90 درجة) في الجمجمة. مرة واحدة وقد اجتاز الإبرة الجمجمة، صفر خارج coordinأتيس على شاشة رقمية المجسم ثم تقدم ببطء غيض من إبرة على مدى فترة من 4 دقائق حتى تصل إلى عمق 2.5 ملم. الإبرة يمر عبر القشرة وأجزاء من الحصين الخلفي. تم اختيار X، Y، Z إحداثيات لزرع المجسم لتوليد الورم وضعه أفقيا داخل نصف الكرة المخية مع تجنب إصابة الدماغ الهياكل الحساسة مثل المهاد وقربها من البطينين وبالتالي تقليل احتمال زرع البذور في السائل النخاعي مع الخلايا السرطانية التي قد تؤدي إلى أورام العمود الفقري غير مرغوب فيها. وقد تم اختيار موقع الخلفي نسبة إلى bregma للحد من احتمال وجود ورم، متقدمة محليا متقرح كبيرة في المدار. وقفة مع إبرة في عمق لمدة 2 دقيقة ثم الشروع في غرس الخلايا.
22. خلال زرع، تجف الجمجمة مرارا وتكرارا مع المجهرية الرمح الإسفنج لإزالة أي ورم السوائل المحتوية التي قد رجع من ثقب لدغ خلالالتوطين. تجنب تعطيل الإبرة المجهرية مع الاسفنجة. يجب إزالة هذا السائل يقلل من احتمالات ورم متزايد في الفضاء خارج القحف.
23. بعد اكتمال حقن، وترك الإبرة في الدماغ لحوالي 2 دقيقة ثم سحب الإبرة ببطء على مدى فترة من دقيقة 3-4.
24. تخفيف قضبان الأذن وrestrainer خطم وإزالة الماوس من الجهاز المجسم.
25. أودعت إغلاق ثقب في الجمجمة لدغ بالشمع العظام معقمة عن طريق فرك الشمع جيئة وذهابا عبر الفتحة لدغ من نهاية قضيب خشبي من القطن ذات الرؤوس العقيمة. مواصلة تطبيق الشمع العظام حتى يتم اغلاق الثقب تماما وختم الشمع العظام الثقب لدغ هو تدفق مع الجمجمة المجاورة.
26. إعادة تقريب حواف الجرح بقطعة قطن معقم وتطبيق الغراء النسيج البيطرية لختم الجرح، مع الحرص على تجنب التعرض لعيون الغراء الحيوان.
27. وأخيرا، ضع الماوس على وسادة التدفئة تعيين إلى 37 °C حتى يسترد وعيه الحيوان. نقل الحيوانات إلى قفص الأصلي بمجرد أن الفأر هو في حالة تأهب والاستجابة.

C. Bioluminescent التصوير (BLI) لمراقبة نمو الأورام واستجابة للعلاج

اتبع تعليمات موجزة للتصوير bioluminescent.

1. تخدير الفئران مزروع من قبل مع ورم في غرفة مع 2٪ isoflurane والأكسجين.
2. في حين أن الفئران هي تخدير، إما ضخها تحت الجلد أو الغشاء البريتونى مع 60 ميكرولتر من ملح البوتاسيوم D-وسيفيرين مخففة في PBS إلى تركيز 50 ملغ / مل.
3. بدوره على تدفق التخدير لالمخاريط الأنف في الماسح الضوئي التصوير bioluminescent ونقل بسرعة الفئران لوضع الماسح الضوئي في الخطوم المخاريط الأنف.
4. وضع فواصل بين الفئران السوداء للحد من النزيف إشارة bioluminescent من ورم مع كثافة عالية إشارة إلى الورم المجاورة مع إشارة أقل من ذلك بكثير.
5. باستخدامالبرنامج صورة حية، واتخاذ التعرض المتكرر المسلسل لمدة إجمالية تصل إلى 30 دقيقة بعد وقت حقن D-وسيفيرين. ونحن نؤيد تحديد وقت التعرض إلى "تلقائي" للحد من احتمال وقوع الصورة تحت أو فوق المكشوفة. لا ينبغي لاحد أن يكون التعرض> 5 دقائق.
6. أداء تكرار التصوير على فترات مناسبة bioluminescent. التصوير الأسبوعية المسلسل هو خيار معقول للتجارب طولية العديد من اختبار الاستجابة للعلاج.
7. بعد الحصول على الصور واستخدام البرنامج صورة حية برنامج لتحليل الأورام عن طريق رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول كل ورم في كل صورة المكتسبة خلال الدورة bioluminescent التصوير. تطبيق الثاني، أصغر المنطقة التي تهم أقل الجناح من كل الماوس في كل صورة كمنطقة خلفية تهم تصحيح إشارة bioluminescent الورم يعتمد على درجة كثافة الخلفية إشارة bioluminescent. نحن نفضل استخدام "التألق" الإعداد بدلا من "التهم"، كما خرجقيم إشارة bioluminescent.
8. تصدير النتائج إلى Excel ROI وتحديد الحد الأقصى الخلفية المعدلة حسب إشارة bioluminescent لكل الماوس.
9. تكرار التصوير على النحو المبين bioluminescent لرصد المسلسل من نمو الورم. في تجاربنا، ونحن أداء BLI الأسبوعية. نحن نفضل تحديد إشارة BLI القصوى لجلسة التصوير التي قدمها مع التعرض المتكرر أكثر من 5 - 30 دقيقة بعد حقن D-وسيفيرين.

D. الممثل النتائج

ويرتبط هذا الأسلوب زرع المجسم مع معدل الورم اتخاذ الناجح ل90-100٪ وفيات مع انخفاض المحيطة بالجراحة التي هي أقل من 5٪ عادة. خطر الآثار الجانبية غير المقصودة هي أيضا منخفضة مع هذه التقنية، بما في ذلك مضاعفات مثل البذر من الحبل الشوكي من الخلايا السرطانية المزروعة في البطينين، أو نمو الورم خارج القحف من البذر إما للشق مع الخلايا السرطانية أو إغلاق كافية من الحفرة لدغ لالنماذج التالية ورم داخل الجمجمة لتوسيع طريق فتحة في الجمجمة.

أظهرت السابقين فيفو تحليل الورم من الأعضاء المستمدة من الحيوانات المناطق المتوقعة لنقص الأكسجة، وزيادة التعبير VEGF، ونخر. كشف المجهر الفلورسنت للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) عن ثابت عن طريق خلية لدينا خط GBM طبيعة هذه الارتشاحي الأعضاء المستمدة من الحيوانات.

ويظهر الشكل 1 نتائج زرع ناجحة المجسم نموذجية من الخلايا في الدماغ GBM على فأرة الحاسوب. هذا هو مسح الدماغ بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة لأداء مخ الفأر مع المغناطيس تسلا 9.4 21 يوما بعد زرع مع هذه التقنية الموصوفة هنا. الشكل 1 يكشف التركيز واحدة من ورم في النصف الأيمن (احيط باللون الوردي) قياس 19 مم ³ أن يموضع إلى تحديد دقيق لإحداثيات موقع التوطين.

ويبين الشكل 2 نتائج التصوير bioluminescent باستخدام ميتاليك وصف iques هنا للحصول على مجموعة من 10 الفئران مع أورام مزروع stereotactically الذين كانوا بالتساوي الطبقية على أساس الحد الأقصى كثافة إشارة bioluminescent لتلقي إما التشعيع القحفي (4 × 4 جراى الكسور يوميا) أو أي علاج على الإطلاق. في هذه التجربة، تبين أن التصوير bioluminescent العلاج الإشعاعي يمنع انتشار الأورام مزروع، مما أدى إلى حدوث زيادة في إشارة bioluminescent الكشف، في حين أن زيادة كبيرة في إشارة الأورام تحكم همية المشع، وذلك بسبب انتشار دون رادع من الخلايا السرطانية.

الشكل 1 (فيديو). أقسام التصوير بالرنين المغناطيسي الاكليل من مخ الفأر يحتوي على الورم ورم أرومي دبقي الأشكال U251 مع الكنتوري من حجم الورم (باللون الوردي). تم إجراء مسح باستخدام بروتوكول تدور صدى المرجح T2 على الماسح الضوئي تسلا 9.4. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .

إعادة 2 "SRC =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
الشكل 2. تم معالجة 10 الفئران مزروع مع stereotactically الأورام ورم أرومي دبقي الأشكال مع أي من العلاج الإشعاعي إلى 16 غراي في 4 كسور أو عدم المعالجة. تم تصوير الفئران bioluminescent مع التصوير قبل العلاج والأسبوعية بعد بدء العلاج. ويعرض الرسم البياني تلألؤ بيولوجي النسبية المحسوبة على النحو التغيير أضعاف متوسط ​​حيث يتم تعريف التغيير أضعاف كنسبة من القيمة الحالية BLI القصوى لقيمة ما قبل المعالجة BLI القصوى.

طريقة زرع المجسم الخلايا السرطانية في الفئران وصفها في هذه الورقة يولد بتكاثر الأورام التي تلخص نمط معقول والارتشاحي السريع النمو من ورم أرومي دبقي الأشكال السريرية ^{2، 6-8.} وخاصة هذه التقنية مناسبة تماما لتجارب الفئران تقسيمها بالتساوي إلى مجموعات معاملة مختلفة حيث استنساخه الأورام ذات الحجم المماثل والخصائص البيولوجية والتشريحية في مواقع محددة ومرغوب فيه. وينبغي غرس المجسم من الخلايا السرطانية باستخدام تقنيات وصفنا يمكن تحقيقه بسهولة من قبل معظم مختبرات الأبحاث متعدية ^7،9-11.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ونحن ممتنون للدكتور أندرو هولاندر ديفيس سارة، شومان لي، تيم جنكينز، والدكتور شو Xiangsheng للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. نعترف دعم الدكتور آن كينيدي. وأيد BCB على الإشعاع التدريب الأحياء المنح C5T32CA009677. وأيد JFD على شهادة بوروز ويلكوم لجائزة علماء الطب (1006792). وأيد JLB على منحة قفير (5 R25 CA140116-03). نود أن نعترف الدكتور ستيف هان التشجيع والدعم الذي ساعد في جعل بحثنا ممكن. نود أيضا أن نشكر جامعة بنسلفانيا واجهة مركز بيو نانو (NBIC) والدكتور دينيس لDischer التشجيع وتعليقات مفيدة. نعترف التصوير الحيوانات الصغيرة مرفق (SAIF) في جامعة ولاية بنسلفانيا لاستخدام مرافقها الأساسية والبصرية MRI / ضوء بارد. تم تطوير هذه التقنيات كجزء من المشاريع التي تدعمها المعاهد الوطنية للصحة (RC1 CA145075 وK08-NS07654801).