Мышь принудительного плавания испытаний

Вынуждены плавать тест проверяется как экспериментальный подход к оценке потенциальных антидепрессантами эффективность у грызунов. Экспериментальные животные помещаются в резервуар с водой и избежать поведения, связанного мобильность количественно. Общих процедур для мыши версия этого теста описаны.

Вынуждены плавать тест грызунов поведенческих тест, используемый для оценки антидепрессантов, антидепрессанты эффективности новых соединений и экспериментальных манипуляций, направленных на оказание или предотвращения депрессивных состояниях. Мыши находятся в неизбежной прозрачной танк, который заполняется водой, и их выход на поведение в отношении мобильности измеряется. Вынуждены плавать тест прост для проведения надежно и с минимальными требованиями к специализированным оборудованием. Успешная реализация вынуждены плавать тест требует соблюдения определенных процедурных деталей и минимизации необоснованного стресс для мышей. В описании протокола и сопровождающие видео, мы объясняем, как вести мышь версия этого теста с акцентом на потенциальные проблемы, которые могут иметь пагубные последствия для интерпретации результатов и как их избежать. Кроме того, мы объясняем, как поведение проявляется в тесте оценивается.

1. Материалы и методы

1.1. Емкости для воды

Цилиндрических резервуаров (30 см высота х 20 см диаметром), необходимые для мыши вынуждены плавать тест (ФСТ) в нашей лаборатории изготавливаются из прозрачного оргстекла, так как этот материал способен выдерживать частые движения танков и несчастных случаев лучше, чем стекло. Уровень воды составляет 15 см от дна и должен быть отмечен на резервуаре, чтобы объем воды был одинаковым во мышей. Количество танков в идеале должно быть как минимум вдвое больше, чем число мышей проходит проверку на времени, так что второй набор резервуар для воды может быть заполнена в то время как первый сет находится в использовании. Размеры танка должны быть выбраны таким образом, что мышь не сможет прикоснуться к нижней части бака, либо ногами или хвосты, во время плавания тест. Высота бак должен быть достаточно высоким, чтобы предотвратить мышей от побега из бака. Пожалуйста, обратите вниманиечто диаметр бака и глубина воды являются важными параметрами, которые могут быть скорректированы, чтобы изменить поведение мышей (для детального анализа этих вопросов см. ^1-3).

1.2. Термометр

Водостойкий инфракрасный термометр является предпочтительным, так как быстрое измерение температуры уменьшает количество времени, необходимого для проведения испытаний. Тем не менее, стеклянные ртутные термометры будут также достаточны для решения этой задачи.

1.3. Таймер

1.4. Устройство видеозаписи

Мы используем видеокамеры поддерживают штатив. Так как этот тест обычно включает в себя несколько животных проходит испытания в то же время, жить забив будет очень сложно и нецелесообразно. Видеокамера должна записи в высоком достаточное разрешение для отображения качества изображения, которое будет использоваться в дальнейшем для поведенческого скоринга. Всегда убедитесь, что имеется достаточно памяти, запись в камеру, прежде чем Startinг теста. Мы используем видео-камеры, которые в электронном формате без использования механических средств массовой информации (то есть видеокассета), что позволяет для цифровой передачи видео. Если Есть чрезмерного размышления о танках, которые могут возникнуть в лабораторных условиях с верхним флуоресцентного освещения, вы можете использовать поляризационные линзы фильтр с вашей камеры.

1.5. Циркуль

В нашей лаборатории мы имеем два набора делителей (35 см высота х ширина 22 см х 22 см глубины). Это прямоугольное с тремя стенами и используются и как фон и как разделители между танками, чтобы предотвратить мышей видеть друг друга во время тестов и, возможно, изменяя их поведение. Один комплект может быть черным для альбиносов и светлые животных; другой набор может быть светлым для темных цветных животных для того, чтобы сделать высокий контраст. Экспериментатор должен убедиться, что поверхность перегородки не слишком отражает таким образом, чтобы они изменяют изображений с камеры, или оказывать основных гifferences между уровни освещенности.

1.6. Белый шум генератора

Это необходимо, в лабораторных условиях, в которых внезапные громкие звуки можно услышать, что потенциально могло бы испугать животных. Генератор шума будет маскировать такие прерывистый тревожные звуки. Уровень громкости генератором белого шума должен быть выбран быть выше других внешних и неожиданные звуки. В нашей экспериментальной комнате уровень окружающего шума (без генератором белого шума активирована) составляет 60 дБ. Общий уровень шума с генератором белого шума активируется в месте, где танки находятся в 70-72 дБ. Однако следует отметить, что эти цифры приведены в качестве примера только, и каждая лаборатория должна выбрать соответствующий уровень шума в соответствии с их уникальной окружающей среды и обстоятельств.

1.7. Сушка бумаги и тепла лампы

Перед возвращением животных на своих клетках дома, важно сухойих мягко с использованием бумажных полотенец и было бы полезно использовать тепло лампы (быть уверены, допустимая температура не превышает 32 ° C), чтобы предотвратить переохлаждение.

2. Поведенческие процедур

1. Общий экспериментальный дизайн должен отражать надлежащий противовес между переменные, характерные для эксперимента. Например, в наших экспериментах, мы стараемся для представления каждой группы в равной степени во всех ФСТ сессии (т.е., если Есть четыре группы, каждая из них будет представлена ​​в каждой сессии). Кроме того, мыши вращаются, например, что у мышей из каждой группы находятся в различных танка в каждой сессии.
2. Место камерой и делители в нужном положении. Камера должна быть как можно ближе, чтобы получить максимально возможное разрешение мыши.
3. Танки должны быть заполнены водопроводной воды установлен на уровне комнатной температуре (23-25 ​​° С) до определенного уровня, который отмечается на стенках резервуара. Если ваш объект не имеет постоянной горячей / холодной ватер, вы можете подготовить горячую воду и / или льдом, чтобы быстро довести воду до нужной температуры. Проверьте температуру воды с инфракрасным термометром. Или же, если температура горячей и холодной воды постоянны на вашем предприятии, вы можете нарисовать на танке двух марок - по одной на уровень горячей воды и второй знак для добавления холодной воды - чтобы быть ближе к правильной окончательной температура воды быстро.
4. Начало генератором белого шума, если используется, прежде чем мышей знакомятся с тестирования комнате. Уровень белого шума должен только быть достаточно, чтобы замаскировать внешние шумы. Избегайте большого объема и убедитесь, что такой же уровень белого шума используется для всех животных.
5. Принесите животных в тестировании комнате. Если колонии комнату, где животные живут и тестирования комнаты смежные или очень близко друг к другу, условия окружающей среды подобны и нарушения во время перемещения клетки минимальна, то никакой акклиматизации период будет необходимо. В противном случае, место животных в тестировании возможностей для периода акклиматизации (как правило, не менее одного часа). Если акклиматизация период необходим, убедитесь, что приспособиться животные не повлияет на мышах проходит испытания в то же время в одной комнате. Помните, что обонятельные и ультразвуковые сигналы могут восприниматься другими животными помещаются в одной комнате.
6. Начало записи видео до размещения животных в емкости для воды.
7. Держите животное за хвост, и мягко и медленно место в воде. Как только мышь находится в воде, медленно высвобождают хвост. Как правило, с помощью этой процедуры будет препятствовать головы животного от погружения под воду.
8. Место мышей в танки в порядке, в котором обструкция запись будет сведена к минимуму. Этот порядок, конечно, должны решаться совместно с противовесом групп и других требований, специфичные для вашего эксперимента.
9. После того как все мыши в баках запуска обратного отсчета на секундомер. Обычная длина испытанием для мышей составляет шесть минут в ФСТ.
10. Во время теста быть уверены, вы находитесь на разумном расстоянии от животных и не делают никаких движений или шума, которые могут быть замечены животных. Мыши легко плавать в воде, однако, если либо новый штамм мышей или новое соединение проходит испытания без предварительного знания о их влиянии на поведение плавание, экспериментатор должен контролировать животных поближе. В отличие от крыс, мышей обычно не нырять в ФСТ, однако в случае погружения мыши должны быть удалены из бака. Если экспериментатор выходит из комнаты мышей должно контролироваться видео в том случае, если мышь не может поддерживать плавание и плавающие поведение и прекратить испытания, если это необходимо.
11. По истечении шести-минутного периода тестирования остановить запись. В нашей лаборатории, мы показываем отметку напротив камеры, которая идентифицирует животных в самом концекаждой записи. При использовании этого подхода отдельных впоследствии забил записи не будет знать личность животных так как тождество отображается только в самом конце записи. Это предотвращает выявление и учет проблем, которые могут возникнуть позднее, связанных с записями. Независимо от того, учет стратегии, которая используется, он должен четко определить животных, а также предотвращения отдельных позже забил тестов от того, знание групповых заданий.
12. Удалить животных из воды за хвосты в том же порядке, что вы положили их в сухом и аккуратно их сушки бумаги и поместите обратно в свои homecage.

3. Анализ поведения

1. Мышь версия ФСТ, как правило, от начала до конца, шесть минут. Однако, как правило, только за последние четыре минуты испытаний анализируются. Это связано с тем, что большинство мышей очень активны в начале ФСТ, и рotential эффекты лечения могут быть не видны в течение первых двух минут.
2. В нашей лаборатории мы загружать видео-файлы непосредственно с камеры на ПК и сделать анализ на ПК.
3. Во время поведенческий анализ, время, которое каждый тратит мышей мобильных измеряется. Общая сумма мобильность время затем вычитается из 240 секунд время тестирования, а затем заявил, как неподвижность времени. Хотя вполне возможно, для измерения неподвижность времени прямо, в нашей лаборатории, мы обнаружили, что легче обнаружить и измерить активных движений, а не отсутствие такого движения.
4. Наиболее важным аспектом поведенческого анализа и обычно самый большой источник изменчивости между наблюдателями в ФСТ является правильной идентификации движений, которые считаются добросовестными мобильности. Наше рабочее определение подвижности в FST-либо движений, кроме тех, которые необходимы, чтобы сбалансировать тело и держать голову над водой ⁴. Мыши обычно плавают в воде легко, однако они по-прежнему проявляют небольшие движения, чтобы сбалансировать их тела и держать голову над водой. Такие действия не являются попыткой побега и не должен быть засчитан как мобильность. Кроме того, после одного боя подвижности, хотя по существу неподвижны, мыши все еще может дрейфовать в воду в результате импульса. Эти движения также не должен быть засчитан как мобильность.
5. В нашей лаборатории мы используем на экране секундомер программное обеспечение (XNote секундомер, dnSoft Research Group) для измерения времени. Два отдельных секундомеров, используемых на экране. Первый секундомер отсчитывает от 240 секунд и оповещения наблюдателя при анализе поведенческих период заканчивается. Второй секундомер измеряет время провел мобильного телефона. Некоторые программы секундомер имеет возможность назначать ключи для запуска и остановки функций, так что на экране секундомеры можно управлять с помощью клавиатуры. В нашей лаборатории, вместо обычной клавиатуры, мы используем устройства ввода широко известный как"геймпад" для управления секундомеры.
6. При использовании ПК количественно неподвижность, если есть больше чем одна мышь проверены и присутствует на экране, это хорошая идея, чтобы покрыть другие животные (вы можете использовать другую программу, окно или физически крышки экрана с бумагой), так что их движения не будет отвлекать наблюдателя.
7. Если на экране секундомер используется, убедитесь, чтобы охватить все, но миллисекунды десятичные дроби из секундомер. Причина этого в том, чтобы предотвратить смещение в наблюдателя, хотя и предоставляет возможность определить, если посмотреть работает или не работает. Так как наблюдатель, в то время как слепы к группе заданий животных, будут иметь общее представление о уровень мобильности в мышей, там могут быть некоторые смещения, происходящие, если она допускается, чтобы увидеть общее количество времени, прошедшего мобильности для данного конкретного мыши до завершения анализа сессии. Прикрывая секундомер, она будет только знать, секундомер включен или выключен в любой момент, но Вильл не знаю, общее время прошло, и поэтому не может быть осуществлена ​​любым уклоном.
8. Между наблюдателями надежности тест должен проводиться для каждого нового наблюдателя, прежде чем начать собирать данные из подопытных животных. В нашей лаборатории, каждый новый наблюдатель первые часы опытные забил наблюдателя. После нового наблюдателя пользуются их доверием дифференцировать мобильности от неподвижности, они потом счеты с опытным наблюдателем заниматься указывая на ошибки. Как только этот этап успешно завершен, новый наблюдатель будет анализировать определенный набор ФСТ видео, которые мы держим в нашей лаборатории в учебных целях. Только после того, высокий уровень между наблюдателями корреляция полученных опытный наблюдатель делает следователь начать анализировать ФСТ видео в реальных экспериментах. Мы архива данных из этих учебных анализов, чтобы составить внутренний стандарт для лабораторий для дальнейшего использования. Мы наблюдали различия между штаммами в порядке, в котором они выражают Mobility (и неподвижности) поведения, а среднее время неподвижности между полами. Когда новый штамм мыши, пола или генетически модифицированная модель тестируется в лаборатории необходимо снова провести этот тип анализа надежности.

4. Представитель Результаты

Существуют заметные различия между генетически различных инбредных и беспородных линий мышей с точки зрения их неподвижность базовые и реагирования на конкретные наркотиков ^5-11. Например, мы определили дифференциальных антидепрессантом, как ответы на лития в панели мыши штаммов (рис. 1) ^5. Экспериментальные детали этого эксперимента опубликованы в Кан и соавт., 2011 ^5.

Рисунок 1. Неподвижность время (в секундах) в вынуждена плавать испытание, через пять часов после Single IP инъекции физиологического раствора, 200, 300 или 400 мг / кг в различных инбредных и НУtbred мыши штаммов. * Р <0,05, ** р <0,01, ***: р <0,001 обозначают существенное различие по сравнению с солевой группы, постфактум тест Даннетта. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Количество животных в каждой группе для каждого штамма составляет 6-8 (рис. воспроизводится из ^5).

Не все штаммы мыши подходит для ФСТ. Некоторые штаммы, такие как черный швейцарский, NIH Швейцарии, и FVB / штат Нью-Джерси показывают, мало или почти нет неподвижности под контролем условий, поэтому представляющие этаже эффект (рис. 1) ^5. Отсутствие исходных неподвижность эффективно предотвращает обнаружение анти-депрессанты эффект экспериментальной манипуляции. Возможно также, в то время очень редко, что некоторые штаммы мышь может вести себя аберрантно и погрузиться в бак в ходе испытаний, хотя они могут плавать. Одним из таких штамм DBA/1OlaHsd (неопубликованные наблюдения в нашей лаборатории). Такие штаммы, не подходят для ФСТ. Из-за этого риск дайвинга, однако маленькийл, при тестировании нового штамма, который не был ранее протестированных в ФСТ или мыши укрывательство новые генетические манипуляции, необходимо внимательно наблюдать начальные испытания, чтобы спасти мышей, если они участвуют в потенциально опасного поведения.

В опытно-конструкторских, описанные здесь, несколько животных (до пяти) проходят испытания в то же время. Хотя мы используем делители предотвратить мышей видеть друг друга во время теста, и генератором белого шума подавляет звуковой вокализации, наши настройки не мешает все ультразвуковой или обонятельные сигналы от передается. Хотя маловероятно, учитывая характер испытаний, они могут влиять на поведение мышей. Одним из решений этой проблемы было бы проверить животных в индивидуальном порядке. Однако такой подход имеет свои собственные проблемы. Например, обычно, подопытных животных в каждой сессии из той же homecage. Это позволяет рандомизации и противовеса из экспериментальных переменных. Тестирование отдельных мышейLy будет означать удаление одного мышь на время от homecage. Это приведет к тому повторяющиеся стрессы и нарушения социальной иерархии в клетке среди других остались позади. Еще одна проблема с тестированием отдельности являются временные ограничения. Тестирование одна мышь на время продлит эксперимент на несколько часов приводит к ситуации, в которой проходят тестирование мышей в разное время циркадного цикла. Это может создать смешанные времени суток эффекты. Исследователи должны держать эти вопросы в виду при проектировании своих экспериментов.

ФСТ (иногда называемый тест Porsolt плавать) был разработан первый для крыс, а затем модифицирован для мышей Porsolt и коллеги ^12,13. В дополнение к описанным выше протокол успешных в нашей лаборатории, число в значительной степени тонкие модификации теста были опубликованы (см. Hascoët и Bourin за полный обзор ^1). Это общий тест, используемый для оценки эффективности антидепрессантов и влияние различных поведенческих и нейробиологических манипуляции в области фундаментальных и доклинических исследований ^3,14-16. Он был описан как оказание ситуации, в которой "поведенческие отчаяния" индуцированный, то есть, животное теряет надежды избежать стрессовых условиях ^13. Мышь версия вынуждены плавать тест относительно короткий и низкая стоимость поведенческих тестов, не требующий подготовки мышей и может быть проведена с минимальными оборудования. Это в отличие от крыс версия теста, как правило, предполагаетс воздействием водяной бак за день до теста ^17-й день.

Из-за его популярности есть огромное количество данных о влиянии различных антидепрессантов в ФСТ. Это позволяет исследователям сравнить и сопоставить свои результаты с другими (см. Hascoët и Bourin на 2009 год обзор ^1). Эти характеристики делают его FST важным инструментом в научных исследованиях и лекарств в промышленных условиях, где надежность и высокопроизводительного скрининга новых соединений являются существенными. Дополнительной особенностью FST является наличие коммерческого автоматизированного анализа поведения систем, которые могут ускорить процесс сбора данных ^18-20. Однако, по нашему опыту, эти автоматизированные системы требуют тщательную проверку на человека скоринга. Кроме того, автоматизированные параметры могут быть скорректированы при использовании различных штаммов, особенно когда уровень изменения фона контраста, или с мышей разных ыхарактеризует или поведенческих реакций.

Еще одна область, в которой используется FST является neurogenetic исследование, в котором генетическая основа депрессии поведения, связанного исследована. Эти виды исследований включают сравнение различных линий мышей с использованием или без использования антидепрессантов и сравнения генетически модифицированных или выборочно разводили мышей и их диких коллегами типа ^6,21-23. В связи с этим ФСТ оказался полезным в области фундаментальных исследований, связанных с нейробиологии и генетики аффективных расстройств. Однако ФСТ не полный аналог спектр человеческих депрессии. Даже если Есть исключения, ФСТ имеет значительный уровень прогностической валидности, так как он достаточно чувствителен к соединениям, которые являются эффективными в организме человека, как антидепрессанты и нечувствительны к тем, которые не являются эффективными ^24,25. С поведенческой результат FST одномерно он может указать только антидепрессантами эффективность соединения или бывшихЭкспериментальные манипуляции, но он не может отличить механистической различия между ними. Это в отличие от крыс версии FST, где крыс проявляется как плавание и скалолазание поведения, которые могут различать серотонина и норадреналина действующих соединений ^26. Кроме того, любые манипуляции, которые могут повлиять на общий уровень активности может потенциально изменить неподвижность в ФСТ приводит к ложным выводам. Поэтому важно, чтобы проверить результаты FST с отдельными поведенческие тесты, которые измеряют общую активность, такие как открытые полевые испытания ^1,27. Это выгодно, чтобы иметь в виду, что ФСТ не представляет состояние человека, а также степени, в которой основной нейробиологических механизмов поведения проявляется по модели животных в ФСТ и человеческого перекрытия депрессии не совсем ясно, ^28. Тем не менее, эти виды ограничения не должны обесценивать полезности FST как создание лекарств и проверки инструмента.

Авторы заявляют нет конфликта интересов.

Это исследование было поддержано грантом NIHM R01 и R21 MH091816 MH084043 к ПОГ.