Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.

Pluripotencia y auto-renovación son dos características que definen a las células madre embrionarias (células ES). Entender el mecanismo molecular subyacente facilitará en gran medida el uso de células madre embrionarias para los estudios de biología del desarrollo, modelos de enfermedades, descubrimiento de fármacos y Medicina Regenerativa (revisado en ^1,2).

Para agilizar la identificación y caracterización de nuevos reguladores de mantenimiento de células ES y auto-renovación, hemos desarrollado un reportero de fluorescencia de base de ensayo para medir cuantitativamente el estado de auto-renovación en células madre embrionarias de ratón usando las células Oct4GiP ^3. Las células Oct4GiP expresar la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la región promotora del gen Oct4 ^4,5. Oct4 se requiere para células ES de auto-renovación, y es altamente expresado en células madre embrionarias y rápidamente regulado a la baja durante la diferenciación ^6,7. Como resultado, la expresión de GFP y fluorescencia en las células informadoras se correlaciona fielmentecon la identidad de células ES ^5, y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) el análisis se puede utilizar para controlar estrechamente el estado de auto-renovación de las células en el nivel de células individuales ^3,8.

Junto con ARNi, el ensayo reportero Oct4GiP se puede utilizar para identificar rápidamente y estudiar los reguladores de mantenimiento de células ES y autorrenovación ^3,8. En comparación con otros métodos para el ensayo de auto-renovación, es más conveniente, sensible, cuantitativa, y de menor coste. Puede llevarse a cabo en 96 - o placas de 384-bien para estudios a gran escala, tales como pantallas de alto rendimiento o de análisis de epistasis genética. Finalmente, mediante el uso de otros linaje específico reportero líneas de células ES, el ensayo se describe aquí también se puede modificar para estudiar especificación destino durante la diferenciación de células ES.

1. Oct4GiP madre embrionarias de ratón de mantenimiento de la célula

Oct4GiP células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Austin Smith. Se deriva de los ratones portadores 129/Ola un transgén Oct4-GFPiresPac ^4,5. Ellos se mantienen en gelatina placas recubiertas de cultivo de tejidos en el medio ESGRO grado completa más clonal (Millipore), o en el medio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado con FBS al 15%, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x para no- aminoácidos esenciales (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), y 10 mM mercaptoetanol β-.

1. Coat con placas% de gelatina 0,1 (Sigma) a temperatura ambiente durante 30 minutos (0,1 ml de solución de gelatina / cm ^2).
2. Células de la placa Oct4GiP en gelatina revestida de placas de 2 x 10 ~ ⁴ / cm ^2.
3. Dividir las celdas de cada dos días con 0,05% de tripsina.

2. siRNA transfección en células Oct4GiP

El ensayo reportero Oct4GiP es más convenientemente lleva a cabo en gelatina recubierto con fondo plano 96 - o placas 384-pocillos (Corning o BD) en el medio M15. El procedimiento general se esboza en la Figura 1.

1. siRNA-lípidos complejos de montaje:
   1. Para la transfección en placas de 96 pocillos, ensamble de lípidos complejos de siRNA en fondo en U placas de 96 pocillos.
   2. En cada pocillo, mezclar 10 l OptiMEM (Invitrogen) y 0,3 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
   3. Añadir 5 pmol ARNsi a la mezcla de lípidos OptiMEM e incubar durante otros 15 minutos. El siRNA: relación de los lípidos es de 100 pmol: 6ul.
   4. Transferir los complejos de lípidos siRNA en OptiMEM de la placa de fondo en U a la revestida con gelatina de fondo plano placa con una pipeta de canales múltiples.
   5. Para la transfección en placas de 384 pocillos, preparar los complejos de lípidos siRNA con 0,1 l Lipofectamine 2000 y 2 siRNA pmol en 10 OptiMEM l.

Nota: La concentración final de siRNAlas transfecciones es 50 nM. Llevar a cabo biológica 3-4 repeticiones para cada transfección de siRNA. Establecer las mezclas maestras de los complejos de lípidos siRNA en la placa de fondo en U y la alícuota en el fondo plano de gelatina recubierto de placas.

2. Oct4GiP chapado de células y transfección:
   1. Para la transfección en placas de 96 pocillos, recoger las células Oct4GiP y resuspender en medio de frescas M15 a 9 x 10 ⁴ células / ml.
   2. Añadir 100 l de la suspensión de células en cada pocillo utilizando una pipeta de canales múltiples.
   3. Mezclar la suspensión de células con los pre-alícuotas lípidos siRNA-complejos en el pozo por pipetear arriba y hacia abajo 3-5 veces. Cambiar las puntas de siRNA transfections diferentes.
   4. Para la transfección en placas de 384-pozos, Resuspender las células Oct4GiP a 6 x 10 ⁴ células / ml y 30 alícuota suspensión celular l a cada pocillo.

Nota: La densidad de célula de recubrimiento óptimo es generalmente de 3 x 10 ⁵ células / cm ^2, pero may requieren una mayor optimización de siRNAs que afectan drásticamente el crecimiento de células o la viabilidad. Baja densidad de placas dará lugar a la supervivencia celular deficiente durante la transfección. Densidad de placas de alta dará lugar a un fondo elevado debido a la diferenciación de alta confluencia celular inducida. Si es necesario, prueba de densidad de placas entre 2-4 x 10 ⁵ células / cm ^2.

3. Cambio de medio:
   1. Eliminar el medio de edad con múltiples canales de aspiración (Corning) o el vacío varita (VP-científico). Tenga cuidado de no dañar las células en la parte inferior de las placas.
   2. Alimentar a las células con un nuevo medio de células ES (100 l para la placa de 96 pozos y 30 l de 384 y placa) con pipeta multicanal todos los días.

3. Análisis FACS

1. Disociación celular:
   1. Cuatro días después de la transfección, eliminar el medio usando multi-canal de aspiración (Corning) o el vacío varita (VP-científico).
   2. Para placas de 96 pocillos, lavar las células una vez con 100μl de PBS.
   3. Añadir 25 l de tripsina 0,25% a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal.
   4. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación ocasional, y una inspección visual para asegurar desprendimiento completo de las células.
   5. Añadir 90 l de PBS con FBS al 10% para inactivar la tripsina y disociar las células en una suspensión de células individuales por pipeteado repetido.
   6. Para placas de 384 pocillos, disociar las células con 10 l de tripsina y enfriamiento con 30 ul PBS con 10% de FBS.
2. FACS análisis:
   1. Analizar la fluorescencia de GFP en el analizador BD LSRII FACS equipado con la unidad HTS u otro similar equipado analizador FACS (como Accuri o Intellicyt).
   2. Utilice el modo de alto rendimiento en el HTS y analizar los 10 l de suspensión celular. Establecer el umbral de recuento de 1,0 x 10 ⁴ células.
   3. Ajuste la tensión de la PMT y el umbral para capturar las células en la trama hacia adelante frente a dispersión lateral. Puerta de la población de células vivas en la dwnARD vs lado gráfico de dispersión.
   4. Crear un histograma para el canal de las buenas prácticas agrarias. Ajuste de la puerta en el canal de GFP de modo que ~ 10% de las células parecen ser GFP-negativo en las células transfectadas simuladas o control siRNA.
   5. Determinar% negativas GFP-células de cada tratamiento: las células diferenciadas% =% de células GFP-negativos. Comparar las células diferenciadas% entre experimentales y de control de siRNA-transfecciones con dos colas t-test, y anotar los golpes positivos con los valores de p <0.01.

4. Los resultados representativos

Oct4, Nanog, y Sox2 son tres genes que desempeñan papeles cruciales en el mantenimiento de células ES de auto-renovación ^6,7,9-11. Figura 2 muestra que el reportero de ensayo Oct4GiP puede detectar fácilmente la diferenciación causada por el silenciamiento de estos factores en el Oct4GiP células madre embrionarias.

La figura 2A muestra las células ES son Oct4GiP GFP-positivo cuando se mantiene como ES células. Figura 2B muestra el diagrama de dispersión hacia adelante contra lado y el histograma del canal GFP de las células transfectadas con el Oct4GiP control o Oct4 siRNAs. Es necesario puerta para las células vivas en el gráfico de dispersión hacia adelante contra lado, como las células muertas y los desechos son GFP-negativo y aumentará fondo. Por otro lado, doblete discriminación para excluir posibles grumos de células no es siempre necesaria. En las células de control siRNA-transfectadas, la gran mayoría de las células debe ser GFP-positivo. Si evidentes las buenas prácticas agrarias-negativos poblaciones están presentes en los pozos de control de siRNA-transfectadas, las células Oct4GiP de partida o el procedimiento de transfección puede estar comprometida y el resultado no puede ser interpretable.

La figura 2C muestra el gráfico de barras de las células diferenciadas% (células diferenciadas% =% GFP-negativos células) de control, Oct4, Nanog, y Sox2 siRNA-transfectadas las células.

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Figura 1. Esquema del reportero de ensayo Oct4GiP.

Figura 2. Ensayo de Oct4GiP reportero puede detectar la diferenciación de células ES causada por Nanog, Oct4, Sox2 o el silenciamiento. A) E14Tg2a (de tipo salvaje, la línea de negro) y las células Oct4GiP (línea verde) se analizaron por FACS. Histograma de la GFP canales muestra que las células son las buenas prácticas agrarias Oct4GiP positivo. B) Las células fueron transfectadas Oct4GiP en placas de 96 pocillos con el control o Oct4 siRNA y FACS analizaron 4 días después de la transfección. Adelante vs gráficos de dispersión y los histogramas laterales de la GFP-canal de las células transfectadas se muestran. C) Las células Oct4GiP fueron transfectadas con el control, Nanog, Oct4, Sox2, o siRNA. Las células diferenciadas% se determinó a partir de la GFP% negativo células 4 días después de la transfección, y se representan como media + / - error estándar de la media (n = 4).f = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande figura.

El reportero de ensayo Oct4GiP que describimos arriba cuantitativamente se puede medir el grado de auto-renovación frente a la diferenciación. En comparación con otros métodos disponibles, tales como la morfología ¹² basada en la proliferación y / ensayos de viabilidad basado, que ofrece una mayor sensibilidad y el rendimiento, así como una medición más directa del estado de células ES. Por tanto, se adapta bien a gran escala pantallas y análisis epistasis genética. De hecho, nosotros y otros han utilizado con éxito el reportero de ensayo Oct4GiP de todo el genoma RNAi pantallas de ^3,8. Como todos los ensayos, sin embargo, también tiene sus limitaciones. Sólo puede ser utilizado para estudiar los genes que regulan directa o indirectamente Oct4 actividad promotora, y se puede dar a identificar los genes que afectan a la expresión de GFP, estabilidad, o la función post-transcripcional. Por lo tanto, los ensayos adicionales o pantallas secundarias, tales como la tinción fosfatasa alcalina ¹³ (Millipore, SCR004) y la tinción de inmunofluorescencia o RT cuantitativa-PCR de los marcadores de pluripotencia ^3,8,12,14 están obligados a confirmar los resultados obtenidos con este método.

El reportero de ensayo Oct4GiP se basa en el silenciamiento de genes eficiente. SiRNAs eficaces y eficientes siRNA transfections son clave para el éxito del ensayo. Aunque sólo se describe el uso del ensayo reportero con transfecciones siRNA, el ensayo puede realizarse también con las transfecciones de ADN a silencio o genes sobreexpresan de interés. Eficiencia de la transfección de ADN es generalmente menor que la de siRNAs y puede reducir la fuerza del fenotipo.

Además de lo descrito en este protocolo, el reportero de ensayo Oct4GiP puede ser modificado para identificar y caracterizar los genes que regulan negativamente la auto-renovación, así. En ese caso, las células pueden ser transfectadas con siRNAs y se cultivaron en condiciones de diferenciación. El silenciamiento de los reguladores negativos de la auto-renovación mejorará la auto-renovación y mantener la expresión de GFP, que puede ser detected por FACS de manera similar como se describe en el protocolo actual.

Además de las células informadoras Oct4GiP, otras líneas de células informadoras utilizando promotores de células ES específicas, tales como la Nanog-GFP ^15-18 (Millipore, SCR089) y Rex1-GFP células ^19, también se han generado. También se pueden utilizar para estudiar células ES auto-renovación y mantenimiento utilizando la misma estrategia. Sin embargo, porque no hay diferencia notable en la actividad y la especificidad de estos promotores de células ES de genes marcadores, estas líneas celulares reportero comportan de manera diferente en términos de nivel de fondo y de la sensibilidad y, por tanto se complementarán entre sí. Finalmente, mediante el uso de otros linaje específico reportero líneas de células ES, nuestra estrategia se puede modificar para estudiar el destino de especificación de células ES y facilitar el uso de células ES como un modelo in vitro para el desarrollo temprano de mamíferos.

No hay conflictos de interés declarado.

Damos las gracias a Brad Lackford para la lectura y edición del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud, Programa de Investigación Intramural Z01ES102745 (GH).