Oct4GiP Reporter Анализ по изучению генов, которые регулируют мышиных эмбриональных стволовых клеток обслуживания и Самообновление

Мы описываем флуоресценции анализа репортер быстро идентифицировать и охарактеризовать гены, которые регулируют содержание мышиных эмбриональных стволовых клеток и самообновлению.

Плюрипотентности и самообновления две определяющие характеристики эмбриональных стволовых клеток (ES клетки). Понимание основных молекулярных механизмов значительно облегчит использование ЭС клеток для развития исследований биологии, болезнь моделирования лекарств и регенеративной медицины (обзор в ^1,2).

Чтобы ускорить выявление и характеристика новых регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления, мы разработали флуоресценции репортера на основе анализа количественно измерить самообновлению статус в ЭС клетки мыши использованием Oct4GiP клеток ^3. Oct4GiP клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем Oct4 области промотора гена ^4,5. Oct4 требуется для ES клетки самообновлению, и очень выраженная в ЭС клетки и быстро подавляется в процессе дифференцировки ^6,7. В результате, GFP выражения и флуоресценции в клетках коррелирует репортер вернос единичной клетки ES ⁵ и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) анализ может быть использован внимательно следить за самообновление состояния клетки на одном уровне ячейки ^3,8.

В сочетании с РНК-интерференции, анализ Oct4GiP репортер может быть использована для быстрого выявления и изучения регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления ^3,8. По сравнению с другими методами опробования самообновлению, удобнее, чувствительный, количественный, а также более низкую стоимость. Это может быть осуществлено в 96 - или 384-луночных планшетах для крупномасштабных исследований, таких как высокая пропускная способность экранов или генетического анализа эпистаза. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, анализ описанных здесь также может быть изменен, чтобы исследовать судьбу спецификации в процессе дифференцировки клетки ES.

1. Oct4GiP мыши ES сотового обслуживания

Oct4GiP клетки были любезно предоставлены д-р Остин Смит. Они были получены от мышей 129/Ola проведение Oct4-GFPiresPac трансгенов ^4,5. Они ведутся в желатин покрытием пластин культуры тканей в ESGRO полный плюс клонального класса средней (Millipore), или M15 среда: DMEM (Invitrogen) с добавлением 15% FBS, 1000 ед / мл ESGRO (Millipore), 1x Non- незаменимых аминокислот (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), и 10 мкМ β-меркаптоэтанола.

1. Пальто пластин с 0,1% желатина (Sigma) при комнатной температуре в течение 30 минут (0,1 мл раствора желатина / см ^2).
2. Пластина Oct4GiP клеток в желатин покрытием пластин в ~ 2 х 10 ⁴ / см ^2.
3. Разделите клетки каждые два дня с 0,05% трипсина.

2. миРНК трансфекции в клетки Oct4GiP

Анализ Oct4GiP репортер наиболее convenienTLY осуществляется в желатин-покрытых плоским дном, 96 - или 384-луночных планшетах (Corning или BD) в среде M15. В целом процедура описана на рисунке 1.

1. миРНК-липидных комплексов сборки:
   1. Для трансфекции в 96-луночных планшетах, собрать миРНК-липидных комплексов в U-дно 96-луночных планшетах.
   2. В каждую лунку, смешать 10 мкл OptiMEM (Invitrogen) и 0,3 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen) и выдержите при комнатной температуре в течение 5 мин.
   3. Добавить 5 пмоль миРНК в липидов OptiMEM смеси и инкубировать в течение еще 15 минут. МиРНК: липидный соотношение составляет 100 пмоль: 6ul.
   4. Передача миРНК-липидных комплексов в OptiMEM из U-нижней пластины желатина покрытые плоским дном тарелку с многоканальной пипеткой.
   5. Для трансфекции в 384-луночных планшетов, подготовки миРНК-липидных комплексов с использованием 0,1 мкл липофектамина 2000 года и 2 пмоль миРНК в 10 мкл OptiMEM.

Примечание: конечная концентрация миРНК втрансфекции составляет 50 нм. Провести 3-4 биологической репликации для каждого миРНК трансфекции. Настройка мастера смесей миРНК-липидных комплексов в U-нижняя плита и аликвоту в плоскодонных желатин покрытием пластины.

2. Oct4GiP покрытие клеток и трансфекция:
   1. Для трансфекции в 96-луночных планшетах, собирать Oct4GiP клеток и их ресуспендируют в свежей среде М15 до 9 х 10 ⁴ клеток / мл.
   2. Добавить 100 мкл суспензии клеток в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
   3. Смешать суспензии клеток с предварительно аликвоты миРНК липидов комплексы в хорошо пипетировать вверх и вниз 3-5 раз. Изменение подсказки для различных трансфекции миРНК.
   4. Для трансфекции в 384-луночный, клетки ресуспендируют Oct4GiP до 6 х 10 ⁴ клеток / мл и аликвоты 30 мкл суспензии клеток в каждую лунку.

Примечание: оптимальной плотности покрытия ячейки, как правило, 3 х 10 ⁵ клеток / см ^2, но май требуют дальнейшей оптимизации siRNAs, что значительно влияет на рост клеток и жизнеспособность. Низкая плотность покрытия будет приводить к ухудшению выживаемости клеток при трансфекции. Высокая плотность покрытия приведет к высоким фоном из-за высокой клетки слияния индуцированной дифференциации. Если необходимо, тест покрытие плотностью от 2-4 х 10 ⁵ клеток / см ^2.

3. Среднее изменение:
   1. Удалить старые среде с использованием многоканального аспиратор (Corning) или вакуум палочка (VP-научного). Будьте осторожны, чтобы не поцарапать клетки в нижней части плиты.
   2. Поток клеток свежей средой клетки ES (100 мкл на 96-луночного планшета и 30 мкл для 384-луночного планшета) с помощью многоканальной пипетки каждый день.

3. FACS анализ

1. Сотовые диссоциации:
   1. Через четыре дня после трансфекции, удалить среде с использованием многоканального аспиратор (Corning) или вакуум палочка (VP-научного).
   2. Для 96-луночных планшетах, промыть клетки сразу с 100μл PBS.
   3. Добавить 25 мкл 0,25% трипсина в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
   4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин со случайными агитации и визуальный осмотр, чтобы обеспечить полное отделение клеток.
   5. Добавить 90 мкл PBS с 10% FBS для инактивации трипсина и диссоциации клеток в суспензии отдельных клеток повторным пипетирования.
   6. Для 384-луночный, отмежеваться клеток с 10 мкл трипсина и закалки с 30 мкл PBS с 10% ЭТС.
2. FACS анализа:
   1. Анализ GFP флуоресценции от BD LSRII FACS анализатор оснащен блок HTS или другой аналогичной комплектации FACS анализатор (например, Accuri или Intellicyt).
   2. Использование высокой пропускной режим на ГТС и анализа 10 мкл клеточной суспензии. Установить количество порог до 1,0 х 10 ⁴ клеток.
   3. Регулировка напряжения ФЭУ и порог, чтобы захватить клетки вперед по сравнению с побочными точечный график. Ворота для живой клеточной популяции в forwARD против стороны-точечный график.
   4. Создание гистограммы участок канала GFP. Установить ворота в канале GFP, так что ~ 10% клеток оказываются GFP-отрицательным в макет или контрольно-миРНК трансфекции клеток.
   5. Определить% GFP-негативные клетки друг от лечения:% дифференцированных клеток =% GFP-негативные клетки. Сравните% дифференцированных клеток между экспериментальными и контрольно-миРНК трансфекции с использованием 2-Стьюдента-тест, и набрать положительную хиты с р-значения <0,01.

4. Представитель Результаты

Oct4, Nanog и Sox2 три гена, которые играют важную роль в поддержании ES клетки самообновлению ^6,7,9-11. Рисунок 2 показывает, что анализ Oct4GiP репортер легко обнаружить дифференциации вызвана глушителей этих факторов в Oct4GiP ЭС клетки.

На рисунке 2а клетки Oct4GiP ES являются GFP-положительных, когда поддерживается в ES клеток. Рисунок 2B показывает вперед по сравнению с боковой сюжет рассеяния и гистограммы канала GFP из Oct4GiP клеток, трансфицированных управления или Oct4-siRNAs. Стоит ворота для живых клеток в передней части против точечной диаграммы, а мертвые клетки и мусора являются GFP-отрицательные и повысит фон. С другой стороны, дублет дискриминации, чтобы исключить возможные скопления клетки не всегда необходимо. В контрольно-миРНК трансфекции клеток, подавляющее большинство клеток должна быть GFP-положительных. Если очевидных GFP-отрицательный населения находятся в контрольно-миРНК трансфекции скважин, начиная Oct4GiP клеток или трансфекции процедура, возможно, были скомпрометированы, и результат не может быть интерпретации.

Рисунок 2C показывает гистограмма% дифференцированных клеток (% дифференцированных клеток =% GFP-отрицательные клетки) от управления, Oct4-, Nanog-и Sox2-миРНК трансфекции клеток.

d/3987/3987fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема анализа репортер Oct4GiP.

Рисунок 2. Oct4GiP репортер анализ может обнаружить ES клеточной дифференцировки вызвано Nanog, Oct4, Sox2 или глушителей. А) E14Tg2a (дикого типа, черная линия) и Oct4GiP (зеленая линия) клеток были проанализированы FACS. Гистограмма GFP-канал показывает, что Oct4GiP клеток GFP-положительных. B) Oct4GiP клетки трансфицированных в 96-луночных планшетах с контрольно-или Oct4-миРНК и FACS проанализированы через 4 дня после трансфекции. Вперед против сторона разброс участков и гистограммы GFP-канал трансфицированных клеток показано на рисунке. C) Oct4GiP клетки трансфицированных Контрольно-, Nanog-, Oct4-или Sox2-миРНК. % Дифференцированных клеток определяли по% GFP-негативные клетки через 4 дня после трансфекции, и была построена как среднее + / - стандартная ошибка среднего (п = 4).F = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Анализ Oct4GiP репортер мы описываем выше, можно количественно измерить степень самообновления против дифференциации. По сравнению с другими доступными методами, такими как морфологии на основе ¹² и распространения / жизнеспособность на основе анализов, она предлагает высокую чувствительность и производительность, а также более прямое измерение состояния клетки ES. Поэтому хорошо подходит для крупномасштабных экранах и генетический анализ эпистаза. В самом деле, мы и другие успешно используют анализ Oct4GiP репортер генома РНК-интерференции экранов ^3,8. Как и все анализы, однако, он также имеет свои ограничения. Он может быть использован для изучения генов, которые прямо или косвенно регулируют деятельность Oct4 промоутер, и это может ложно идентифицировать гены, которые влияют на GFP выражение, стабильности, или функция пост-транскрипционно. Таким образом, дополнительные анализы или вторичных экранов, таких как щелочной фосфатазы окрашивания ¹³ (Millipore, SCR004) и иммунофлюоресценции окрашиванием или количественным RT-PCR маркеров плюрипотентности ^3,8,12,14 должны подтвердить результаты, полученные этим методом.

Анализ Oct4GiP репортер использует эффективный глушитель ген. Эффективное siRNAs и эффективной трансфекции миРНК являются ключевыми для успеха анализа. Хотя мы только описал использование репортер анализа с миРНК трансфекции, анализ также может быть выполнена с ДНК трансфекции в тишине или гиперэкспрессией гена интерес. Эффективность трансфекции ДНК, как правило, ниже, чем у siRNAs и может привести к снижению силы фенотипа.

Кроме того, что было описано в протоколе, анализ Oct4GiP репортер может быть изменено для выявления и характеризующие гены, которые негативно регулировать самообновление, а также. В этом случае клетки могут быть трансфицированных siRNAs и культивировали в условиях дифференциации. Отключение отрицательных регуляторов самообновлению повысит самообновления и поддержания GFP выражение, которое может быть гetected по FACS так же, как описано в текущем протоколе.

Кроме того, клетки Oct4GiP репортер, репортер других клеточных линий, использование ЭС клетки конкретных промоутеров, такие как Nanog-GFP ^15-18 (Millipore, SCR089) и Rex1-GFP ¹⁹ клеток, также были созданы. Они также могут быть использованы для изучения ES клетки самообновлению и обслуживания с использованием той же стратегии. Тем не менее, потому что есть заметная разница в активности и специфичности этих ES клетки промоутеров маркерный ген, эти линии репортер клетки ведут себя по-разному с точки зрения уровня фона и чувствительности и, таким образом, дополняют друг друга. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, наша стратегия может быть изменена для изучения судьбы спецификации ЭС клеток и содействовать применению клеточных ES, как в пробирке модель раннего развития млекопитающих.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарим Брэд Lackford для чтения и редактирования рукописей. Это исследование было поддержано Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здоровья Внутренние Программы исследований Z01ES102745 (на GH).