Количественное сравнение СНГ-Регуляторного элемента (CRE) Деятельность в Трансгенные Дрозофилы

Фенотипической изменчивости признаков, может быть результатом мутации в цис-регуляторных элементов (CRE) последовательности, шаблоны управления экспрессии генов. Методы получены для использования в дрозофилы могут количественно сравнить уровни пространственные и временные паттерны экспрессии генов посредничестве изменение или естественные варианты CRE.

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism′s program for development¹, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution^2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation^5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics.

Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE′s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster⁷ has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites^8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity^11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols.

Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE′s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE′s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Обзор:

Это видео демонстрирует протокол способны количественно измерить ген регулирующей деятельности для цис-регуляторных элементов (CRE) последовательностей у дрозофилы (D.) MELANOGASTER. Этот протокол может быть использован для сравнения регулирующей деятельности обладают: дикого типа и мутантных форм CRE, естественные CRE аллели найдены в пределах одного вида, или ортологичных Црес между разошлись видов.

1. Сайт-специфическая интеграция репортер трансгенов в геном дрозофилы

А. Reporter трансгена строительства

1. В качестве первого шага, любое CRE оцениваться должны быть отдельно клонировали в вектор репортера, который содержит (1) attB бактериальных последовательностей сайта вложений используются для конкретных участков интеграции трансгена ^8-11, (2) сайт множественного клонирования вверх по течению (3) гетерологичных промоутера, за которым следует (4) кодирующей последовательности для флуоресцентногобелка (например, EGFP или DsRed).
2. Хотя любой вектор может быть совместима с phiC31 опосредованного сайт-специфической интеграции путем введения attB последовательности в вектор позвоночника, вектор pS3aG12-14 может быть получен из плазмиды addgene хранилища (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG является специальной версии P основе преобразования vector15, в котором один из двух изоляторов цыганский был заменен изолятор SfIb, он содержит расширенный сайт множественного клонирования, и обладает 250 пар оснований последовательности, содержащей attB сайта привязанности. Црес интерес вставляются сайт множественного клонирования перед hsp70 минимальный промотор и ген, который кодирует EGFP расширенная версия Зеленый флуоресцентный белок, который локализуется в ядре.

Б. Сайт-специфическая интеграция репортер трансгенов

1. Для набора Црес, деятельность которых будет сравниватьг как часть векторов репортер трансгена, созданных векторов отдельно интегрирована в том же месте посадки генома. Здесь phiC31 фага интегразы белок катализирует однонаправленное рекомбинации между бактериальной (attB) места прикрепления в векторе трансгена и genomically расположен фага (attP) места прикрепления ^9. Несколько групп ^8-11 внесли разнообразие трансгенных линий, которые включают attP сайта (так называемых посадочных площадок) и содержат генома источник ⁸ из phiC31 которая выражает этого белка в половых клетках. Эти летать запасы могут быть легко получены из Блумингтон дрозофилы фондовый центр (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
2. Опубликовала протокол существует подробно, как создать трансгенные дрозофилы сайта специально использованием phiC31 интегразы ^16. Оборудование и технические знания, чтобы сделать трансгенный ли Drosophilaпрочие больше не требуется, как несколько производителей существует (табл. 1), которому эта услуга может быть на стороне.
3. Трансгенные поведение может сильно варьироваться от одной ткани к другой ^11. Таким образом, одно приземление attP сайт не является оптимальным для анализа всех Црес, стадии развития, и / или тканей исследования. Желательно, чтобы оценить активность CRE интерес в нескольких различных местах высадки на берег, чтобы найти место, где деятельность CRE является представителем эндогенного гена-мишени (ы) выражение шаблону.
4. Для получены трансгенные линии, желательно, чтобы сделать их гомозиготных по трансгена. CRE деятельности, как правило, более надежные в людях, с двумя копиями трансгена и для количественных измерений крайне важно, чтобы сравнений между людьми с тем же числом копий трансгенов. Гомозиготные лиц может быть получена с помощью балансировки хромосом. Для хорошо характеризуется посадочных площадок, хотя, это часто бывает сimpler собирать девственница самцов и самок, и кросс тех, с более интенсивным фенотип цвет глаз предоставляемых мини-белого гена (рис. 1), а белый мутант спасательных предоставляемые комплексная борьба с переносчиками трансгена является более драматичной у лиц с двух векторных экземпляров.

2. Получение образцов или тканей соответствующей стадии развития

Взять пробы для анализа в то время в развитии, когда картина экспрессии генов (ы), представляющих интерес происходят (ы) эндогенно, следовательно, время, когда CRE под расследование должно активировать выражение гена-репортера. Для дрозофилы, это может быть либо в зачаточном состоянии, личиночные, куколки или взрослой стадии. Ниже мы опишем метод стадии взрослого и метаморфических мух; последний из которых происходит внутри пупария, жесткий личиночной кожи, который содержит неподвижный образец, пока он ecloses как взрослый.

1. Развернуть трансгенных линий для обеспечения specimENS собственно этапе доступны при готовы проанализировать выражение гена-репортера с помощью конфокальной микроскопии. Настройка два флакона каждый с несколькими (~ 5 - 10) мужского и женского мух. На переменном дней, удар мух от одного из флаконов на неиспользуемый флаконе. Повторите это в течение недели. По прошествии двух недель, трансгенные мухи будут доступны в диапазоне от личиночной для взрослых стадиях развития.
2. Постановка взрослых мух: продолжительность времени, проведенного в пупария составляет 98 часов для женщин и 102 часов для мужчин, когда воспитан при 25 ° C. Взрослые мухи могут быть легко собираются, когда они выходят из пупария (так называемый eclosion). Это timepoint можно считать 0 часов после eclosion. Взрослые мухи могут быть выращены до необходимых timepoint для анализа. Например, CRE называется мел-OE1 которая контролирует экспрессию генов в desatF взрослых oenocytes Д. MELANOGASTER женщины не активен сразу после eclosion но CRE деятельности SWItches на после одного дня ^14. При правильном этапе получается, обезболить мух и расположить в капле Галокарбоновое масло на предметное стекло и приступить к конфокальной оценки.
3. Постановка образцов в ходе метаморфоза: В конце третьего возраста личиночной стадии пупария формируется. Хотя на этой стадии животное технически еще третья взрослой личинки, эта стадия развития легко идентифицировать как образец не является мобильной, пупария мягкий и белый, и дыхальца есть вывернутые (рис. 2). Это timepoint можно считать 0 часов после Пупарий Формирование (hAPF). На этой стадии мужчины можно отличить от самок наличием двусторонней расположены гонады около середины тела, которые выглядят как полупрозрачные круги (коробку на рис. 2A и показано черными стрелками в 2А ").

1. Постановка основана на длине метаморфозы:

При 0 hAPF, образцы могут быть переданы на свежем флаконеили чашки Петри использованием смоченной кистью. Чтобы сохранить образцы от высыхания, добавить кусок Kimwipe и смачивают водой. Флакон Передача или блюдо 25 ° C инкубатор до нужной hAPF.

2. Постановка видимых морфологических особенностей:

Очень часто неудобно для анализа образцов для CRE деятельности на конкретных timepoint следующие коллекции образцов hAPF 0. Кроме того, можно определить правильно поставил образцов в то время, удобное для анализа, основанного на наличие и позиции некоторых морфологических маркеров (подробно изложено ниже), которые видны через пупария или после пупария удаления (рис. 2).

2а. Морфологические критерии аппроксимации метаморфического этапа:

• 0 hAPF: Белый prepupa стадии, когда личинка перестает двигаться, на переднем дыхальца вывернутые (стрелка на рис 2А.), Боковые трахеи видимым; мягкий белый пупария (рис. 2).
• ~ 14 hAPF:Пупарий загорелые и закаленные; голову мешок вывернутые, боковые трахеи и половых желез менее четкая, ноги и крылья полностью вытянута вдоль живота; мальпигиевых канальцев еще не известных и зеленый (пунктирная коробку область на рис 2B.); Глаза непигментированных (рис. 2В) .
• ~ 25 hAPF: Две параллельные мальпигиевых сосудов известных и зеленого цвета (пунктирная коробку область на рис 2С.).
• ~ 40 hAPF: Темно-зеленый желтого тела, расположенный между передними концами мальпигиевых трубочек (красная стрелка на рис 2D.).
• ~ 50 hAPF: Желтый тела расположены на средней точке мальпигиевых трубочек (. Коробках область на рис 2Е и расширен в 2E'') и глаза янтарного цвета, если дикого типа гена для белых (необходимо для красного цвета глаз) . Цвет глаз не хватает на данном этапе, когда белый мутантного фенотипа спасает мини-белый ген, который является частью интегрированной репортер трансгена вектор (рис. 2Е).
• ~ 70 hAPF:; (. коробках область на рис 2F коробку и расширен в 2F'') Спинной и грудной microchaetae macrochaetae видимым (рис. 2F, стрелка) желтого тела расположены на задней из канальцев мальпигиевых; цвет глаз бледно розовым, когда спас мини-белого гена (рис. 2F).
• ~ 80 hAPF: Wing советы серый; мальпигиевых канальцы расположены между передней к середине живота (. Коробках область на рис 2G и расширен в 2G »); складки между сегментов брюшка и щетинки на брюшных тергитах видны (рис. 2G и 2G »); и спас цвет глаз ярко-красная (рис. 2G).
• ~ 90 hAPF: Крылья затемненные до черного; мальпигиевых трубочек и желтого тела скрыта загара тергитов; грудной (стрелка) и брюшные щетинки зрелой и затемненные (рис. 2H), а также зеленые мекония появляется в спинной заднем конце брюшка ( Рис. 2H'').

Примечания:

1. На лаТе стадиях метаморфоза, пол образцов может быть определено половых морфологии (наконечники стрел на рис. 2I и 2J) или наличие затемненных секс гребни на первый набор мужских ног.
2. Далее точность в постановке может быть достигнуто путем рассмотрения дополнительных морфологических маркеров, как описано выше ^17.

Д. шаги, чтобы удалить образец из пупария:

1. Использование лаборатории лента придерживаться кусок упаковочной ленты для вскрытия доска с липкой поверхностью вверх.
2. Влажная кисть и примените влаги pupariated образцов. Использование кисти, передача образцов Kimwipe.
3. Использование щипцов или кисти, образцы, трансфер в упаковочной ленты и придерживаются со спинной поверхности, обращенной вверх (изогнутой стороне пупария).
4. Разрешить образцов высохнуть в течение ~ 15 минут. Сухой пупария гораздо легче открыть, чем те, которые являются влажными. На данный момент образцы могут быть грубо постановке морфологическоговыделение их через пупария.
5. Использование щипцов, постепенно открываются пупария начиная с передней крышечки и приступить к заднему концу. Если более мелкомасштабные рассечение необходимо выделить конкретные ткани это может быть сделано в часовое стекло с раствором PBS. В противном случае, передача куколки, чтобы капли вязкой HC700 Галокарбоновое масло (Sigma-Aldrich) на предметном стекле микроскопа.
6. Размещайте образцы на слайде, с помощью стереомикроскопа, и используя описанные выше критерии (раздел 2, а) стадия образца может быть определена ..

3. Конфокальной микроскопические оценки репортер экспрессии генов в выборке горе

1. Для образцы цельной горы, использовать или 4X или 10X целей. Использование флуоресценции стимулируется воздействием ртутная лампа, или же при просмотре в светлом поле, настроить столике микроскопа в положение образца в оптическом поле, то принести образец в центре внимания.
2. Использование конфокальной microscoPE программного обеспечения, настройки длины волны возбуждения для EGFP (или подходящей длины волны при использовании другого флуоресцентного белка).
3. Для предотвращения фотообесцвечивания образца, начинается с интенсивности лазерного излучения на 5-10%. Если сигнал в восторг, затем увеличьте интенсивность по мере необходимости.
4. Для того, чтобы улучшить отношение сигнал-шум для конфокальных изображений, позволяют настройки программного обеспечения, что средние измерения пиксела повторить сканирование, такие, как Кальман усреднения или линии и стек усреднения. По нашему опыту Кальман среднем в течение трех сканирует улучшает отношение сигнал-шум, не делая время для коллекций изображений слишком долго.
5. Для количественного сравнения деятельности CRE важно, что интенсивность флуоресценции для образца имеет не насыщен многими пикселей. Использование Z-раздел, где флуоресценции наиболее интенсивным, необходимо настроить так, что несколько пикселов насыщены. Это может быть сделано за счет перехода на насыщение предупреждения таблицы поиска и настройки каналов напряжения, усиления и смещенияв условиях, когда несколько пикселов насыщены. Наконец, для того, чтобы собрать достаточно сигнала от образца, часто необходимо корректировать конфокальной диафрагмы.
6. Как только оптимальные параметры определяются, запустите Z-сканирования.
7. Когда сканирование завершено преобразование изображения стека в проекции и сохранить этот образ в меткой Формат изображения файла или "TIFF".

Примечание:

1. Очень важно использовать тот же конфокальной настройки для всех копировать образцы и линии репортер трансгенов, которые будут включены в количественное сравнение деятельности CRE.

4. Количественная цис-регуляторных элементов деятельности

Хотя некоторые конфокальной приобретение программного обеспечения позволяет для дальнейшей обработки проекционных изображений, мы предпочитаем использовать в свободном доступе Изображение J программное обеспечение для оценки конфокальных изображений ^18. Использование изображения J ¹⁸ записанных шаблонов выражения GFPможет быть определена количественно как пиксельные статистику значение в пределах указанного района. Хотя изображения не должны быть в серой шкалы мы предпочитаем делать это.

1. С помощью программы изображения J начала, откройте изображение TIFF должны быть оценены.
2. Нажмите на кнопку выбора руки и наметить области образца, где количественный желательна, например региона на рисунке 3, в желтой пунктирной границей. (См. примечание ниже по поводу выбора области для количественной оценки.)
3. Чтобы получить значения пикселов статистики, щелкните на вкладке Анализ и выберите меру. Результаты окно показывает области, а значит, минимальные и максимальные оценки значение пикселя. Запись средний балл значение пикселя и повторите для генерации пикселей статистику значение для репликации образцов (см. примечание о б повторить номер).
4. Мы рекомендуем собирать второе значение пикселя означает от управления регионом, где CRE не активен, например области на рисунке 3, в пределах красной пунктирной границы. Последний валие может быть вычтен из прежнего значения, чтобы удалить фоновые эффекты от измерений, чтобы получить уточненное значение пикселя в виду. По нашему опыту это еще больше снижает различия между копировать образцы (см. примечание в отношении выбора размера для управления региона).
5. Используйте скорректированное среднее значение пикселя из копировать образцы для вычисления средней нормативной деятельности для CRE и стандартная ошибка среднего. Этот нормативный значение деятельности и измерение ошибки может быть по сравнению с другими трансгенов репортера, где последовательность CRE отличается (например, рисунок 3).

Примечания:

1. Изображение J позволяет пользователю выбирать определенную форму и площадь, из которой средний балл значение пикселя будет определяться. Однако, как образец размером часто меняется, мы предпочитаем использовать инструмент Freehand выбор указать область, которая будет оцениваться для каждого образца.
2. Большее число повторяет (N) приводит к лучшей оценке среднего регулярноlatory деятельности для данной CRE. Мы находим, что N от 4 до 8, как правило, достаточно.
3. По нашему опыту размер элемента управления районе, выбранном мало влияет на измеренное значение означает пиксель для управления региона. В общем, мы выбираем район пропорциональна по размерам к сфере интересов.

5. Представитель Результаты:

Дикие версии типа D. MELANOGASTER CRE, называемый диморфных Элемент ^13, диски высокий уровень экспрессии репортер EGFP в A6 брюшной сегмент женской куколки (рис. 3А). 13 пар оснований последовательности внутри этого элемента было установлено, что сайт связывания транскрипционных факторов DSX, а в естественных условиях важность этой последовательности может быть продемонстрировано с помощью количественной регулирующей деятельности для этого CRE, когда этот сайт связывания мутирует. Учитывая регуляторной активности диких Элемент диморфных типа на 100 ± 5%, мутации этого DSX сайта снижается регрегулирующей деятельность до 28 ± 3%. Подобные сравнения можно сделать регулирующей деятельности для внутривидовой аллелей CRE или между ортологичных Црес из отдельных видов. Например, рассматривая уровни EGFP в женском A6 сегменте обусловлен D. MELANOGASTER Кантон S деформации, регулирующей деятельности 100 ± 4%, ортологичных Црес для вида D. simulans и D. willistoni оказались соответственно обладают регулирующей деятельности, равной 75 ± 4% и 0 ± 0% (рис. 3В).

Рисунок 1. Использование интенсивность белого-спасательных глаз фенотип, чтобы сделать гомозиготных трансгенных линий. Для того, чтобы количественно оценить репортер трансгенов важно, чтобы каждый образец имеют одинаковый генотип трансгена репортер. (А) белый ген мутанта генетический фон с сайта последовательность посадки attP используется для сайта-х годов pecific трансгена интеграции. Трансгенные лиц (B) hemizygous и (С) гомозиготных по комплексной борьбы с переносчиками обычно можно отличить по интенсивности спас фенотип цвет глаз на количество копий интегрированных мини-белый ген. Гомозиготные линии могут быть созданы путем скрещивания (C) мужского и женского мух с темным цветом глаз фенотип.

Рисунок 2. Использование морфологических маркеров для определения стадии метаморфизма для дрозофилы. Во время метаморфоза из личинки во взрослую плодовой мухи, образца переходы через ряд стереотипных морфологии, которые могут быть использованы для определения пола и приближенные стадии разработки. Образцы в Боснии и Герцеговине, были удалены из их пупария. Коробки в панелях, E, F, G и Н указывают на масштаб изображения в регионах, соответственно, для панелей ", Е", F ", G", и Я ".

"Рисунок 3" SRC = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Рисунок 3. Количественное сравнение цис-регуляторных элементов деятельности. Для всех образцов EGFP-репортер экспрессии генов посредничестве частности диморфных элемент был оценен у женщин на 80 часов после пупария образования. Число в верхней части каждого изображения EGFP-уровень экспрессии для образца, которая рассчитывается как среднее значение пиксела для A6 брюшного сегмента (показан для верхнего левого наиболее изображение в качестве региона в пунктирной желтой каймой) минус означает значение пиксела для A4 сегмента (коррекция фона; показан для верхнего левого наиболее изображение в качестве региона в красной пунктирной границы). Для каждого репортера трансгена четыре повторяет были оценены для расчета среднего сегмента А6 значение пикселя. Регуляторная деятельность сообщается как% от (А) или дикого типа (В) напряжение Кантон S женщины среднего значения пикселя ± SEM. (А) GFP выражение для женщин обладающих дикой аллель типаДиморфных элементов и мутант версия, где один сайт связывания транскрипционных факторов DSX была удалена. Этот мутант сайт связывания уменьшается диморфных активности элементов до 28 ± 3% от диких последовательность типа. (B) Сравнение регулирующей деятельности для последовательностей ортологичных к Д. MELANOGASTER (штамм Кантон S) диморфных Element. Учитывая, опосредованное GFP выражению Д. MELANOGASTER диморфных аллель Элемент за 100%, ортологичных последовательностей из близких видов D. simulans и D. willistoni соответственно обладают деятельности 75 ± 4% и 0 ± 0%.

6. Материалы

цис-регуляторных элементов генома кодирует программу, которая определяет экспрессию генов моделей и тем самым процесс развития ^1, и видных местах для обеих мутаций основной морфологической эволюции ^2-4 и фенотипические вариации для человеческих черт ^5,6,19. Несмотря на это значение, нормативно логику Црес остаются недостаточно изучен. Видных причин этого понимания дефицита является отсутствие подходящих методов количественно сравнить функциональные последовательности Црес. Здесь мы приводим протокол, который извлекает выгоду из усовершенствованных методов трансгенез для D. MELANOGASTER добавить количественный аспект изучения Црес.

По нашему опыту, когда количественное регулирующей деятельности КРР, различия между повторить образцов в 10% или меньше установленного значения пиксела в виду, когда повторяет: (1) той же стадии развития, и (2) репортер трансгенв том же месте посадки генома. Эта сумма вариации соответствуют тем, которые определены для Црес представлены на рисунке 3, и места ограничений на использование этого количественный метод к ситуациям, когда генетически различные версии CRE различаются по регуляторной деятельности на величину более 10%. Важно не менее, это ограничение значительное улучшение по сравнению качественного описания «приведенной» или «увеличить», что те, изучения Црес ранее приходилось использовать при описании различной деятельности.

Когда версии CRE, как известно или найти количественно отличаются по своей регуляторной деятельности, этот протокол делает возможным определить, какие из мутационные различия ответственны за или внести вклад в деятельность разница ^12,13. Способность идентифицировать эти функционально-соответствующие мутации является необходимым первым шагом для определения молекулярных механизмов, таких, как прибыль или убыток от transcription сайтов связывания факторов, в результате чего CRE деятельности отличаются. Заглядывая вперед, использование этого протокола для других Црес дрозофилы и применения подобных методов в протоколы для других организмов, модель должна позволить лучше понять логику CRE появляться. Это включает в себя способность различать функционально соответствующие CRE мутации из трясины функционально-нейтральные мутации.

Нам нечего раскрывать.

Мы благодарим: Николас Gompel и Бенджамин Prud'homme за их вклад в развитие этого протокола, Мелисса Уильямс и четыре анонимных рецензентов для комментариев по рукописи; университете Школы Высшей Дейтон для исследовательских стипендий для войны, и университета Дейтона биологии Департамента и научно-исследовательского института (UDRI) для поддержки исследований для TMW. Работа выполнена при поддержке Американской ассоциации сердца Грант 11BGIA7280000 на TMW.