Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepse se refere a uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica resultante de uma infecção microbiana, e pode ser simulado por uma técnica cirúrgica chamada ligadura e perfuração cecal (CLP). Aqui nós descrevemos um método para usar CLP-induzida modelo animal para a tela ervas medicinais para agentes terapêuticos.

Sépsis refere-se a uma síndrome de resposta inflamatória sistémica resultante de uma infecção microbiana. Tem sido rotineiramente simulado em animais por várias técnicas, incluindo a infusão de toxina bacteriana exógena (endotoxemia) ou bactérias (bacteremia), bem como a perfuração cirúrgica do ceco por ligação e perfuração cecal (CLP) ^1-3. CLP permite que as bactérias derramamento e contaminação fecal da cavidade peritoneal, imitando a doença humana clínico de apendicite perfurada ou diverticulite. A gravidade da sépsis, tal como reflectido pelas taxas de mortalidade eventuais, podem ser controlados cirurgicamente variando o tamanho da agulha usada para punção cecal ^2. Em animais, a CLP induz hemodinâmica, similar bifásico respostas cardiovasculares, metabólicas e imunológicas, como observado durante a evolução clínica da sepse humana ^3. Assim, o modelo CLP é considerado como um dos modelos mais clinicamente relevantes para sépsis experimental ^1-3. </ P>

Vários modelos animais têm sido utilizados para elucidar os mecanismos subjacentes à intrincados patogénese da sépsis experimental. A consequência letal de sépsis é atribuível parcialmente a uma acumulação excessiva de citocinas iniciais (tais como TNF, IL-1 eo IFN-γ) ^4-6 e mediadores pró-inflamatórios tardia (por exemplo, HMGB1) ^7. Comparado com os primeiros citocinas pró-inflamatórias, de ação tardia mediadores têm uma ampla janela terapêutica para aplicações clínicas. Por exemplo, a administração retardada de HMGB1 anticorpos neutralizadores começando 24 horas após CLP, ainda resgatado a partir de ratinhos letalidade ^8,9, estabelecendo HMGB1 como um mediador tardia da sépsis letal. A descoberta de HMGB1 como um mediador de ação tardia deu início a um novo campo de investigação para o desenvolvimento de terapias que utilizam sepse medicina tradicional chinesa. Neste artigo, descrevemos um procedimento de CLP-induzida a sepse, e seu uso na seleção de ervas medicinais para a HMGB1 de metas terapêuticas.

1. Estabelecimento de Modelo Animal de Sepse

1. Os ratos são anestesiados com cetamina (75 mg / kg, por via intramuscular, im) e xilazina (10 mg / kg, im), e colocado em decúbito dorsal.
2. Fixe os pés do mouse com fita, para garantir uma posição estável.
3. Limpe o abdômen com 3 esfrega alternadas de betadine ou outro desinfetante da pele e do álcool. Em seguida, fazer uma incisão na linha média 15 milímetros para expor o ceco.
4. Ligar o ceco com uma sutura de seda 4-0 a cerca de 5,0 milímetros a partir da ponta cecal e, em seguida punção do coto ligadura cecal uma vez com uma agulha de calibre 22 para permitir a extrusão de fezes.
5. O ceco é imediatamente substituído de volta para sua posição intra-abdominal normal.
6. Feche o local da incisão em duas camadas, por primeiro fechar a musculatura do abdómen com suturas absorvíveis, e, em seguida, fechando a pele com grampos de sutura ou suturas não absorvíveis.
7. Ressuscitar rato com 0,5 ml solução normal salina e fazer um únicoSE de imipenem (0,5 mg / rato, por via subcutânea) imediatamente após a conclusão do procedimento cirúrgico.
8. Retornar o rato de volta para uma gaiola limpa com livre acesso a comida e água.
9. Em vários pontos CLP pós tempo, extrato de ervas ou componente é administrado por via intraperitoneal.
10. Sobrevivência dos animais é monitorizado durante mais de duas semanas. Os animais moribundos exibem dificuldades em repouso, respiração, atrofia muscular agonia intensa e sangramento descontrolado devem ser sacrificados por overdose inalação de dióxido de carbono.
11. É importante notar que os níveis circulantes de citocinas são parâmetros importantes nestes estudos. Analgésicos Vários foram mostrados para afetar a liberação de citocinas e atividades, e, portanto, ter sido deliberadamente evitado nos cuidados pós-operatório.

2. Preparação do extrato de plantas medicinais

1. Extrair ervas em água quente (85 ° C) por 1-4 horas (1 hora para as folhas, e 4 horas para as raízes).
2. Centrifugar a água, de modofracção luble (3300 g, 20 min, 4 ° C) para remover partículas insolúveis.
3. Filtrado a fracção sobrenadante através de um filtro de 0,2 uM.
4. A clara solúvel em água fracção filtrado é então fraccionado por ultrafiltração utilizando Centriprep YM-10 filtro centrífugo (catálogo n °. 4305, Millipore).
5. O resultado de baixo custo (menos de 10 kDa) e elevado (mais de 10 kDa) fracções de peso molecular (MWF) são rastreados para HMGB1 inibidores actividades utilizando culturas de macrófagos.
6. Administração intraperitoneal de HMGB1 inibidores extrato de ervas ou componentes em 24 horas pós-CLP para avaliar sua eficácia terapêutica.

3. Isolamento de macrófagos peritoneais

1. Caldo tioglicolato (4%, 2,0 ml) é administrado por via intraperitoneal em ratos normais.
2. Primárias macrófagos peritoneais foram colhidos menos 3 dias tal como anteriormente descritos ^10.
3. Os macrófagos são pré-cultivadas em meio DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mmol / L, e 1% de penicilina.
4. Macrófagos aderentes são suavemente lavados com, e cultivadas em, isento de soro OPTI-MEM I de duas horas antes da estimulação com endotoxina bacteriana (lipopolissacárido, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich).
5. Às 16 horas após a estimulação com LPS, os níveis de HMGB1 no meio de cultura são determinados por análise de Western blotting ^11.
6. A intensidade da banda relativa foi quantificada usando a imagem NIH 1,59 software para determinar os níveis de HMGB1 com referência às curvas padrão geradas com purificado HMGB1.

4. Os resultados representativos

1. CLP induz inflamação sistêmica e local.

Dentro de algumas horas de cirurgia CLP, os animais apresentam sinais clínicos de sepse que incluem piloereção, letargia, encolhendo-se, e diminuição na ingestão de alimentos e água. Animais desenvolvimento de uma peritonite grave com sistêmica consecutivoinfecção normalmente morrem dentro de 48-96 hr. No entanto, mesmo fundo pareados idade, sexo, e genética de animais pode responder à CLP cirurgia de uma maneira distinguíveis no decurso da sépsis experimental. Por exemplo, em 48 horas pós-CLP, enquanto alguns animais podem ter abordado o estado moribundo (conforme definido na Figura 1), outros podem permanecer em um estado não-moribundo.

Inquéritos abrangentes de citocinas circulantes revelou diferenças dramáticas em vários níveis de citocinas (por exemplo, IL-6, KC, MIP-2, e sTNFR1) entre ratinhos nos estados moribundos e não-moribundos (Figura 1) ^12. Notadamente, esses mediadores inflamatórios têm sido classificados como marcadores de sepse porque seus níveis circulantes são indicadores confiáveis ​​de desfecho letal em ^12-14 experimental ou sepse clínica ^15. Além disso, CLP também induziu a libertação local de várias citocinas pró e anti-inflamatória e quimiocinas. Por exemplo, no48 horas após a CLP, quantidades significativas de citocinas (por exemplo, IL-6) e quimiocinas (KC e MIP-2) ainda pode ser medida, não só sistemicamente no sangue, mas também localmente no fluido de lavagem peritonial (Figura 2).

2. Triagem para HMGB1 inibidores extrato de ervas ou componentes.

Usando culturas de macrófagos, fomos capazes de avaliar as capacidades de extracto de plantas medicinais ou vários componentes em inibir a liberação HMGB1 induzida pela endotoxina (Figura 3). À luz da sua capacidade em inibir a liberação de HMGB1, nós ainda explorada a sua eficácia na sepse modelos animal. Dada a cinética tardias e prolongada de HMGB1 acumulação na sépsis experimental ^8, a primeira dose de HMGB1 inibidores foi determinado 24 horas após o início da sépsis - um ponto de tempo quando os ratinhos desenvolveram sinais claros de sépsis, incluindo letargia, piloerecção, diarreia e. Como mostrado na Figura 4, atrasado e administração repetida de uma grande chá verde component, epigalocatequina-3-galato (EGCG), com início às 24 h após o início da sepse, significativamente resgatado camundongos com sepse letal ^12. Mesmo quando administrado por via oral, EGCG ratos ainda resgatados de sepsis letal, aumentando significativamente as taxas de sobrevivência de animais de 16% para 44% ^16. Seria importante para determinar se as terapias combinações com vários componentes à base de plantas poderia alcançar uma protecção significativa melhor em modelos animais de sépsis. Em conjunto, estes dados experimentais validado nossa abordagem à tela novos agentes terapêuticos, utilizando um modelo animal de CLP-induzida a sepse.

5. Os resultados representativos

Figura 1. Os níveis circulantes de marcadores são significativamente maior em animais sépticos aproximam estado moribundo. Balb / C camundongos foram submetidos a sepse por CLP e monitorados para o desenvolvimento de sinais de doença. Numafase tardia da sepse (52 horas pós-CLP), foi coletado sangue de ratos normais (3-CLP), 3 ratos sépticos que se aproximam do estado moribundo e 3 ratos sépticos em estado não-moribundo. O soro foi reunidas a partir de cada grupo, e ensaiado para o perfil de citocinas por matrizes de anticorpos. Observe a diferença dramática nos níveis relativos de vários marcadores entre diferentes grupos. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 com a permissão concedida a partir do editor.

Figura 2. Detecção de citocinas locais e sistémicos e quimiocinas às 48 horas após a CLP. Balb / C ratinhos foram submetidos a sépsis por CLP, e sangue ou líquido peritoneal foram colhidas às 48 h pós CLP. Níveis relativos de várias citocinas e quimiocinas em reunidas soro ou fluido peritoneal lavagem foram medidos por matrizes de anticorpos de citocina, e expressos como unidades arbitrárias (UA). Como controlos sangue, fluido peritoneal e samples foram obtidos de animais saudáveis ​​normais (-CLP), sem laparotomia.

Figura 3. Componente à base de plantas dose-dependente inibida induzida pela endotoxina HMGB1 libertação em culturas de macrófagos primários. Primários macrófagos peritoneais murinos foram estimulados com LPS na ausência ou presença de componente à base de plantas (por exemplo, EGCG, 15 uM). Às 16 horas após a estimulação com LPS, os níveis de HMGB1 no meio de cultura foram determinados por análise de Western blotting. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 com a permissão concedida a partir do editor.

Figura 4. Componente à base de plantas resgatado a partir de ratinhos sépsis letal. Balb / C ratinhos foram submetidos a sépsis letal por CLP, e componente à base de plantas (EGCG) foi administrado intraperitonealmente em 24, +48, +72 horas após o início da sépsis. Umsobrevivência máxima foi monitorado por até duas semanas. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para comparar as diferenças nas taxas de mortalidade entre os grupos. *, P <0,05 versus salina. Adaptado de doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 com a permissão concedida a partir do editor.

No laboratório, vários modelos animais de sépsis têm sido empregues para compreender a patogénese da sépsis, a fim de desenvolver novas terapias potenciais. Sua relevância clínica continua a ser um objecto de debate antes da tradução bem sucedida de estudos em animais para aplicações clínicas de sepse. Embora os anticorpos neutralizantes contra o citocinas precoces (por exemplo, o TNF) foram protector em modelos animais de endotoxemia / bacteremia ^17,18, eles piorar a sobrevivência em modelo animal de sépsis ^19. Da mesma forma, a maioria dos agentes anti-TNF não conseguiram demonstrar eficácia em ensaios clínicos de sépsis ^20-22. Esta falha reflecte, em parte, a complexidade dos mecanismos patogénicos subjacentes da sépsis ^23,24. Além disso, pode também ser atribuível a armadilhas na selecção de: 1) viáveis ​​alvos terapêuticos ou drogas; 2) dose óptima e de temporização de drogas, e 3) não-realistas medidas resultado clínico (tais como as taxas de mortalidade) ^25.

A recente descoberta de HMGB1 de metas extrato de plantas medicinais e / componentes, incluindo danggui ^26, chá verde ^12,16, e ²⁷ Danshen forneceu exemplos bem sucedidos de investigação pré-clínicos empregando modelos animais de sepse. Outras investigações nesta área irá lançar mais luz sobre as cascatas moleculares subjacentes à regulação da resposta imune inata, e fornecer pistas para o desenvolvimento de terapêuticas para várias doenças inflamatórias. Quando primeiro estabelecer CLP em seu laboratório, o esforço deve ser feito para realizar o procedimento cirúrgico mais rápido e exatamente quanto possível para garantir a reprodutibilidade, especialmente quando se utiliza um grande número (30-40) de camundongos para comparar as taxas de sobrevivência entre vários grupos experimentais de um experimento. A utilização de longa duração, tais como anestésicos (cetamina e xilazina) permite-nos a concluir CLP procedimento cirúrgico de um grande número de ratinhos em um período de tempo relativamente curto e, entretanto, para ajudarremover variação de dose potencial muitas vezes ocorreu quando usando anestésicos voláteis. As taxas de sobrevivência e de acumulação sistêmica de citocinas podem ser tomados como sinais de bom desempenho do procedimento CLP.

Modelo CLP tem sido amplamente utilizada em roedores por causa de vantagens óbvias em baixo custo, simplicidade do procedimento cirúrgico, e extensas patológicos, imunológicos, caracterizações fisiológicas. No entanto, há um certo número de limitações do CLP modelo de rato ^1-3. Por exemplo, como todos os modelos animais, uma disparidade espécies é realçado pelo facto de que a ligadura cecal sem punção pode ser fatal em ratinhos humanos, mas não em. Além disso, devido ao pequeno tamanho de rato e desidratação subsequente à CLP, é muitas vezes difícil de obter amostras de sangue em série para a medição de citoquinas. Estas desvantagens podem ser parcialmente superada pela criação de modelos CLP em animais maiores ^2,3,27,28. Além disso, é importante ressaltar que as taxas de mortalidade eo progresso da peritonite em roedores são em grande parte determinada pela quantidade de extrusão das fezes, que são afectadas pelo calibre da agulha usada para perfurar o ceco, o número de furos, o volume total de ceco ligados ea viscosidade das fezes ^{2, 3.} Além disso, a dose ea frequência da administração de antibióticos na fase precoce da CLP pode também afectar as taxas de mortalidade. Finalmente, fontes animais e do ambiente de habitação também podem contribuir para a variação das taxas de mortalidade.

AES e HW são co-inventores de pedidos de patentes relacionadas com HMGB1 inibidores (tanshinones) como potenciais agentes terapêuticos para sepse.

Este trabalho foi suportado por concessões do National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) e do Centro Nacional de Medicina Complementar e Alternativa (R01AT05076).