Использование животных Модель Сепсис для оценки Роман травяной терапии

Сепсис относится к синдрома системного воспалительного ответа в результате микробной инфекции, и могут быть смоделированы с помощью хирургической техникой слепой кишки называется перевязка и прокол (CLP). Здесь мы опишем метод использовать CLP-индуцированной животной модели для скрининга лекарственных трав для терапевтических агентов.

Сепсис относится к синдрома системного воспалительного ответа в результате микробной инфекции. Это было обычно моделируются на животных несколько методов, в том числе вливания экзогенного бактериального токсина (эндотоксемии) или бактерии (бактериемия), а также хирургическое перфорация слепой от слепой кишки перевязки и пункции (CLP) ^1-3. CLP позволяет бактериям и разлива фекальных загрязнений в брюшную полость, имитируя человеческий клинической болезни перфорированный аппендицит или дивертикулит. Тяжесть сепсиса, как это отражено в возможной смертности, можно контролировать хирургическим путем изменения размера иглы для прокола слепой кишки ^2. У животных, CLP вызывает подобное, двухфазный гемодинамики сердечно-сосудистой системы, метаболических и иммунологических реакций, как наблюдалось в течение клинического течения сепсиса человека ^3. Таким образом, модель CLP считается одним из наиболее клинически значимых моделей для экспериментального сепсиса ^1-3. </ P>

Различные модели животных были использованы для выяснения сложных механизмов, лежащих в основе патогенеза экспериментального сепсиса. Смертельным следствием сепсиса связано отчасти с чрезмерным накоплением ранних цитокинов (таких как ФНО, ИЛ-1 и ИФН-γ) ^4-6 и поздно провоспалительных медиаторов (например, HMGB1) ^7. По сравнению с ранними провоспалительных цитокинов, в конце действия посредники имеют более широкое терапевтическое окно для клинического применения. Например, задержка администрации HMGB1-нейтрализующих антител начинается через 24 часа после CLP-прежнему спасли мышей от летальность ^8,9, создание HMGB1 в конце посредником летальный сепсис. Открытие HMGB1 в конце действия посредника инициировал новое поле исследований для развития сепсиса терапии с использованием традиционной китайской травяной медицины. В этой статье мы опишем процедуру CLP-индуцированной сепсисом, и его использование при проверке лекарственных трав для HMGB1-планирование лечения.

1. Создание животной модели сепсиса

1. Мыши наркоз с кетамином (75 мг / кг, внутримышечно, мкм) и ксилазина (10 мг / кг, внутримышечно), и помещается в положении лежа.
2. Зафиксируйте ноги мышь с лентой для обеспечения устойчивого положения.
3. Очистите живот с 3 переменного скрабы из бетадин или другими дезинфицирующими кожи и алкоголя. Затем сделать 15 мм средней линии разреза, чтобы разоблачить слепой кишки.
4. Перевязывать слепой кишки с 4-0 шва шелком примерно 5,0 мм от кончика слепой кишки, а затем прокол перевязанной слепой кишки пень раз с 22-иглу, чтобы экструзии стула.
5. Слепой немедленно заменен обратно в нормальное внутрибрюшное положение.
6. Закройте разреза в два слоя, сначала закрыв мускулатуры живота с рассасывающиеся швы, а затем закрыть рану кожи или клипов нерассасывающиеся швов.
7. Реанимацию мышь с 0,5 мл физиологического раствора и одного этоготаковой имипенема (0,5 мг / мышь, подкожно) сразу же после завершения операции.
8. Вернуться мышь обратно в чистую клетку со свободным доступом к пище и воде.
9. В разное время CLP сообщение пункты, растительный экстракт или компонент вводят внутрибрюшинно.
10. Животное выживания контролируется в течение более двух недель. Умирающий животных выставке трудности стоять, предсмертное дыхание, сильная мышечная атрофия и неконтролируемые кровотечения следует усыплять от передозировки вдыхание двуокиси углерода.
11. Важно отметить, что циркулирующие уровни цитокинов являются важными параметрами, в этих исследованиях. Различные обезболивающие было показано, что влияет на высвобождение цитокинов и деятельности, и, следовательно, были намеренно избегал в послеоперационном периоде.

2. Подготовка Растительные экстракты

1. Извлечение травы в горячей воде (85 ° C) в течение 1-4 часов (1 час на листьях, и 4 часа на корни).
2. Центрифуга с водой такluble фракции (3300 г, 20 мин, 4 ° C) для удаления нерастворимых частиц.
3. Фильтрат фракции супернатанта через 0,2 мкм фильтр.
4. Ясно водорастворимой фракции фильтрата затем фракционировали ультрафильтрацией использованием Centriprep YM-10 центробежный фильтр (не каталог. 4305, Millipore).
5. Результатом низкой (<10 кДа) и высоких (> 10 кДа) молекулярного веса (MWF) проверяются на HMGB1 ингибиторов деятельности с использованием макрофагов культур.
6. Внутрибрюшинное администрации HMGB1 ингибирующих растительный экстракт или компонентов на 24 часа после CLP, чтобы оценить их терапевтическую эффективность.

3. Выделение макрофагов перитонеального

1. Тиогликолята бульон (4%, 2,0 мл) вводят внутрибрюшинно в нормальных мышей.
2. Первичная макрофагов собирают на 3 дня, как описано выше ^10.
3. Макрофаги предварительно культивировали в DMEM среде (Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 ммоль / л глутамина, и 1% пенициллина.
4. Приверженец макрофагов мягко промывают и культивируют в, бессывороточной OPTI-я среда MEM два часа до начала стимуляции бактериального эндотоксина (липополисахарида, ЛПС, E.coli 0111: В4, Sigma-Aldrich).
5. В 16 часов после стимуляции LPS, уровни HMGB1 в культуральной среде определяется западных промокательной анализ ^11.
6. Относительная интенсивность группа была количественно с помощью образа NIH 1,59 программное обеспечение для определения уровня HMGB1 со ссылкой на стандартные кривые, созданные с очищенной HMGB1.

4. Представитель Результаты

1. CLP вызывает системного и местного воспаления.

В течение нескольких часов операции CLP, животные проявляют клинические признаки сепсиса, которые включают пилоэрекции, вялость, сбившись, и снижение потребления пищи и воды. Животные развивается тяжелый перитонит с последовательной системнойинфекции обычно умирают в течение 48 - 96 часов. Тем не менее, даже по возрасту, полу, и генетический фон подобранные животные могут реагировать на CLP хирургии в различимы образом, в ходе экспериментального сепсиса. Например, в 48 часов после CLP, а некоторые животные, возможно, подошел к умирающим государством (как показано на рис 1), другие могут оставаться без умирающего государства.

Справочники циркулирующих цитокинов выявлены значительные различия в уровнях ряда цитокинов (например, IL-6, КС, MIP-2, и sTNFR1) между мышами в умирающую и не умирающего государства (рис. 1) ^12. Примечательно, что эти медиаторы воспаления были классифицированы в качестве суррогатных маркеров сепсиса, потому что их уровень циркулирующих служат надежными предикторами летального исхода в экспериментальных или клинических ^12-14 сепсис ^15. Кроме того, CLP также индуцируется местный выпуск различных про-и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Например, на48 часов после CLP, значительное количество цитокинов (например, IL-6) и хемокинов (KC и MIP-2) все еще ​​можно измерять не только системно в крови, но и на местном уровне в перитонеальной жидкости лаважа (рис. 2).

2. Скрининг на HMGB1 ингибирующих растительный экстракт или компонентов.

Использование макрофагов культур, мы смогли оценить возможности различных растительных экстрактов и компонентов для ингибирования эндотоксин-индуцированный выброс HMGB1 (рис. 3). В свете их потенциала в подавлении выпуск HMGB1, мы дополнительно изучить их эффективность при сепсисе животных моделях. Учитывая поздний и длительной кинетики HMGB1 накопления в экспериментальном сепсисе ^8, первая доза HMGB1 ингибиторов было дано 24 часа после начала сепсиса - момент времени, когда мышей разработаны четкие признаки сепсиса, включая сонливость, понос и пилоэрекции. Как показано на рисунке 4, задерживается и повторного введения основной зеленый чай сomponent, эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG), начиная с 24 часов после начала сепсиса, значительно спасли мышей от смертельных сепсис ^12. Даже когда в устной форме, EGCG, еще спасли мышей от смертельных сепсиса, значительно повышая выживаемость животных ставки с 16% до 44% ^16. Было бы важно для определения комбинационной терапии с несколько травяных компонентов можно добиться значительного улучшения защиты на животных моделях сепсиса. Взятые вместе, эти экспериментальные данные подтверждены наш подход к экрану новых терапевтических агентов с помощью животной модели CLP-индуцированной сепсисом.

5. Представитель Результаты

Рисунок 1. Циркулирующие уровни суррогатных маркеров значительно выше в септик животные приближаются умирающего государства. BALB / C мышей подвергали сепсис от CLP и контроль за развитием признаков болезни. Впоздней стадии сепсиса (52 часов после CLP), кровь была собрана от 3 нормальных мышей (-CLP), 3 септический мышей приближается к умирающим государством, и 3-септических мышей в не умирающий государства. Сыворотку объединения из каждой группы, а также анализировали на цитокиновой профиль антител массивов. Обратите внимание на резкое различие в относительных уровней ряда суррогатных маркеров между различными группами. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.

Рисунок 2. Выявление местных и системных цитокинов и хемокинов в 48 часов после CLP. BALB / C мышей подвергали сепсис по CLP и крови или перитонеальной жидкости были собраны в 48 часов после CLP. Относительный уровень ряда цитокинов и хемокинов в пробах сыворотки или перитонеального лаважа жидкости были измерены массивов цитокинов антитела, и выражается в условных единицах (а.е.). В качестве контроля, крови и перитонеальной жидкости SAmples были получены от нормальных здоровых животных (-CLP) без лапаротомии.

Рисунок 3. Травяные компоненты дозозависимо ингибирует эндотоксин-индуцированное HMGB1 выпуска в первичных культурах макрофагов. Первичная перитонеальных макрофагов стимулировали LPS в отсутствии или наличии растительных компонентов (например, EGCG, 15 мкм). В 16 часов после стимуляции LPS, уровни HMGB1 в культуральной среде определяли западных промокательной анализа. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.

Рисунок 4. Травяные компоненты спасли мышей от смертельных сепсиса. BALB / C мышей подвергали смертельной сепсис от CLP, а также травяные компоненты (EGCG) вводили внутрибрюшинно в +24, +48, +72 часов после начала сепсиса.мальные выживание следили в течение двух недель. Kaplan-Meier метод был использован для сравнения различий в уровне смертности между группами. * Р <0,05 в сравнении с физиологическим раствором. Взято из DOI: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 с разрешение от издателя.

В лаборатории несколько животных моделях сепсиса были использованы для понимания патогенеза сепсиса, для того, чтобы развивать потенциал терапии романа. Их клиническое значение остается предметом дискуссий до успешного воплощения в исследованиях на животных в клинической практике для сепсиса. Несмотря на то, нейтрализующих антител против ранних цитокинов (например, фактор некроза опухоли) были защитные на животных моделях бактериемия / ^17,18 эндотоксемии, они на самом деле ухудшает выживание в животной модели сепсис ^19. Кроме того, большинство анти-ФНО агенты не смогли показать эффективность в клинических испытаниях при сепсисе ^20-22. Этот отказ отражает частично от сложности основные патогенетические механизмы развития сепсиса ^23,24. Кроме того, он также может быть связано с подводных камней в выборе: 1) возможно терапевтических целей или наркотиков; 2) оптимальные дозы и сроки наркотиков, и 3) без реальных клинических меры результата (например, смертность) ^25.

Недавнее открытие HMGB1 таргетирования растительный экстракт и / компонентов, в том числе Danggui ^26, Зеленый чай, ^{12,16, 27} и Danshen обеспечил успешные примеры доклинических расследование использования животных моделях сепсиса. Дальнейшие исследования в этой области будет пролить свет на молекулярные каскады, лежащие в основе регулирования врожденного иммунного ответа, и дать ключи для развития терапии различных воспалительных заболеваний. При первом создании CLP в вашей лаборатории, следует предпринять усилия для выполнения операции процедуру максимально быстро и точно, как можно обеспечить воспроизводимость результатов, особенно при использовании большого количества (30-40) мышей для сравнения выживаемости между несколькими экспериментальными группами эксперимента. Использование пролонгированного действия анестетиков (например, кетамин и ксилазина) позволяет завершить CLP хирургическое вмешательство на большое количество мышей в относительно короткие сроки, а тем временем помочьустранить возможные отклонения дозы часто происходит при использовании летучих анестетиков. Выживаемость и системное накопление цитокинов можно рассматривать как признаки успешного выполнения процедуры CLP.

CLP модель широко используется у грызунов из-за очевидного преимущества в низкой стоимости, простоте хирургическое вмешательство, а также обширные патологические, иммунологических, физиологических характеристик. Тем не менее, существует ряд ограничений мыши CLP модель ^1-3. Например, как и все модели на животных, виды неравенства свидетельствует тот факт, что перевязка слепой кишки без прокола может быть смертельным в человека, но не у мышей. Кроме того, из-за небольших размеров мыши и обезвоживания после CLP, часто бывает трудно получить серийные образцы крови для измерения цитокинов. Эти недостатки могут быть частично преодолены путем создания моделей CLP в более крупных животных ^2,3,27,28. Кроме того, важно отметить, что смертность ипрогресс перитонита у грызунов во многом определяется количеством стула экструзии, которые пострадали от датчика иглы используются для прокола слепой кишки, количество проколов, общий объем перевязанной слепой кишки и вязкости стул ^{2, 3.} Кроме того, дозы и частота приема антибиотиков на ранней стадии CLP также может повлиять на уровень смертности. Наконец, животного происхождения и жилищные условия, также могут способствовать дисперсии смертности.

AES и HW являются со-изобретателями патентных заявок, связанных с HMGB1 ингибиторов (tanshinones) как потенциальные терапевтические агенты для сепсиса.

Эта работа была поддержана грантами от Национального института здравоохранения, Национальный институт общей медицинских наук (R01GM063075) и Национального центра дополнительной и альтернативной медицины (R01AT05076).