Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster

Phänotypische Variation für Züge können durch Mutationen in cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die Kontrolle Genexpressionsmuster führen. Methoden für den Einsatz in Drosophila melanogaster abgeleitet werden können quantitativ vergleichen Sie die Ebenen der räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression durch modifizierte oder natürlich vorkommende Varianten CRE vermittelt.

Genexpressionsmuster von cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die auch als Enhancer oder cis-regulatorischen Modulen angegeben. Ein typisches CRE besitzt eine Anordnung von Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren Proteine, die eine regulatorische Logik angeben, wann, wo und auf welcher Ebene die regulierten Gens (s) zum Ausdruck zu verleihen. Der vollständige Satz von Cres in ein Tier Genom kodiert des Organismus Programm für die Entwicklung ¹ und empirische als auch theoretische Studien zeigen, dass Mutationen in Cres eine herausragende Rolle spielte in morphologische Evolution ^2-4. Darüber hinaus deuten die menschliche genomweiten Assoziationsstudien, dass die genetische Variation in CREs tragen wesentlich zur phänotypischen Variation ^5,6. So Verständnis regulatorischen Logik und wie Mutationen betreffen solche Logik ist ein zentrales Ziel der Genetik.

Reporter Transgene bieten eine leistungsfähige Methode, um die in vivo Funktion StudieTION Cres. Hier ist ein bekannter oder vermuteter CRE-Sequenz ist zu heterologen Promotor und kodierenden Sequenzen für ein Reporter-Gen kodiert ein leicht beobachtbaren Protein-Produkt gekoppelt. Als ein Reporter-Transgen in einen Wirtsorganismus eingesetzt ist, wird die CRE die Aktivität sichtbar in Form der kodierten Reporter-Protein. P-Element vermittelte Transgenese in der Fruchtfliege Drosophila Arten (D.) melanogaster ⁷ hat seit Jahrzehnten verwendet werden, um Reporter Transgene in diesem Modell Organismus einbringen, obwohl die genomische Anordnung der Transgene ist zufällig. Daher ist Reportergen-Aktivität stark von der lokalen Chromatinstruktur und Gen-Umwelt beeinflusst, die Begrenzung CRE Vergleiche werden qualitative. In den letzten Jahren wurde die phiC31 basierte Integration System für den Einsatz in D. melanogaster angepasst Transgene in spezifischen Genom Landeplätze ^8-10 einfügen. Diese Fähigkeit hat die quantitative Messung der Gen hergestellt und hier relevant, CRE-Aktivität ^11-13 feasible. Die Herstellung von transgenen Fruchtfliegen ausgelagert werden können, einschließlich phiC31-basierte Integration, wodurch die Notwendigkeit für teure Ausrüstung zu kaufen und / oder Kenntnisse in spezialisierten Transgen Injektion Protokolle.

Hier präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur quantitativen Auswertung eines CRE Tätigkeit und zeigen, wie dieser Ansatz verwendet werden, um die Auswirkungen einer Einführung Mutation auf einem CRE Tätigkeit zu messen und die Aktivitäten der orthologen CREs vergleichen. Obwohl die Beispiele für eine CRE aktiv sind während der Fruchtfliege Metamorphose, kann der Ansatz auf andere Entwicklungsstadien, Fruchtfliege Arten oder Modell-Organismen angewandt werden. Letztlich sollte eine breitere Anwendung dieser Methode zu untersuchen CREs Voraus ein Verständnis der regulatorischen Logik und wie Logik kann variieren und sich entwickeln.

Übersicht:

Dieses Video zeigt ein Protokoll der Lage, quantitative Messung der Gen-regulatorischen Aktivitäten für cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen in Drosophila (D.) melanogaster. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die regulatorischen Aktivitäten besessen von zu vergleichen: Wildtyp und Mutante CRE Formen, natürlich vorkommende CRE Allele innerhalb einer Art oder orthologen CREs zwischen auseinander Arten gefunden.

1. Site-spezifische Integration von Reporter Transgene in der Drosophila melanogaster Genom

A. Reporter-Transgen Bau

1. In einem ersten Schritt, bewertet jede CRE müssen separat in ein Reporter-Vektor, dass eine (1) attB bakterielle Anheftungsstelle Sequenz für die ortsspezifische Transgen-Integration ^8-11 verwendet, (2) multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von einem (3) enthält geklont werden heterologen Promotor, die von der (4) kodierende Sequenz für ein fluoreszierendes folgtProtein (z. B. EGFP oder DsRed).
2. Während jeder Vektor kann kompatibel gemacht werden für phiC31 vermittelte ortsspezifische Integration durch die Einführung eines attB Sequenz in den Vektor-Backbone, der Vektor pS3aG12-14 aus dem addgene Plasmid-Repository erhalten werden kann (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG ist eine angepasste Version der P-basierte Transformation vector15, in denen einer der beiden Zigeuner Isolatoren durch eine SFIB Isolator ersetzt wurde, enthält es eine erweiterte multiple Klonierungsstelle, und besitzt ein 250 Basenpaar-Sequenz, die eine attB Anheftungsstelle. CREs von Interesse sind, in die multiple Klonierungsstelle stromaufwärts eines minimalen hsp70-Promotor und dem EGFP-Gen, das eine erweiterte Version des Green Fluorescent Protein, das in den Zellkern lokalisiert kodiert eingefügt.

B. Site-spezifische Integration von Reporter Transgene

1. Für eine Reihe von Cres, deren Aktivitäten zu vergleichend als ein Teil der Reporter-Transgen-Vektoren sind die Vektoren erstellt separat in die gleiche genomische Landeplatz integriert. Hier werden die phiC31 Phagen-Integrase-Protein katalysiert die unidirektionale Rekombination zwischen dem bakteriellen (attB) Anheftungsstelle in das Transgen Vektor und eine genomisch befindet Phagen (attP) Anheftungsstelle ^9. Mehrere Gruppen ^8-11 haben eine Vielzahl von transgenen Linien, die eine attP site (sog. Landeplätze) umfassen und enthalten eine genomische Quelle ⁸ von phiC31, dass dieses Protein exprimiert in den Keimzellen gemacht. Diese fliegen Aktien können leicht erhalten von der Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
2. Eine veröffentlichte Protokoll existiert Details zum Erstellen transgener Drosophila ortsspezifisch mit phiC31 Integrase ^16. Die Ausrüstung und technisches Know-how, um transgene Drosophila li machennes ist nicht mehr erforderlich, da mehrere Anbieter (Tabelle 1), für die diese Dienstleistung ausgelagert werden können existieren.
3. Transgene Verhalten kann stark variieren von Gewebe zu Gewebe die nächsten ^11. Somit kann ein einzelner attP Landeplatz ist nicht optimal für die Analyse aller Cres, Entwicklungsstadien und / oder Gewebe zu studieren. Es ist ratsam, die Aktivität eines CRE von Interesse in verschiedenen Landeplätze zu bewerten, um eine Website, wo die CRE Tätigkeit steht stellvertretend für die endogenen Zielgens (s) Expressionsmuster zu finden.
4. Für erhalten transgenen Linien ist es ratsam, damit sie homozygot für das Transgen. CRE-Aktivität ist in der Regel robuster bei Personen mit zwei Kopien des Transgens und für quantitative Messungen ist es wichtig, dass Vergleiche zwischen Personen mit der gleichen Anzahl von Transgen Kopien gemacht werden. Homozygote Individuen können durch den Einsatz von Balancer-Chromosomen erhalten. Für gut charakterisiert Landeplätze ist es aber oft simpler zu sammeln Jungfrau Männchen und Weibchen, und überqueren Sie die mit der intensiveren Augenfarbe Phänotyp durch die Mini-white-Gen (Abb. 1), die weißen Mutanten Rettung durch den integrierten Transgen-Vektor zur Verfügung gestellt noch dramatischer in Individuen mit zwei Vektor-übertragenen Kopien.

2. Beziehen Proben oder Geweben der entsprechenden Entwicklungsstufe

Erhalten Proben zur Analyse an die Zeit in Entwicklung, wenn der Genexpressionsmuster (s) of Interest (s) endogen, also die Zeit, als die CRE unter Untersuchung sollte die Expression des Reportergens aktiviert auftreten. Für Drosophila, können dies entweder embryonale, Larven, Puppen oder adulte Stadien werden. Nachfolgend beschreiben wir eine Methode, um Erwachsenen und metamorphen fliegt Bühne, von denen die letztere stattfindet innerhalb der Puparium, eine harte Larvenhaut, dass der immobile Probe enthält, bis es als Erwachsener schlüpft.

1. Expand transgenen Linien zu gewährleisten Specimens der richtigen Bühne stehen, wenn Sie bereit, um die Expression des Reportergens durch konfokale Mikroskopie analysiert. Richten Sie zwei Fläschchen mit jeweils mehreren (~ 5 bis 10) männliche und weibliche Fliegen. Auf abwechselnden Tagen bump die Fliegen aus einer der Flaschen auf eine unbenutzte Flasche. Wiederholen Sie dies für eine Woche. Bis zum Ende des zwei Wochen werden transgene Fruchtfliegen werden verfügbar, die von Larven zu erwachsenen Entwicklungsstadien.
2. Staging erwachsenen Fliegen: Die Dauer der Zeit in einem Puparium ausgegeben wird 98 Stunden bei Frauen und 102 Stunden für Männer, wenn bei 25 ° C gehalten Adult fliegt einfach gesammelt werden, wenn sie aus dem Puparium (genannt eclosion) entstehen. Dieser Zeitpunkt kann als 0 Stunden post Schlüpfen werden. Adult Fliegen können, bis der gewünschte Zeitpunkt für die Analyse aufgezogen werden. Zum Beispiel, eine so genannte CRE mel-oe1, dass die Kontrollen Ausdruck der desatF Gen in der erwachsenen oenocytes von D. melanogaster Weibchen nicht sofort nach eclosion aber CRE Aktivität swi aktivtches auf nach einem Tag ^14. Wenn der richtige Zeitpunkt erreicht ist, betäuben Fliegen und in einem Tropfen Halocarbonöl auf einer Folie zu situieren und fahren Sie mit der konfokalen Auswertung.
3. Staging Proben während der Metamorphose: Am Ende des dritten Stadiums Larvenstadium die Puppenhülle gebildet wird. Obwohl zu diesem Zeitpunkt das Tier technisch noch eine dritte Larvenstadium Larve, diese Entwicklungsstufe leicht erkennbar ist, wie die Probe nicht-mobile ist die Puparium weich und weiß und die Luftlöcher haben umgestülpt (Abb. 2A). Dieser Zeitpunkt kann 0 Stunden nach Puparium Formation (hAPF) berücksichtigt werden. In diesem Stadium können Männer von Frauen durch die Anwesenheit von bilateral gelegenen Keimdrüsen in der Nähe der Mitte des Körpers, die als durchscheinende Kreise erscheinen unterschieden werden (boxed in Abb.. 2A und durch schwarze Pfeil in 2A ").

1. Staging auf der Basis Länge der Metamorphose:

Bei 0 hAPF können Proben in ein frisches Gefäß überführt werdenoder eine Petrischale mit einem feuchten Pinsel. Um Proben vor dem Austrocknen, fügen Sie ein Stück Kimwipe und befeuchten mit Wasser. Transfer-Fläschchen oder Spiegel auf eine 25 ° C Inkubator bis die gewünschte hAPF.

2. Inszenierung von sichtbaren morphologischen Merkmale:

Es ist oft unbequem zu Proben für die CRE-Aktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Sammlung von 0 hAPF Proben zu analysieren. Alternativ kann man identifizieren, richtig inszeniert Proben gleichzeitig bequem für die Analyse auf der Grundlage der Anwesenheit und Position von mehreren morphologischen Marker (siehe unten), die sichtbar durch die Puparium oder nach Puparium Entfernung (Abb. 2).

2a. Morphologischen Kriterien zur Annäherung metamorphen Bühne:

• 0 hAPF: White Vorpuppe Bühne, wo Larve nicht mehr bewegt; vorderen Stigmen umgestülpt (Pfeil in Abb. 2A.); Seitlichen Trachea sichtbar; weichen, weißen Puparium (Abb. 2A).
• ~ 14 hAPF:Puparium gegerbt und gehärtet, Kopf sac umgestülpt; seitliche Luftröhre und Gonaden weniger ausgeprägt; Beine und Flügel voll auf Bauch verlängert; Malpighischen Gefäßen noch keine herausragende Rolle und grün (gestrichelte boxed Region in Abb. 2B.) Augen sind unpigmentiert (Abb. 2B) .
• ~ 25 hAPF: Zwei parallel Malpighischen prominenten und in der Farbe grün (gestrichelte boxed Region in Abb. 2C.).
• ~ 40 hAPF: Dunkelgrün Gelb Körper zwischen den vorderen Enden der Malpighischen Gefäße (rot Pfeilspitze in Abb. 2D). Positioniert.
• ~ 50 hAPF: Yellow Körper in den Mittelpunkt der Malpighischen Gefäße (. Boxed Region in Abb. 2E und vergrößert in 2E'') und den Augen positioniert sind bernsteinfarben, wenn Wildtyp für weiße Gen (benötigt für Rote-Augen-Farbe) . Die Augenfarbe ist in diesem Stadium fehlt, wenn die weiße Mutantenphänotyps durch die Mini-white-Gen, das ein Teil des integrierten Reporter-Transgen-Vektor (Abb. 2E ") ist gerettet.
• ~ 70 hAPF:, (. boxed Region in Abb. 2F boxed und vergrößert 2F'') Dorsal Thorax microchaetae und macrochaetae sichtbar (Abb. 2F, Pfeil) Gelbkörper am hinteren Ende des Malpighischen Gefäßen positioniert; Augenfarbe ist blass rosa, wenn sie von den Mini-white-Gen (Abb. 2F) gerettet.
• ~ 80 hAPF: Flügelspitzen grau; Malpighischen Gefäßen zwischen vorderen auf den Mittelpunkt des Bauches (. Boxed Region in Abb. 2G und vergrößert in den 2G ") befindet, Falten zwischen Abdominalsegmente und Borsten auf der Bauch-Tergite sichtbar sind (Abb. 2G-und 2G ") und rettete die Augenfarbe ist leuchtend rot (Abb. 2G).
• ~ 90 hAPF: Wings abgedunkelten bis schwarz; Malpighischen Gefäße und gelben Körper durch Gerben von tergites verdeckt; Thorax (Pfeil) und Bauch-Borsten sind reif und dunkel (Abb. 2H); und grün Mekonium erscheint am dorsalen hinteren Spitze des Abdomen ( Abb.. 2H'').

Notes:

1. An late Stadien der Metamorphose, kann das Geschlecht der Proben durch Genitalmorphologie (Pfeilspitzen in Abb.. 2i und 2j) oder das Vorhandensein von dunkler sex Kämme auf den ersten Satz von männlichen Beinen bestimmt werden.
2. Weitere Präzision in der Inszenierung kann durch Berücksichtigung von zusätzlichen morphologischen Marker wie zuvor beschrieben ¹⁷ erreicht werden.

D. Schritte zur Probe aus Puparium zu entfernen:

1. Mit Labor-Band halten ein Stück Klebeband auf eine Dissektion Board mit der klebrigen Oberfläche nach oben zeigt.
2. Wet einem Pinsel und gelten Feuchtigkeit pupariated Proben. Mit einem Pinsel, Transfer Proben zu einem Kimwipe.
3. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel, Transfer Proben das Klebeband und halten uns mit dem Rücken nach oben weisend (gebogene Seite des Puparium).
4. Lassen Sie Proben für ca. 15 Minuten trocknen lassen. Dry Puparium sind viel leichter zu öffnen als jene, die feucht sind. An dieser Stelle Proben können grob inszeniert werden durch morphologischeMarker sichtbar durch die Puppenhülle.
5. Mit einer Pinzette, schrittweise Öffnung des Puparium Anfang an der vorderen Operculum und dann in Richtung des hinteren Endes. Wenn ein feiner Skala Dissektion wird benötigt, um ein bestimmtes Gewebe zu isolieren kann dies in einem Uhrglas mit PBS-Lösung durchgeführt werden. Ansonsten Transfer Puppen zu einem Rückgang von viskosen HC700 Halocarbonöl (Sigma-Aldrich) auf einen Objektträger.
6. Situate Proben auf einer Folie, mit einem Stereomikroskop und Verwendung der oben beschriebenen Kriterien (§ 2a) ein Exemplar der Bühne ermittelt werden kann ..

3. Konfokale mikroskopische Auswertung der Reportergen-Expression in einem ganzen Berg Probe

1. Für ganze Berg Proben, verwenden Sie entweder den 4X oder 10X Ziele. Mit Fluoreszenz durch Quecksilber Exposition stimuliert, oder alternativ, indem Sie in Hellfeld, passen Sie die Mikroskoptisch zu positionieren Probe in das optische Feld dann bringen Probe in den Fokus.
2. Mit der konfokalen Mikroskopiepe-Software, stellen Sie die Anregungswellenlänge für EGFP (oder einer geeigneten Wellenlänge bei Verwendung eines anderen fluoreszierendes Protein).
3. Um zu verhindern, Bleichen einer Probe mit einem Laser-Intensität von 5-10% zu beginnen. Wenn das Signal ist enttäuschend, dann erhöhen Sie die Intensität je nach Bedarf.
4. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern für die konfokale Bilder, damit Software-Einstellungen, dass die durchschnittlichen Pixel Messungen replizieren Scans, wie Kalman Mittelung oder Linien-und Stapel Mittelung. Nach unserer Erfahrung Kalman durchschnittlich drei Scans verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, ohne dass die Zeit für die Bild-Sammlung zu lang.
5. Für quantitative Vergleiche von CRE-Aktivität ist es wichtig, dass die Fluoreszenz-Intensität für eine Probe hat nicht viele Pixel gesättigt. Mit einem z-Bereich, wo Fluoreszenz erscheint am intensivsten, passen Sie die Einstellungen so, dass nur wenige Pixel gesättigt sind. Dies kann durch die Umstellung auf eine Sättigung-Warnung Lookup-Tabelle und die Anpassung der Kanal Spannung, Verstärkung durchgeführt werden, und Offset, um die Einstellungen, wo nur wenige Pixel gesättigt sind. Schließlich, um ein ausreichendes Signal aus einer Probe zu sammeln, ist es oft notwendig, um die konfokale Blende einstellen.
6. Sobald die optimalen Einstellungen ermittelt werden, führen Sie die z-Scan.
7. Wenn der Scan abgeschlossen ist konvertieren Sie das Bild Stapel in einer Projektion, und speichern Sie das Bild in der Tagged Image File Format oder "TIFF".

Hinweis:

1. Es ist wichtig, den gleichen konfokalen Einstellungen für alle replizieren Proben und Reporter-Transgen Linien, die in einen quantitativen Vergleich von CRE-Aktivitäten einbezogen werden verwenden.

4. Die Quantifizierung der cis-regulatorisches Element Aktivität

Während einige konfokale Akquisition Software ermöglicht die weitere Verarbeitung der Projektionsbilder, bevorzugen wir die frei verfügbaren Image J Software-Programm verwenden, um zu bewerten konfokalen Bildern ^18. Mit Bild-J ¹⁸ aufgezeichnet GFP-Expression Patternskann als Pixelwert Statistik innerhalb eines bestimmten Gebietes quantifiziert werden. Obwohl die Bilder nicht tun müssen, um in Graustufen werden wir es vorziehen, dies zu tun.

1. Mit dem Image J-Programm gestartet, öffnen Sie ein TIFF-Bild ausgewertet werden.
2. Klicken Sie auf das Freihand-Auswahl-Taste und einen Überblick über die Fläche der Probe, wo Quantifizierung gewünscht ist, zum Beispiel die Region in Abbildung 3 innerhalb der gestrichelten gelben Rand. (Siehe Anmerkung A unten bei der Auswahl eines Gebietes zu quantifizieren.)
3. Um einen Pixelwert Statistik, auf der Registerkarte Analysieren und wählen Sie dann messen. Ein Ergebnis-Fenster wird angezeigt, welche die Gegend, und die mittlere, minimale und maximale Pixelwert Partituren. Werden die Mittelwerte Pixelwert Partitur und wiederholen Pixelwert Statistik für replizieren Proben zu generieren (siehe Anmerkung b zu replizieren-Nummer).
4. Wir empfehlen das Sammeln einer zweiten mittleren Pixelwert von einem Kontrollraum Region, wo die CRE ist nicht aktiv, zum Beispiel die Region in Abbildung 3 innerhalb der gestrichelten roten Rand. Letzteres value können aus den ehemaligen Wert abgezogen werden, um Hintergrund-Effekte aus der Bewertung zu entfernen, um eine angepasste mittlere Pixelwert erhalten. In unserer Erfahrung weiter reduziert Unterschiede zwischen den Proben zu replizieren (siehe Anmerkung c in Bezug auf Größe Auswahl für die Kontrolle Region).
5. Verwenden Sie die adjustierte mittlere Pixelwerte replizieren Exemplare der durchschnittlichen regulatorischen Aktivitäten für einen CRE und die Standard-Fehlermeldung des Mittelwertes zu berechnen. Diese regulierende Wirkung Wert und die Messung der Fehler auch auf andere Reporter Transgene, wo die CRE-Sequenz unterscheidet (z. B. Abbildung 3) verglichen werden.

Notes:

1. Image J ermöglicht es dem Benutzer, eine definierte Form und Fläche, aus denen eine mittlere Pixelwert Score ermittelt werden wählen. Doch wie Probengröße variiert oft wir es vorziehen, die Freehand Auswahl-Werkzeug verwenden, um den Bereich für jede Probe ausgewertet werden sollen.
2. Eine größere Anzahl von Wiederholungen (N) ergibt sich eine bessere Abschätzung der mittleren regelregulatorischen Wirkung für eine gegebene CRE. Wir finden, dass ein N zwischen 4 und 8 in der Regel ausreichend ist.
3. Nach unserer Erfahrung die Größe der Regelzone ausgewählt hat wenig auf die gemessene mittlere Pixelwert für den Steuerbereich betreffen. In der Regel wählen wir eine Fläche proportional in der Größe der Fläche von Interesse.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Wildtyp-Version eines D. melanogaster CRE, die so genannte Dimorphic Element ^13, fährt ein hohes Maß an EGFP Reporter Ausdruck in der A6 Abdominalsegment der weiblichen Puppen (Abb. 3A). A 13-Basenpaar-Sequenz innerhalb dieses Element gefunden wurde, um eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor DSX werden, und die in vivo Bedeutung dieser Sequenz kann durch Quantifizierung der regulatorischen Aktivität für diese CRE, wenn diese Bindungsstelle mutiert ist nachgewiesen werden. Angesichts der regulatorischen Aktivität des Wildtyp Dimorphic Element auf 100 ± 5%, Mutation dieses DSX Ort reduziert die regtorische Aktivität auf 28 ± 3%. Ähnliche Vergleiche können bei der Regulierung für intraspezifische CRE Allele oder zwischen orthologen CREs aus getrennten Arten durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn man die Ebenen des EGFP in weiblichen Segment A6 von der D. angetrieben melanogaster Canton S-Stamm als eine regulatorische Aktivität von 100 ± 4%, orthologen CREs für die Arten D. simulans und D. willistoni gefunden zu besitzen jeweils regulatorischen Aktivitäten in Höhe von 75 ± 4% und 0 ± 0% (Abb. 3B).

Abbildung 1. Mit der Intensität der white-Rettung Auge Phänotyp zu machen transgenen Linien homozygot. Um quantitativ zu bewerten Reporter Transgene ist es wichtig, dass jede Probe die gleiche Reporter-Transgen-Genotyp haben. (A) Ein weißes Gen-Mutante genetischen Hintergrund mit einer attP Landeplatz Sequenz ist für Website-s genutzt PEZIFISCHE Transgen-Integration. Transgene Personen (B) hemizygot und (C) homozygot für den integrierten Vektor kann in der Regel durch die Intensität der geretteten Augenfarbe Phänotyp durch die Anzahl der Kopien des integrierten Mini-weiße Gen unterschieden werden. Homozygote Linien können durch Kreuzung (C) männliche und weibliche Fliegen mit dem dunkelsten Augenfarbe Phänotyp festgestellt werden.

Abbildung 2. Mit morphologische Marker auf die metamorphen Bühne für Drosophila zu bestimmen. Während der Metamorphose von einer Larve eine erwachsene Fliege, die Probe Übergänge durch eine Reihe von stereotypen Morphologien, die verwendet werden, um das Geschlecht und die ungefähre Entwicklungsstadium bestimmen kann. Die Proben in BH wurden aus ihren Puparium entfernt worden. Boxen in Platten A, E, F, G und H geben die gezoomt in Regionen bzw. für Platten A ", E", F ", G" und H ".

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Abbildung 3. Quantitativer Vergleich von cis-regulatorisches Element Aktivitäten. Für alle Proben EGFP-Reporter-Gen-Expression durch ein bestimmtes Element Dimorphic vermittelt wurde bei Frauen bei 80 Stunden nach Puparium Bildung beurteilt. Die Zahl am oberen Rand eines jeden Bildes ist die EGFP-Expression für die Probe, die als die mittlere Pixelwert für die A6 Abdominalsegment (angegeben für die obere linke meisten Bild als der Bereich innerhalb der gestrichelten gelben Rand) minus dem Mittelwert berechnet wird Pixelwert für die A4-Segment (Hintergrund-Korrektur; angegeben für die obere linke meisten Bild als der Bereich innerhalb des gestrichelten roten Rand). Für jede Reporter-Transgen vier Wiederholungen wurden bewertet, um eine mittlere Segment A6 Pixel zu berechnen. Regulatory Aktivität wird als% des (A) Wildtyp-oder (B) Canton S-Stamm weiblichen bedeuten Pixelwert ± SEM angegeben. (A) GFP-Expression bei den Frauen besitzen ein Wildtyp-Allel desDimorphic Element und einer mutierten Version, in der eine einzelne Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor DSX wurde abgetragen. Diese Mutante Bindungsstelle reduzierte Dimorphic Element Aktivität auf 28 ± 3% der Wildtyp-Sequenz. (B) Vergleich der regulatorischen Aktivitäten für Sequenzen orthologen der D. melanogaster (Canton S-Stamm) Dimorphic Element. In Anbetracht der GFP-Expression vermittelt durch ein D. melanogaster Dimorphic Element Allel als 100%, die orthologen Sequenzen aus dem verwandten Arten D. simulans und D. willistoni besitzen jeweils Aktivitäten von 75 ± 4% und 0 ± 0%.

6. Materialien

cis-regulatorische Elemente kodieren die genomische Programm, das Genexpressionsmuster und damit den Prozess der Entwicklung ¹ gibt, und sind prominente Standorte für beide Mutationen zugrunde liegende morphologische Evolution ^2-4 und phänotypischen Variation für menschliche Züge ^5,6,19. Trotz dieser großen Bedeutung sind die regulatorischen Logik für CREs wenig verstanden. Ein prominentes Grund dafür Verständnis Defizit ist der Mangel an geeigneten Methoden, um quantitativ zu vergleichen Funktionsabläufe CREs worden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll, das auf eine verbesserte Transgenese Methoden für D. melanogaster zu einer quantitativen Aspekt der Studie von Cres add profitiert.

Nach unserer Erfahrung bei der Quantifizierung einer CRE regulatorische Aktivität ist eine Variation zwischen replizieren Proben von 10% oder weniger der adjustierte mittlere Pixelwert, wenn repliziert (1) aus dem gleichen Entwicklungsstand sind und (2) der Reporter Transgenin der gleichen genomischen Landeplatz. Dieser Grad der Abweichung steht im Einklang mit, dass für die CREs in Abbildung 3 dargestellt bestimmt und stellt eine Beschränkung der Verwendung dieser Methode zur quantitativen Situationen, in denen genetisch verschiedene Versionen eines CRE unterscheiden sich regulatorische Aktivität um einen Wert größer als 10%. Wichtig ist jedoch, diese Einschränkung eine deutliche Verbesserung gegenüber den qualitativen Beschreibungen von "reduziert" oder "erhöht", dass die Studierenden CREs zuvor zu verwenden bei der Beschreibung unterschiedlicher Aktivität.

Wenn Versionen eines CRE bekannt sind oder gefunden, quantitativ in ihrer regulatorischen Aktivitäten unterscheiden, macht dieses Protokoll möglich ist zu bestimmen, welche der Mutations-Unterschiede sind dafür verantwortlich, oder dazu beitragen, die Aktivität Unterschied ^12,13. Die Fähigkeit, diese funktionell relevante Mutationen zu identifizieren ist ein notwendiger erster Schritt, um die molekularen Mechanismen, wie der Gewinn oder Verlust von transcri bestimmenption-Bindungsstellen, was CRE-Aktivitäten zu unterscheiden. Wir freuen uns, sollte die Verwendung dieses Protokolls für andere Drosophila Cres und die Anwendung ähnlicher Methoden in Protokollen für andere Modellorganismen für ein besseres Verständnis der CRE Logik entstehen können. Dies beinhaltet die Fähigkeit, funktionell relevante Mutationen CRE aus dem Morast funktionell-neutrale Mutationen zu unterscheiden.

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir danken: Nicolas Gompel und Benjamin Prud'homme für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls; Melissa Williams und vier anonymen Gutachtern für Anmerkungen zum Manuskript; der University of Dayton Graduiertenschule für Forschungsstipendien an WAR, und der University of Dayton Biology Department und Research Institute (UDRI) für Forschungs-Unterstützung für TMW. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Stipendium 11BGIA7280000 zu TMW unterstützt.